Name: Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj budowę mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się swobodnie. Ta metoda umożliwia rejestrację aktywności pojedynczych neuronów i populacji neuronalnych z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Danielowi Carpi za jego pomoc i wczesny wkład w ten projekt. Dziękujemy również Lucrecii Novoa za jej pomoc w tworzeniu grafiki i obrazów. Praca ta była wspierana przez grant programu NIH/NIAID 5P01AI073693-03.

1. Produkcja tetrody
<ol>
	<li>Zacznij od użycia izolowanego drutu platynowo-irydowego o średnicy 12,5 μm (0,0005") firmy California Fine Wire. Długość drutu należy przyciąć na długość odpowiednią do docelowej konstrukcji. Na przykład przytnij drut do długości co najmniej 30 cm, aby celować w subiculum grzbietowe lub hipokamp.</li>
	<li>Złóż drut na środku tak, aby były dwa równoległe druty o długości 15 cm. Ułóż środkowy punkt tego drutu na poziomym ramieniu, aby utworzyć cztery równoległe druty o długości 7.5 cm. Następnie przymocuj pokryty gumą klips w pobliżu dolnej części udrapowanego drutu, tworząc wiązkę czterech drutów.</li>
	<li>Umieść gumowy klips w zmotoryzowanym przędzarce tetrodowym, upewniając się, że drut jest napięty, ale nie jest zbyt napięty ani nie ma ciężaru, ponieważ pęknie podczas wirowania.</li>
	<li>Przełącz kołpak tetrody w tryb "ręczny" i przesuń joystick w "prawo", aby obrócić drut w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Przędzarka będzie się obracać z częstotliwością około 2 Hz, tworząc ciasną wiązkę czterech drutów, które utworzą tetrodę.</li>
	<li>Wykonaj 80 obrotów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie zatrzymaj się, naciskając "W górę" na joysticku. Spowoduje to zatrzymanie zmotoryzowanego błysla. Następnie wykonaj 20 obrotów w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara ("w lewo"), aby zwolnić napięcie tetrody. Ostateczna liczba obrotów na długość drutu powinna wynosić 8 obrotów na mikron.</li>
	<li>Użyj pistoletu grzewczego na dolnym ustawieniu 1, które osiąga maksymalnie 400 stopni, aby połączyć ze sobą druty poprzez stopienie powłoki wiążącej VG. Trzymaj opalarkę ~2 cm od drutu i przesuwaj pistolet w górę iw dół po prostej długości drutu przez około 5 sekund pod kilkoma różnymi kątami. Upewnij się, że stale zamiatasz opalarkę i nie trzymasz jej w jednym miejscu, ponieważ spowoduje to stopienie izolacji HML i spowoduje, że przewody połączą się ze sobą w wiązce.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w górnej części tetrody (w pobliżu ramienia poziomego), a następnie zwolnij tetrodę z klipsa na dole. Przetnij pojedynczą pętlę tak, aby na jednym końcu tetrody znajdowały się cztery oddzielne przewody, przewody te zostaną elektrycznie połączone ze złotymi pinami lub płytką drukowaną w późniejszym kroku.</li>
	<li>Umieść gotową tetrodę w bezpyłowym pudełku do przechowywania do czasu zakończenia jazdy.</li>
</ol>
2. Niestandardowy zestaw mikronapędu
<ol>
	<li>Najpierw zbuduj podstawę, która będzie trzymać napędy microdrive. Podstawa wszczepionego mikronapędu jest na ogół najbardziej stabilna, jeśli jest zabezpieczona i umieszczona wzdłuż linii środkowej czaszki. Protokół ten opisuje kroki budowania podstawy z pojedynczym mikronapędem do przechowywania czterech nośników rur poliamidowych. W razie potrzeby można łatwo dodać dodatkowe mikronapędy i lampy.</li>
	<li>Zacznij od około 20 mm kwadratowego kawałka akrylu z pleksi (o grubości 5 mm) i przeszlifuj akryl do kształtu, który pozwoli myszy swobodnie poruszać się wraz z dyskiem po jego wszczepieniu na głowę.</li>
	<li>Następnie zmontuj jednostkę napędową. Użyj niestandardowych mosiężnych prowadnic 3,3 x 6,3 mm, które będą przenosić napędową. Najpierw ze sobą prostopadłe dwie mosiężne prowadnice. Pionowa mosiężna prowadnica utrzyma napędową i elektrody, podczas gdy poziomy element zostanie przyklejony do akrylowej podstawy.</li>
	<li>Po zlutowaniu ze sobą mosiężnych elementów rozpocznij montaż samego napędu, przekładając mosiężną z walcowym przez górną część prowadnicy i do plastikowego bloku Delrin. Kwadratowy blok jest tak skonstruowany, że otwór gwintu jest lekko przesunięty o środek (o 0,2 mm), co powoduje, że jedna powierzchnia bloku bardzo lekko wystaje z prowadnicy. Jest to strona, po której będą znajdować się rurki poliamidowe przenoszące elektrody.</li>
	<li>Trzymając blok Delrin wewnątrz prowadnicy i do końca, nakręć mosiężną nakrętkę sześciokątną, aż nakrętka prawie dotknie dolnej części prowadnicy. Nie dokręcaj nakrętki do końca; Zamiast tego rozpuść niewielką ilość lutu na końcu, aby połączyć nakrętkę i, uważając, aby nie niczego do prowadnicy. Teraz obracanie powinno przesunąć blok Delrin w górę (zgodnie z ruchem wskazówek zegara) i w dół (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) w pionie wzdłuż gwintu. Odetnij gwint, który wystaje poza przylutowaną nakrętkę.</li>
	<li>Po zmontowaniu napędu wróć do akrylowej podstawy i wytnij szczelinę o szerokości 3 mm, w której będzie znajdował się napęd elektrod. Przełóż poziomą mosiężną prowadnicę przez szczelinę, a następnie użyj kleju krioanoakrylowego, aby przymocować element do podstawy.</li>
	<li>Umieść akrylową podstawę w imadle, aby zabezpieczyć ją na miejscu. Umieść płytkę interfejsu elektronicznego (EIB) na górze podstawy i zaznacz położenie dwóch otworów na. EIB to mikroprocesory, które zapewniają połączenie sygnałowe między przewodami elektrod a przedwzmacniaczem. Za pomocą wiertła z końcówką 1,5 mm ostrożnie wywierć otwory w miejscach na, które utrzymają EIB na miejscu na górze podstawy. Umieść EIB i wkręć dwie mosiężne w otwory.</li>
	<li>Użyj mikronożyczek preparacyjnych, aby przeciąć cztery kawałki rurki poliamidowej o długości 7 mm. Ułóż cztery probówki obok siebie na kawałku złożonej taśmy laboratoryjnej. Nałóż cyjanoakrylan na środek, aby połączyć je ze sobą, ale uważaj, aby nie dostać kleju do samych rurek. Pozostaw połączone rurki do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Obróć podstawę dysku o 90 stopni, tak aby układ EIB był pionowy, a dysk był ustawiony poziomo z wystającym blokiem Delrin skierowanym do góry. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, ostrożnie nanieś niewielką ilość cyjanoakrylanu na powierzchnię Delrin, a następnie umieść cztery połączone rurki na kleju. Poczekaj, aż klej całkowicie stwardnieje przed próbą przeniesienia dysku.</li>
	<li>Sprawdź, czy rurki poliamidowe są bezpiecznie przymocowane i czy cały zespół porusza się płynnie, nie dotykając prowadnicy ani nie napotykając żadnego oporu.</li>
	<li>Następnie przygotuj uziemiającą i podłącz przewód uziemiający do EIB. Wykonaj uziemiającą, biorąc mosiężną (3/32") i szlifując gwinty, aż pozostaną tylko 1-2 gwinty. Powinno to być ~1 mm, ponieważ ta śruba będzie osadzona w czaszce i nie jest przeznaczona do penetracji tkanki mózgowej.</li>
	<li>Wytnij drut miedziany o długości 30 mm (dokładna długość będzie zależeć od tego, w którym miejscu czaszki umieścić ziemię dla zwierząt). Drut miedziany powinien mieć średnicę 100 - 500 μM (0,004-0,02"), co odpowiada w przybliżeniu drutowi od 38 AWG do 24 AWG. Nałóż topnik lutowniczy na oba końce drutu miedzianego. Z jednej strony uziemiającą do przewodu. Na drugim końcu złoty pin EIB. Ten przewód uziemiający można odłożyć na bok i podłączyć do EIB później podczas operacji implantacji.</li>
	<li>Następnym krokiem jest przeprowadzenie elektrod przez rurki poliamidowe i podłączenie ich do otworów kanałowych w chipie EIB. Przekręć napędową całkowicie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, tak aby rurki znalazły się w górnej pozycji.</li>
	<li>W przypadku pojedynczych elektrod należy przeciąć drut Stableohm 50 μM o długości 50 mm i przeciągnąć go przez jedną rurkę poliamidową, pozwalając mu wysunąć się co najmniej 2,0 mm poza koniec rurki (do celowania w subiculum lub hipokamp). Nałóż niewielką kroplę cyjanoakrylanu na górną część rurki, przymocowując drut do rurki i zapobiegając ruchom drutu. Następnie podłącz luźny koniec przewodu do otworu kanału EIB za pomocą złotego kołka. Odetnij nadmiar drutu cienkimi nożyczkami. Powtórz dla innych mikroelektrod.</li>
