Name: Zmodyfikowany heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych świń do badań nad translacyjną unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj zmodyfikowany model heterotopowego przeszczepu kończyn tylnych świń z zachowanym unaczynionym szpikiem kostnym do badań nad immunomodulacją w transplantacji kompozytowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować następującym osobom za ich wkład w to
projekt: dr Kakali Sarkar, Joani Christensen, licencjat, Kate Buretta, licencjat, Nance Yuan,
BS, William Lehao, MD, Johanna Grahammer, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada, MD,
Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, Saami Khalifian, BS, Mao Qi, MD i
Angelo Leto Barone MD, Laboratorium VCA, Zakład Tworzyw Sztucznych i Rekonstrukcji 
Chirurgia, Johns Hopkins University School of Medicine, Janis Taube, MD, Mark Fischer, 
Lekarz medycyny, Wydział Dermatologii i Patologii, Szkoła Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa 
Medycyny Sue Eller, Centrum Szkoleniowe Chirurgii Minimalnie Inwazyjnej, Johns Hopkins 
Uniwersytecka Szkoła Medyczna i Cheng-Hung Lin, MD Chang Gung Memorial 
Szpital, Linkou, Tajwan.
Źródło finansowania: Instytut Medycyny Regeneracyjnej Sił Zbrojnych (DoD W81XWH-08-
2-0032)

W tej publikacji wideo, wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem dla zwierząt zatwierdzonym przez Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Planowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Wykorzystujemy zdefiniowane przez MHC miniaturowe świnie wsobne MGH (15-20 kg) w naszych badaniach translacyjnych do allotransplantacji kończyn, w których jeden dawca płci męskiej dostarcza kończyny dwóm biorcom płci żeńskiej (ryc. 1). Przed zabiegiem zwierzęta dawcy i biorcy są poddawane dokładnej ocenie klinicznej przez lekarza weterynarii.</li>
	<li>W celu zminimalizowania czasu znieczulenia i niedokrwienia, zabiegi dawcy i biorcy przeprowadzane są jednocześnie na trzech stołach operacyjnych w jednej dedykowanej sali operacyjnej dla dużych zwierząt. Praca zespołowa i koordynacja między zespołami chirurgicznymi, a także personelem weterynaryjnym mają kluczowe znaczenie dla ogólnego sukcesu tej procedury. Plan operacji jest omawiany z zespołem weterynaryjnym na formalnym spotkaniu 1-2 tygodnie przed dniem operacji.</li>
	<li>Tunelizowany cewnik do żyły centralnej (7 Fr dwustrumieniowy cewnik Hickmana) jest umieszczany w zewnętrznej lub wewnętrznej żyle szyjnej każdego biorcy zwierzęcia przed przeszczepem w celu immunosupresyjnego monitorowania poziomu leków i dożylnego podawania leków immunosupresyjnych i/lub immunomodulujących. Cewniki te są umieszczane w bezpośrednim polu widzenia za pomocą techniki cięcia żylnego i tunelizowane z tyłu, aby wyjść wysoko na szyi grzbietowej i zabezpieczane za pomocą niewchłanialnych szwów z monofilamentu i samoprzylepnego bandaża owijanego wokół szyi.</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta NPO (bez pokarmów stałych, ale dozwolone jest podlewanie ad lib) co najmniej 12 godzin przed zabiegiem.</li>
	<li>W dniu zabiegu należy uspokoić zwierzęta ketaminą w dawce 20 mg/kg i ksylazyną w dawce 2 mg/kg domięśniowo.</li>
	<li>Umieścić rurkę dotchawiczą o odpowiedniej wielkości i podłączyć ją do aparatu do znieczulenia i respiratora (utrzymywanego na izofluranie 0,5-3%)</li>
	<li>Umieścić cewnik dożylny w żyle usznej brzeżnej i podawać 0,9% sól fizjologiczną w oparciu o masę ciała przez cały zabieg.</li>
	<li>Podać analgezję zapobiegawczą (buprenorfina 0,02 mg/kg dożylnie).</li>
	<li>Profilaktyczny antybiotyk (cefazolina 20-25 mg/kg dożylnie) należy podać przed pierwszym nacięciem zarówno zwierzętom dawczym, jak i biorcom.</li>
	<li>Stosuj sterylną technikę we wszystkich procedurach zarówno dla biorców, jak i dawców. Obejmuje to stosowanie narzędzi sterylizowanych w autoklawie lub sterylizowanych gazem, masek, czepków na głowę, sterylnych fartuchów chirurgicznych i sterylnych rękawiczek. Ogolić obszar nacięcia maszynką do strzyżenia i zdezynfekować naprzemiennym roztworem Betadine i alkoholem.</li>