	<li>Aby podłączyć tetrody, wyjmij jedną ukończoną tetrodę z pudełka do przechowywania. Przeprowadź stopiony koniec tetrody przez jedną rurkę poliamidową i pozwól jej wystawać co najmniej 2.0 mm poza koniec rurki (dla subiculum lub hipokampa). Nałóż niewielką kroplę cyjanoakrylanu na górę tuby, przymocowując tetrodę do rurki i zapobiegając wszelkim ruchom. Weź cztery luźne przewody na drugim końcu tetrody i podłącz każdy przewód do otworu kanału EIB za pomocą złotego kołka. Odetnij nadmiar drutu. Powtórz dla pozostałych tetrod.</li>
</ol>
3. Montaż VersaDrive
<ol>
	<li>Rozpocznij budowę czterotetrodowego VersaDrive, który składa się z podstawy, obudowy i elementów nasadki.</li>
	<li>Przytnij jedną rurkę poliamidową na 10 mm i przeprowadź ją przez najmniejszy otwór w nośniku tetrody. Pozwól, aby rurka wystawała poza nośnik bardzo nieznacznie (0.5 mm). Użyj 5-minutowej żywicy epoksydowej, aby przykleić rurkę poliamidową na miejscu, uważając, aby żywica epoksydowa nie dostała się do samej tuby. Powtórz to dla trzech innych probówek i nośników.</li>
	<li>Po całkowitym związaniu żywicy epoksydowej przeprowadź każdą rurkę poliamidową przez jeden z czterech otworów w podstawie VersaDrive. Gdy wszystkie cztery rurki znajdą się w swoich otworach, wepchnij szpilkę do owadów przez zewnętrzny otwór; Utrzyma to nośnik tetrody w linii i posłuży jako szyna, po której przewoźnik będzie mógł się poruszać. Powtórz tę czynność dla trzech pozostałych przewoźników.</li>
	<li>Weź nasadkę i wyrównaj ją z czterema szpilkami przeciw owadom, tak aby nasadka zakrywała podstawę, a nosiciele tetrody znajdowali się w nasadce. Przekręć maszynową 1 mm x 5 mm przez odpowiedni otwór w nasadce i do nośnika tetrody. Będzie to śruba napędowa do przesuwania nośnika w górę iw dół. Powtórz to dla pozostałych trzech.</li>
	<li>Przekręć wszystkie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż nośniki tetrody znajdą się w górnym położeniu, a rurki poliamidowe będą widoczne przez otwór nasadki. Za pomocą cienkich nożyczek do mikropreparowania odetnij rurkę tuż poniżej (1 mm) podstawy, tak aby wszystkie cztery rurki poliamidowe były tej samej długości.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ostrożnie przeciągnij jedną tetrodę przez rurkę poliamidową. Ważne jest, aby drut tetrody był idealnie prosty, gdy przechodzi przez rurkę, ponieważ wszelkie załamania lub zagięcia bardzo utrudnią pełne przewleczenie tetrody. Powtórz tę czynność dla trzech innych tetrod.</li>
	<li>Gdy wszystkie tetrody znajdą się w swoich rurkach, ostrożnie nałóż małą kroplę cyjanoakrylanu na wierzch każdej rurki, zabezpieczając tetrody w odpowiednich rurkach. Uważaj, aby nie dostać się cyjanoakrylan między nośniki lub na luźne druty tetrody, które wystają przez nasadkę.</li>
	<li>Przetnij tetrody tak, aby wystawały tylko poza rurki 2,0 mm (dla subiculum lub hipokampa). Następnie umieść podstawę napędu (z włożonymi czterema kołkami przeciw owadom) w przyrządzie VersaDrive. Druga połowa przyrządu będzie trzymać nasadkę VersaDrive, która ma wszystkie otwory na gniazda do wykonania połączeń kanałów.</li>
	<li>Przekręć napędową całkowicie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, tak aby tetrody znalazły się w najniższym położeniu.</li>
	<li>Przed podłączeniem przewodów tetrody do złotych gniazd należy najpierw podłączyć przewody uziemiające do nasadki. Nasadka VersaDrive ma dwa otwory na kołki do połączeń uziemiających w środkowym położeniu dwóch rzędów otworów. Wytnij drut miedziany o długości co najmniej 30 mm (w zależności od tego, w którym miejscu czaszki umieścić ziemię) i przeprowadź go przez jeden z tych środkowych otworów. Drut miedziany powinien mieć średnicę 100 - 500 μM (0,004-0,02"), co odpowiada w przybliżeniu drutowi od 38 AWG do 24 AWG. Wciśnij złoty pojemnik przez otwór, aby złapać drut miedziany na miejscu i przyciąć nadmiar drutu. Na drugim końcu drutu miedzianego nałóż topnik i ten koniec drutu do uziemiającej (patrz 2.11.). Powtórz dla drugiego przewodu uziemiającego.</li>
	<li>Następnie przeprowadź wszystkie luźne druty tetrody (w sumie powinno być ich szesnaście) przez odpowiednie otwory w nasadce. Najlepiej zacząć od jednej tetrody i przewlec poszczególne druty do odpowiednich czterech otworów, które zakończą się bezpośrednio nad nią. Z poszczególnymi drutami tetrody należy obchodzić się z lekkim naciskiem, ponieważ są one delikatne i mogą się łatwo zacisnąć, jeśli zostaną zbyt mocno uchwycone. Zamontuj nasadkę, ustawiając otwory na szpilki przeciw owadom i wciskając złączkę do podstawy.</li>
	<li>Gdy druty tetrody wystają przez nasadkę, wciśnij złote gniazda, aby złapać druty tetrody na miejscu i wykonać połączenia elektryczne. Około 50% przewodów zostanie odciętych (powyżej nasadki) po wciśnięciu złotego pojemnika w dół. Przytnij nadmiar drutu, który pozostaje wystający z górnej części nasadki. W rzadkich przypadkach (mniej niż 5%) wciśnięcie złotego gniazda w dół spowoduje zmiażdżenie przewodu i złamanie go poniżej gniazda, powodując odłączenie kanału. To odłączenie może nie zostać zrealizowane do momentu etapu badania impedancji i galwanizacji (patrz 4.7).</li>
	<li>Powtórz proces wciskania dla trzech pozostałych tetrod. Przekręć napędowe zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć je z powrotem do góry i upewnić się, że ruch napędu jest płynny.</li>
</ol>
4. Pozłacanie końcówek elektrod
<ol>
	<li>Niezależnie od tego, jaki rodzaj mikroelektrod jest używany, końcówki elektrod powinny być pozłacane w celu zmniejszenia impedancji końcówki. Zmaksymalizuje to zdolność do niezawodnego rejestrowania i rozróżniania potencjałów czynnościowych pojedynczej jednostki. Przetestuj impedancję elektrody za pomocą urządzenia Neuralynx nanoZ. nanoZ to urządzenie komputerowe, które mierzy impedancję i pozwala na automatyczną galwanizację.</li>
	<li>Najpierw przekręć microdrive w dół (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) do ich najniższego położenia. Następnie bezpiecznie zamontuj mikronapęd na zacisku, który umożliwi opuszczenie końcówek elektrod do roztworu do złocenia.</li>
	<li>Napełnij jedną wieżę Delrin roztworem SIFCO Gold, a drugą wieżę wodą destylowaną. Opuść końcówki elektrod do roztworu złota.</li>
	<li>Podłącz USB nanoZ do komputera z systemem Windows, a następnie otwórz program nanoZ. Ten program poda odczyty impedancji i wykona pozłacanie na każdym podłączonym kanale mikronapędu.</li>
	<li>Przejdź do listy rozwijanej Urządzenie i wybierz nanoZ, po czym u dołu okna pojawi się komunikat "Połączenie nawiązane". Następnie wybierz odpowiedni adapter do testowania z menu rozwijanego. Kliknij "Testuj impedancje" i ustaw częstotliwość testu na 1004 Hz (40 cykli, przerwa 0 ms). Kliknij "Sonda testowa", co otworzy okno "Raport sondy", które pokazuje wszystkie dostępne kanały wraz z ich odczytami MΩ. Zapisz te wartości impedancji, klikając ikonę dysku lub wybierając "Plik", a następnie "Zapisz raport".</li>
	<li>Następnie kliknij "DC Electroplate" i przypisz następujące wartości: Tryb = impedancja dopasowania, Prąd galwanizacji = -1,0 μA, Cel = 350 kΩ przy 1,004 Hz, 5 przebiegów, interwał 5 sekund, przerwa 2 sekundy</li>.
	<li>Kliknij "Autoplate". Program najpierw odczyta impedancję każdego kanału, a następnie przyłoży określony prąd do tego kanału, ponownie przetestuje impedancję i przyłoży prąd w razie potrzeby, aż zostanie osiągnięta impedancja docelowa (lub niższa wartość). Chociaż celem jest zmniejszenie impedancji elektrody, możliwe jest, że kanały będą galwanizowane poniżej wartości 100 kΩ. W takich przypadkach możliwe jest, że sąsiednie przewody na tetrodzie zostały ze sobą zwarte. Jeśli tak się stanie, odwróć polaryzację prądu (+ 1,0 μA), aby usunąć nadmiar cząstek złota, ponownie przetestuj impedancję tego kanału, a następnie powtórz galwanizację. Typowe wartości impedancji końcowej na wiązce czterech przewodów 12,5 μM mieszczą się w zakresie 150 - 325 kΩ.</li>
	<li>Jeśli istnieje jakikolwiek pojedynczy kanał, który nie został pokryty poniżej 350 kΩ, powtórz proces galwanizacji. Program pominie kanały, które już osiągnęły cel i wyświetli tylko te kanały, które tego nie zrobiły.</li>
	<li>Gdy wszystkie kanały zostaną pokryte akceptowalną impedancją, zamknij program nanoZ i odłącz urządzenie. Podnieś elektrody z roztworu galwanicznego i opuść końcówki do wieży Delrin z wodą destylowaną, aby spłukać nadmiar cząsteczek złota.</li>
	<li>Przekręć napędowe zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż elektrody zostaną podniesione do górnej pozycji. Teraz mikronapęd i elektrody są gotowe do implantacji.</li>
</ol>

<ol><li>Recce, M. L., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetrode%3A+a+new+technique+for+multi-unit+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci.+Abstr%22%5BJournal%5D)">The tetrode: a new technique for multi-unit extracellular recording.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 15, 1250(1989).</li>
<li>O'Keefe, J., Recce, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3, 317-330 (1993).</li>
<li>Chen, G., Wang, L. P., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+population-level+memory+traces+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neural population-level memory traces in the mouse hippocampus.</a> PLoS ONE. 4 (12), e8256(2009).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents+--+EEG%2C+ECoG%2C+LFP%2C+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents -- EEG, ECoG, LFP, and spikes.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Tort, A. B., Kramer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cross-frequency+coupling+of+local+field+potential+oscillations+in+rat+striatum+and+hippocampus+during+performance+of+a+T-maze+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic cross-frequency coupling of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105 (51), 20517-20522 (2008).</li>
<li>Seidenbecher, T., Laxmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdalar+and+hippocampal+theta+rhythm+synchronization+during+fear+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval.</a> Science. 301 (5634), 846-850 (2003).</li>
<li>Yamamoto, J., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+chronically+implantable+precision+motorized+microdrive+array+for+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals.</a> J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).</li>
<li>Harris, K. D., Henze, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+tetrode+spike+separation+as+determined+by+simultaneous+intracellular+and+extracellular+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements.</a> J. Neurophysiol. 84 (1), 401-414 (2000).</li>
<li>Henze, D. A., Borhegyi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+features+predicted+by+extracellular+recordings+in+the+hippocampus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo.</a> J. Neurophysiol. 84 (1), 390-400 (2000).</li>
<li>Chang, E. H., Huerta, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+correlates+of+object+recognition+in+the+dorsal+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological correlates of object recognition in the dorsal subiculum.</a> Front. Behav. Neurosci. 6, 46(2012).</li>
<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li>
<li>O'Keefe, J., Dostrovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocampus+as+a+spatial+map.+Preliminary+evidence+from+unit+activity+in+the+freely-moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat.</a> Brain Res. 34 (1), 171-175 (1971).</li>
<li>Wilson, M. A., McNaughton, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+hippocampal+ensemble+code+for+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the hippocampal ensemble code for space.</a> Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuzs%C3%A1ki%2C+G+%22Rhythms+of+the+Brain%22">Rhythms of the Brain</a>. , Oxford University Press. Oxford, U.K. (2006).</li>
<li>McHugh, T. J., Blum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hippocampal+representation+of+space+in+CA1-specific+NMDAR1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Impaired hippocampal representation of space in CA1-specific NMDAR1 knockout mice.</a> Cell. 87 (7), 1339-1349 (1996).</li>
<li>Resnik, E., McFarland, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+GluA1+deletion+on+the+hippocampal+population+code+for+position%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The effects of GluA1 deletion on the hippocampal population code for position.</a> J. Neurosci. 32 (26), 8952-8968 (2012).</li>
<li>Cacucci, F., Yi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+firing+correlates+with+memory+deficits+and+amyloid+plaque+burden+in+Tg2576+Alzheimer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Place cell firing correlates with memory deficits and amyloid plaque burden in Tg2576 Alzheimer mouse model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (22), 7863-7868 (2008).</li>
<li>Sigurdsson, T., Stark, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hippocampal-prefrontal+synchrony+in+a+genetic+mouse+model+of+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia.</a> Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).</li>
<li>Engel, A. K., Moll, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+recordings+from+the+human+brain%3A+clinical+insights+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Invasive recordings from the human brain: clinical insights and beyond.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6 (1), 35-47 (2005).</li>
<li>Cash, S. S., Halgren, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+K-complex+represents+an+isolated+cortical+down-state%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The human K-complex represents an isolated cortical down-state.</a> Science. 324 (5930), 1084-1087 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy zestaw technik konstruowania lekkich i kompaktowych mikronapędów do rejestrowania aktywności jednostek zewnątrzkomórkowych i potencjału pola u myszy. Budując niestandardowe mikrodyski z podstawami wykonanymi ze szkła akrylowego (metakrylanu metylu), główny system można łatwo dostosować do wielu napędów i do kierowania na szeroką gamę regionów neuronowych. Udało nam się zmodyfikować system do nagrywania z wielu celów mózgowych i z większymi matrycami do nagrań u myszy. Dzięki dalszym modyfikacjom można zintegro...

Wykorzystanie techniki mikroelektrod do rejestrowania zewnątrzkomórkowych sygnałów nerwowych in vivo ma długą i cenioną tradycję w neurobiologii 1, 2. Zdolność do rejestrowania aktywności elektrycznej z wielu obszarów mózgu u swobodnie zachowujących się zwierząt jest jednak nowszą technologią, która staje się coraz bardziej powszechna, ponieważ pakiety oprogramowania do pozyskiwania, analizy i dyskryminacji sygnałów neuronowych stają się coraz bardziej wyrafinowane i przyjazne dla użytkownika 3, 4. Postępowi technologicznemu w dziedzinie oprogramowania towarzyszy również zmniejszenie masy i objętości wszczepialnych urządzeń, które zostały wystarczająco zmniejszone, aby można je było rejestrować u małych ssaków, takich jak myszy. Wykorzystując lekkie (głównie plastikowe) komponenty, naukowcy są w stanie skonstruować mikronapędy, które pozwalają na niezależne pozycjonowanie elektrod lub tetrod w celu celowania w szeroką gamę obszarów mózgu 5-7. Nawet głębokie struktury mózgu, takie jak ciało migdałowate 6 i prążkowie 5, mogą być rutynowo celowane poprzez wybór odpowiednio długiej napędowej. Te techniki rejestracji pozwalają naukowcom na uzyskanie sygnałów neuronowych o wysokiej wierności i są zgodne z aktywnością elektryczną pojedynczych neuronów zarejestrowanych wewnątrzkomórkowo 8, 9. Korzystając z tego typu mikronapędów, udało nam się zarejestrować pojedyncze jednostki od myszy przez okres do dwóch miesięcy po implantacji 10. Ponadto lekki charakter urządzeń (około 1,5-2,0 g) zaowocował wydajnością behawioralną, która jest porównywalna z myszami bez implantacji w wielu zadaniach behawioralnych. W szczególności wykazaliśmy, że wszczepione myszy wykazują normalną wydajność w zadaniu rozpoznawania nowych obiektów 10 i zadaniu umieszczania obiektów (dane niepublikowane).	
	Użycie mikronapędów sprzężonych z wieloma tetrodami pozwala badaczom monitorować i analizować aktywność neuronalną na poziomie sieci, jednocześnie nagrywając z wielu pojedynczych jednostek w mózgu. Nagrywanie za pomocą tych tetrod ma kilka głównych zalet dla celów identyfikacji jednostek i umożliwia bardzo dokładne pozyskiwanie i rozróżnianie wielu pojedynczych jednostek 11. Opisujemy, jak wytwarzać i złocić wiązki tetrod, a następnie ładować je do napędzanych nośników elektrod. Jeden typ nośnika napędu, który opisujemy, jest dostępny na rynku, a drugi to prosta, ale łatwa do rozbudowy konstrukcja napędu, która może pomieścić wiele nośników i układów tetrod bez znacznych inwestycji zasobów.

<table><tbody><tr><td>0,0005" (12,5 &mu; M) średnica drutu platynowo-irydowego </td><td>California Fine Wire</td><td>CFW#100-167</td><td>HML VG izolowany <a href="http://www.calfinewire.com" target="_blank">www.calfinewire.com</a></td></tr><tr><td>0,002" (50 &mu; M) średnica drutu Stableohm 675</td><td>California Fine Wire</td><td>CFW# 100-188</td><td>Izolowane rurki poliamidowe Ni-Cr HML</td></tr><tr><td></td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150020</td><td>99 mikronów średnicy, 166 mikronów średnicy zewnętrznej <a href="http://www.polymicro.com" target="_blank">www.polymicro.com</a></td></tr><tr><td>prowadnice mosiężne</td><td>World Plastics Inc</td><td></td> Bloki Delrin <td>3,3 x 6,6 mm</td></tr><tr><td></td><td>Świat Plastics Inc</td><td></td><td>3,13 x 2,5 mm</td></tr><tr><td>mosiężne z walcowym</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>00-90 x 1/2</td><td>śruba napędowa <a href="http://www.jimorrisco.com" target="_blank">www.jimorrisco.com</a></td></tr><tr><td>nakrętki mosiężne sześciokątne</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>00-90</td><td></td></tr><tr><td>mosiężne z walcowym</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>000-120 x 3/32</td><td>EIB montaż i śruba uziemiająca</td></tr><tr><td>plexi akrylowa</td><td>Canal Street Plastics</td><td></td><td>o grubości 5 mm, przezroczysta, <a href="http://www.cpcnyc.com" target="_blank"> www.cpcnyc.com</a></td></tr><tr><td>cyjanoakrylowa</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td>2 g tubka</td></tr><tr><td>elektroniczna</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-18</td><td><a href="http://www.neuralynx.com" target="_blank">www.neuralynx.com</a></td></tr><tr><td>roztwór złota bez cyjanku</td><td>SIFCO</td><td>SIFCO 5355</td><td><a href="http://www.sifcoasc.com" target="_blank">www.sifcoasc.com</a></td></tr><tr><td>VersaDrive 4</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>model czterech tetrod</td></tr><tr><td>stanowisko montażowe</td><td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowana przędzarka tetrodowa</td><td>Wirówka tetrodowa</td><td>Neuralynx</td> 2.0 <td></td></tr><tr><td>Przyrząd VersaDrive</td> Lutownica <td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr> Radio <tr><td></td><td>Shack</td><td>64-2802B</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank">www.radioshack.com</a></td></tr><tr><td>nanoZ</td> Wiertarka / wkrętarka do małych bitów <td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ram Produkty</td><td>Rampower 35</td><td>z kontrolerem nożnym, <a href="http://www.ramprodinc.com" target="_blank">www.ramprodinc.com</a></td></tr><tr><td>wiertła</td><td>Small Parts, Inc.</td><td></td><td>3/32" bity, <a href="http://www.smallpartsinc.com" target="_blank">www.smallpartsinc.com</a></td></tr><tr><td>mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ-60</td><td><a href="http://www.olympusamerica.com" target="_blank">www.olympusamerica.com</a></td></tr><tr><td>opalarka</td><td>Alphawire</td><td>Fit gun 3</td><td>Użyj tylko ustawienia "1", <a href="http://www.alphawire.com" target="_blank">www.alphawire.com</a</td></tr><tr><td>>26 AWG drut miedziany</td><td>Arcor Electronics</td><td>F26</td><td>do przewodów uziemiających, <a href="http://www.arcorelectronics.com" target="_blank"> www.arcorelectronics.com</a></td></tr><tr><td>topnik lutowniczy</td><td>Eagle</td><td>2 uncje, średnica #205</td><td></td></tr><tr><td>0,02" lut</td><td>Kester</td><td>24-6337-0010</td><td><a href="http://www.kester.com" target="_blank"> www.kester.com</a></td></tr><tr><td>imadło stołowe Imadło</td> światłowodowe <td>Vacu-Vise</td><td>Model 300</td><td></td></tr><tr><td></td> podwójne ramiona świetlne <td>Nikon</td><td>MKII</td><td>, <a href="http://www.nikon.com" target="_blank"> www.nikon.com</a></td></tr><tr><td>5-min żywica epoksydowa</td><td>Sojuszniczy Elektronika</td><td></td><td>25 ml, <a href="http://www.alliedelec.com" target="_blank"> www.alliedelec.com</a>cienkie</td></tr> <tr><td>pęsety</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-4907, materiał RS-5010</td><td>INOX, <a href="http://www.roboz.com" target="_blank"> www.roboz.com</a></td></tr><tr><td>mikro nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Materiały i odczynniki używane do budowy tetrod i mikronapędów.</td></tr></tbody></table>

budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

Construction of Microdrive Arrays for Chronic Neural Recordings in Awake Behaving Mice

Najnowocześniejsze zapisy elektrofizjologiczne z mózgów swobodnie zachowujących się zwierząt pozwalają badaczom na jednoczesne badanie lokalnych potencjałów pola (LFP) z populacji neuronów i potencjałów czynnościowych z pojedynczych komórek, podczas gdy zwierzę angażuje się w eksperymentalnie istotne zadania. Przewlekle wszczepiane mikronapędy pozwalają na to, aby zapisy mózgu trwały przez kilka tygodni. Zminiaturyzowane napędy i lekkie komponenty pozwalają na prowadzenie długotrwałych zapisów u małych ssaków, takich jak myszy. Za pomocą tetrod, które składają się z ciasno splecionych wiązek czterech elektrod, w których każdy drut ma średnicę 12,5 μm, możliwe jest wyizolowanie fizjologicznie aktywnych neuronów w powierzchownych obszarach mózgu, takich jak kora mózgowa, grzbietowy hipokamp i subiculum, a także w głębszych regionach, takich jak prążkowie i ciało migdałowate. Co więcej, technika ta zapewnia stabilne, wysokiej jakości nagrania neuronowe, ponieważ zwierzę jest poddawane różnorodnym zadaniom behawioralnym. Ten manuskrypt opisuje kilka technik, które zostały zoptymalizowane pod kątem nagrywania z mózgu myszy. Najpierw pokazujemy, jak wytwarzać tetrody, ładować je do napędzanych rur i pozłacać ich końcówki, aby zmniejszyć ich impedancję z zakresu MΩ do KΩ. Po drugie, pokazujemy, jak skonstruować niestandardowy zespół mikronapędu do przenoszenia i przesuwania tetrod w pionie, przy użyciu niedrogich materiałów. Po trzecie, pokazujemy kroki montażu dostępnego na rynku mikronapędu (Neuralynx VersaDrive), który jest przeznaczony do przenoszenia niezależnie ruchomych tetrod. Na koniec przedstawiamy reprezentatywne wyniki lokalnych potencjałów polowych i sygnałów jednojednostkowych uzyskanych w podiculum grzbietowym myszy. Techniki te można łatwo modyfikować, aby dostosować je do różnych typów układów elektrod i schematów zapisu w mózgu myszy.

Po implantacji mikrodrajwu i opuszczeniu elektrod do zamierzonych obszarów mózgu, do rejestracji sygnałów neuronalnych wymagany jest system akwizycji danych z wzmacniaczem, taki jak Neuralynx Lynx-8. Reprezentatywne zapisy neuronalne potencjałów polowych (LFP) oraz potencjałów czynnościowych pojedynczych jednostek (często określanych jako „spikes”) z grzbietowej części subiculum myszy przedstawiono na Rysunku 2. Sygnały LFP były próbkowane z częstotliwością 3 kHz i filtrowane pasmowo w zakresie 0,1-500 H...

Opisano projektowanie i montaż mikronapędów do elektrofizjologicznych zapisów in vivo sygnałów mózgowych od myszy. Dzięki przymocowaniu wiązek mikroelektrod do wytrzymałych nośników napędzanych, techniki te pozwalają na długotrwałe i stabilne zapisy neuronowe. Lekka konstrukcja pozwala na nieograniczoną wydajność behawioralną zwierzęcia po wszczepieniu napędu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

State-of-the-art electrophysiological recordings from the brains of freely behaving animals allow researchers to simultaneously examine local field ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie mikronapędu, który może być używany do nagrywania mózgu u myszy, gdy swobodnie poruszają się w komorze eksperymentalnej. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw wiązki czterech mikroelektrod do tede. Drugim krokiem jest skonstruowanie podstawy mikrodysku i zmontowanie elementów napędu.Następnie tetro są mocowane do napędu i podłączane do złotych pinów. Ostatnim krokiem jest pozłacanie końcówki tetros, aby obniżyć ich impedancję i zapewnić wysoki stosunek sygnału do nagrań szumów. Ostatecznie przewlekłe macierze mikronapędów są używane do rejestrowania aktywności neuronalnej populacji neuronów, a także pojedynczych neuronów u przytomnych zwierząt zachowujących się.Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona dość niedrogie i oparte na falach świetlnych rozwiązanie do przewlekłych zapisów mózgu u myszy i innych małych ssaków. Technologia ta może rozwiązać kluczowe problemy w dziedzinie neuronauki, takie jak sposób, w jaki neurony kodują informacje podczas wykonywania zadań behawioralnych. Regularnie stosujemy tę technikę do rejestrowania neuronów z grzbietowego hipokampa i ulu, ale używamy jej również do celowania w głębsze struktury, takie jak ciało migdałowate.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ konstrukcja i montaż są trudne do nauczenia, a także dlatego, że masz do czynienia z bardzo małą i delikatną częścią, aby rozpocząć produkcję tetro. Aby hipokamp przeciął 30 centymetrów izolowanego drutu platynowego irydowego o średnicy 12,5 mikrometra, złóż drut dwukrotnie, aby utworzyć cztery równoległe druty o długości 7,5 centymetra, każdy o długości 7,5 centymetra. Następnie przymocuj pokryty gumą klips w pobliżu dolnej części udrapowanego drutu i przymocuj go do zmotoryzowanego przędzalnika tetro, upewniając się, że drut jest napięty, ale nie zbyt napięty lub ma ciężar, ponieważ spowoduje to jego pęknięcie.Podczas wirowania wykonaj 80 obrotów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby nawinąć tero, a następnie 20 obrotów w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby uwolnić napięcie. Ostateczna liczba obrotów na długość drutu powinna wynosić osiem obrotów na mikron. Następnie ustaw opalarkę na 400 stopni Celsjusza i użyj jej do połączenia ze sobą przewodów.Uruchom opalarkę w górę iw dół wzdłuż drutów przez pięć sekund, cały czas trzymając ją w odległości około dwóch centymetrów od drutu. Aby delikatnie stopić powłokę wiążącą VG na drutach, odetnij górną część tero, aby utworzyć cztery oddzielne druty, a następnie zwolnij dolny koniec z klipsa. Umieść wypełnione tero w bezpyłowym pudełku do przechowywania do czasu zakończenia dysku.Najpierw zbuduj podstawę dla mikronapędu, szlifując 20-milimetrowy kwadratowy kawałek akrylu z pleksi o grubości pięciu milimetrów do kształtu, który pozwoli myszy swobodnie poruszać się wraz z dyskiem po jego wszczepieniu na głowę. Następnie ze sobą prostopadle dwie mosiężne prowadnice o wymiarach 3,3 na 6,3 milimetra. Pionowa mosiężna prowadnica utrzyma napędową i elektrody, podczas gdy poziomy element zostanie przyklejony do akrylowej podstawy.Następnie rozpocznij montaż samego napędu, przepuszczając piersiową z napełniającym przez górną część prowadnicy i do plastikowego bloku delrin. Nie nakręcaj piersi sześciokątnej na, aż nakrętka prawie dotknie dolnej części prowadnicy. Nie dokręcaj go jednak do końca.Zamiast tego stopić niewielką ilość lutu, aby połączyć nakrętkę i. Uważaj jednak, aby niczego nie do przewodnika. Obracanie powinno przesunąć blok delrin zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w pionie wzdłuż gwintu.Po zmontowaniu napędu wróć do akrylowej podstawy i wytnij szczelinę o szerokości trzech milimetrów, w której będzie znajdował się napęd elektrody. Następnie przełóż poziomą prowadnicę biustonosza przez szczelinę, a następnie użyj kleju Sano ACRL, aby przymocować element do podstawy. Następnie umieść elektroniczną płytkę interfejsu na górze podstawy i aby zaznaczyć położenie dwóch otworów na za pomocą wiertła z końcówką 1,5 milimetra, ostrożnie wywierć otwory w oznaczeniach na, które utrzymają EIB na miejscu na górze podstawy.Następnie wkręć dwie piersiowe w otwory. Użyj mikronożyczek preparacyjnych, aby przeciąć cztery siedmiomilimetrowe kawałki rurki poliamidowej. Ustaw je obok siebie na kawałku złożonej taśmy laboratoryjnej i nałóż sano ACRL, aby je ze sobą połączyć.Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby rurki połączeniowe całkowicie wyschły. Następnie ostrożnie nanieś niewielką ilość cyjanoakrylanu na powierzchnię delrinu. Następnie umieść cztery rurki łączące na kleju.Ponownie odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby klej całkowicie stwardniał, zanim spróbujesz przesunąć dysk. Sprawdź, czy rurki poliamidowe są bezpiecznie przymocowane i czy cały zespół porusza się płynnie, nie dotykając prowadnicy ani nie napotykając żadnego oporu. Następnie przygotuj uziemiającą i podłącz przewód uziemiający do EIB zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.Podłącz tetro i/lub pojedyncze elektrody do EIB, najpierw przepuszczając przewody przez rurkę poliamidową, pozwalając im wystawać co najmniej dwa milimetry poza koniec rury. Następnie nałóż niewielką kroplę cyjanoakrylanu, przymocowując drut do rurki i zapobiegając wszelkim ruchom drutu. Następnie podłącz luźne końce tero lub innych przewodów do otworu kanału EIB za pomocą złotego kołka.Na koniec odetnij nadmiar drutu za pomocą pokazanych cienkich nożyczek. Oto przykłady innych konfiguracji napędów, które można skonstruować tak, aby celowały w różne regiony mózgu. Na początek montaż napędu.Przytnij rurkę poliamidową na 10 milimetrów i przeprowadź ją przez najmniejszy otwór w nośniku tetro, aż wysunie się 0.5 milimetra poza koniec. Następnie umieść rurkę poliamidową na miejscu i powtórz te kroki dla trzech pozostałych rurek i nośników. Po całkowitym związaniu żywicy epoksydowej.Przeprowadź każdą rurkę poliamidową przez jeden z czterech otworów w podstawie napędu Versa. Następnie wepchnij szpilkę do owadów przez zewnętrzny otwór. Utrzyma to nosidełko tetro w linii i posłuży jako szyna, po której przewoźnik będzie mógł podróżować.Powtórz tę czynność dla trzech pozostałych przewoźników. Następnie weź nasadkę i wyrównaj ją z czterema szpilkami przeciw owadom, tak aby nasadka zakrywała podstawę, a nosiciele tero znajdowali się w nasadce. Przekręć maszynową o wymiarach jeden milimetr na pięć milimetrów przez odpowiedni otwór w nasadce i do nośnika tero.Powtórz to dla pozostałych trzech. Przekręć wszystkie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż nośniki tetro znajdą się w górnym położeniu, a rurki poliamidowe będą widoczne przez otwór nasadki. Za pomocą cienkich nożyczek do mikropreparowania przeciąć rurkę tuż pod podstawą, tak aby wszystkie cztery rurki poliamidowe były tej samej długości.Następnie za pomocą mikroskopu preparacyjnego ostrożnie przeciągnij tetros przez rurki poliamidowe i zabezpiecz je na miejscu niewielką kroplą anoanianu. Następnie przytnij tetros tak, aby wystawały tylko 2,0 milimetra poza rurki. Przed podłączeniem przewodów tero do złotych gniazd.Najpierw podłącz przewody uziemiające do nasadki. Następnie przeprowadź wszystkie luźne przewody tero przez odpowiednie otwory w nasadce i zamontuj nasadkę, wyrównując otwory na szpilki przeciw owadom i dokręcając do podstawy. Na koniec odetnij nadmiar drutu, który pozostaje wystający z górnej części nasadki.Najpierw przekręć mikronapędu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara do ich najniższego położenia. Następnie bezpiecznie zamontuj mikronapęd na zacisku, który umożliwi opuszczenie końcówek elektrod do roztworu do złocenia. Napełnij jedną wieżę delrin roztworem złota CCO, a drugą wieżę wodą destylowaną i opuść końcówki elektrod do roztworu złota.Następnie otwórz program Nano Z i kliknij galwanizację DC. Ustaw tryb tak, aby dopasować impedancję, prąd galwaniczny na minus 1.0 mikroamperów, a cel na 350 kiloomów przy 1004 hercach. Następnie ustaw go tak, aby uruchamiał się pięć razy w pięciosekundowych odstępach z dwusekundową przerwą między każdym uruchomieniem.Po skonfigurowaniu programu kliknij automatyczną płytę, program najpierw odczyta impedancję każdego kanału. Następnie przyłóż określony prąd do tego kanału, ponownie przetestuj impedancję i w razie potrzeby przyłóż prąd, aż zostanie osiągnięta impedancja docelowa lub niższa wartość. Jeśli impedancja spadnie poniżej 100 kiloomów, odwróć polaryzację prądu na dodatnią 1.0 mikroamperów, aby usunąć nadmiar cząstek złota, a następnie powtórz galwanizację Typowe wartości impedancji końcowej na wiązce czterech przewodów 12.5 mikrometra wahają się od 150 do 325 kiloomów.Gdy wszystkie kanały zostaną pokryte akceptowalnym poziomem impedancji, zamknij program Nano Z i odłącz urządzenie. Następnie wyjmij elektrody z roztworu galwanicznego i opuść końcówki do wieży delrinu z wodą destylowaną, aby spłukać nadmiar cząstek złota Reprezentatywne nagrania neuronowe za pomocą mikronapędu do pomiaru lokalnych potencjałów pola z myszy. Grzbietowe ulu są pokazane tutaj.Cztery kanały pokazane w części A są przykładem słabo uziemionego sygnału, który skutkuje wartościami nasyconymi i bardzo hałaśliwymi sygnałami. Cztery kanały pokazane w części B są jednak dobrym przykładem dobrze uziemionego sygnału z wyraźnie widocznymi oscylacjami sieci w zakresie theta od czterech do 12 herców. Po lewej stronie znajduje się przykład kiepskiego nagrania Tero.Ponieważ cztery druty elektrod zarejestrowały zasadniczo identyczne formy fal szczytowych, ponad tysiąc indywidualnych form fal szczytowych zostało nałożonych na siebie dla każdego kanału teros. Wzór ten był prawdopodobnie spowodowany łączeniem się drutów ze sobą podczas etapu topnienia izolacji w procesie wytwarzania tero, co spowodowało, że wiązka przewodów skutecznie działała jako pojedyncza elektroda rejestrująca. Po prawej stronie znajduje się przykład dobrego nagrania tetro, pokazujący nałożone na siebie formy fal kolców z domniemanej jednostki o różnych amplitudach na czterech przewodach tede.Ten typ wzorca zapisu wartości szczytowych pozwala na lepszą dyskryminację jednostek podczas późniejszego grupowania i separacji w trybie offline. Po skonstruowaniu tego mikronurkowania ważne jest, aby przetestować każdy z kanałów elektrod i upewnić się, że są w odpowiednim zakresie impedancji przed przejściem do operacji implantacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś czuć się komfortowo budując teros i napędy mikroelektrod do przewlekłej implantacji u myszy.Powodzenia w budowaniu dysków i baw się dobrze z eksperymentami.

construction-microdrive-arrays-for-chronic-neural-recordings-awake

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Budowa tablic mikrodysków do przewlekłych rejestracji nerwowych u czujnych, poruszających się myszy

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania macierzy mikrodrajwerów do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów.

Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania i kondycjonowania tetrod do zastosowania w macierzy mikro-napędów, która została zaprojektowana do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Dodatkowo przedstawiamy końcowe etapy konstrukcji macierzy mikro-napędów, obejmujące instalację przewodów uziemiających oraz stożka ochronnego.

Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

Opisano projektowanie, wykonanie i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu. Urządzenie stanowi kosztowo efektywne i łatwe w użyciu rozwiązanie do chronicznych rejestracji pojedynczych jednostek u małych zwierząt w warunkach behawioralnych.

Projekt i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu do chronicznych rejestracji neuronalnych u małych zwierząt

Wideo demonstruje jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z wielu obszarów mózgu u szczura przy użyciu zintegrowanego układu mikronapędów. Elektrody rejestrujące są umieszczone w opuszce węchowej, elektrody referencyjne w korze czołowej, a elektrody układu mikronapędów w hipokampie. Szczur może swobodnie żerować, a jednoczesny zapis ze wszystkich wszczepionych elektrod jest rejestrowany za pomocą matrycy.

Metoda Micro-drive Array do zapisu elektrofizjologicznego z wielu obszarów mózgu

Zrozumienie neuronalnych substratów zachowania wymaga nagrania zespołu obwodów mózgowych. Ze względu na swoją podatność genetyczną, mysz oferuje model do rozwarstwiania obwodów i mimikry choroby. W tym miejscu opisano metodę projektowania i wytwarzania zminiaturyzowanych sond, która jest odpowiednia do celowania w głęboką strukturę mózgu u myszy.

Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

Prezentujemy konstrukcję hipernapędu do druku 3D z osiemnastoma niezależnie regulowanymi tetrodami. Hipernapęd ma za zadanie rejestrować aktywność mózgu swobodnie zachowujących się szczurów przez okres kilku tygodni.

Budowa ulepszonego hipernapędu wielotetrodowego do wielkoskalowej rejestracji neuronalnej u zachowujących się szczurów

Ten protokół opisuje budowę hybrydowego układu mikronapędów, który umożliwia wszczepienie dziewięciu niezależnie regulowanych tetrod i jednej regulowanej sondy opto-krzemowej w dwóch obszarach mózgu u swobodnie poruszających się myszy. Zademonstrowano również metodę bezpiecznego odzyskiwania i ponownego wykorzystania sondy optokrzemowej do wielu celów.

Hybrydowy system mikronapędowy z odzyskiwalną sondą optokrzemową i tetrodą do nagrywania w dwóch lokalizacjach o wysokiej gęstości w swobodnie poruszających się myszach

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Tutaj opisujemy projekt mikronapędu, procedurę implantacji chirurgicznej i strategię rekonwalescencji po operacji, które pozwalają na przewlekłe zapisy pola i pojedyncze jednostki z wielu regionów mózgu jednocześnie u młodocianych i dorastających myszy w krytycznym oknie rozwojowym od 20 dnia po urodzeniu (p20) do 60 dnia po urodzeniu (p60) i później.

Lekki implant napędowy do przewlekłych zapisów tetrody u młodych myszy

Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.

Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Poznaj budowę mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się swobodnie. Ta metoda umożliwia rejestrację aktywności pojedynczych neuronów i populacji neuronalnych z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

Przeglądaj więcej filmów