</ol>
Monitorowanie śródoperacyjne:
<ol>
	<li>Po indukcji i intubacji należy utrzymać znieczulenie mieszaniną wziewną 0,5-3% izofluranu w tlenie.</li>
	<li>Monitoruj tętno, pulsoksymetrię, EKG, CO2 i temperaturę w odbycie w sposób ciągły i rejestruj co 15 minut.</li>
	<li>Zapobiegaj hipotermii za pomocą ciepłego koca z wymuszonym obiegiem powietrza Bair Hugger.</li>
</ol>
Pobranie alloprzeszczepu kończyny kostno-skórnej od świni dawcy:
<ol>
	<li>Umieść zwierzę dawcy w pozycji leżącej na stole operacyjnym i ułóż je w sterylny sposób.</li>
	<li>Użyj angiografii laserowej bliskiej podczerwieni, aby zidentyfikować naczynia perforacyjne skóry przednio-przyśrodkowej. Wstrzyknąć zieleń indocyjaninową w ilości około 0,06 mg/kg rozcieńczoną w 2-5 ml soli fizjologicznej przez obwodowy dostęp naczyniowy. Około 10 sekund później wykonaj 30-2 minuty nagrań w bliskiej podczerwieni. Użyj wideo z tych nagrań, aby zidentyfikować perforatory. Na podstawie perforatorów zaznacz obszar skóry (około 100 cm2) do monitorowania.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry pachwiny w ciągłości z oznaczeniami na łopatce do skóry (ryc. 2).</li>
	<li>Zidentyfikuj naczynia udowe i odizoluj je dystalnie do poziomu gałęzi nadgenikulacyjnych i proksymalnie do poziomu więzadła pachwinowego.</li>
	<li>Wypreparuj skórę i tkankę podskórną, zachowując obszar łopatki skórnej. Zszyj krawędzie skóry do leżących pod nią mięśni, aby uniknąć skurczu podczas zbioru płatów.</li>
	<li>Wykonaj osteotomię tuż nad stępem za pomocą piły szablastej (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA).</li>
	<li>Podziel mięśnie w bliższej części uda za pomocą elektrokoagulacji.</li>
	<li>Podziel kość udową w połowie trzonu, pozostawiając płat kostno-skórny na szypułce naczyniowej. Płat zawiera łopatkę skórną, leżące pod nią mięśnie ud, staw kolanowy, dystalną część kości udowej i bliższą kość piszczelową, która zawiera nienaruszony unaczyniony szpik kostny o unikalnych cechach immunologicznych.</li>
	<li>Użyj wosku kostnego, aby uzyskać hemostazę w przestrzeniach szpikowych. Wygładź krawędzie kości za pomocą ronjeurs w przygotowaniu dla biorcy.</li>
	<li>Utrzymuj przeszczep perfundowany na szypułce naczyniowej, dopóki naczynia udowe biorcy nie zostaną przygotowane (ryc. 3).</li>
	<li>Po zakończeniu sekcji biorcy należy podwiązać naczynia udowe dawcy tak proksymalnie, jak to możliwe, i przed przeszczepem podać histydynę-tryptofan-ketoglutaran (HTK, Custodiol, Newtown PA) przed przeszczepem. 
	UWAGA: Kończyna dawcy jest przeszczepiana po przeciwnej stronie biorcy, tj. lewa kończyna dawcy po prawej stronie biorcy i prawa kończyna dawcy po lewej stronie biorcy).</li>
	<li>Poddać eutanazji świnię dawcę natychmiast po pobraniu drugiej tylnej kończyny przy użyciu 100 mg/kg dożylnie pentobarbitalu sodu. Zgon jest potwierdzany przez personel weterynaryjny zgodnie z ustalonym protokołem.</li>
</ol>
4. Procedura biorcy (allotransplantacja kończyn tylnych)
<ol>
	<li>Indukcję biorcy i intubację należy rozpocząć natychmiast po początkowym nacięciu dawcy, aby umożliwić przygotowanie naczyń biorczych podczas pobierania kończyny dawcy. Eliminuje to niepotrzebny czas oczekiwania i skraca całkowity czas znieczulenia dla dawcy i biorcy.</li>
	<li>Ustawić zwierzę na wznak z obrotem o 30° po stronie operacyjnej, aby umożliwić odsłonięcie strony grzbietowo-bocznej.</li>
	<li>Wykonać nacięcie pachwiny i odsłonić naczynia udowe; odizolować je dystalnie do poziomu gałęzi nadgennych i proksymalnie do poziomu więzadła pachwinowego.</li>
	<li>Utwórz kieszeń podskórną od pachwiny do grzbietowo-bocznej ściany brzucha dla wstawki przeszczepu (ryc. 4).</li>
	<li>Podwiązać naczynia dawcze i przepłukać przeszczep HTK.</li>
	<li>Wykonaj wstawkę przeszczepu w sposób odwrócony: Łopatka do skóry powinna być skierowana grzbietowo-bocznie, aby umożliwić łatwe monitorowanie immunologiczne w pozycji stojącej, a odcięte końce naczyń udowych są skierowane doogonowo, aby umożliwić zespolenia naczyniowe od końca do końca bez żadnego napięcia naczyń (ryc. 5).</li>
	<li>Jeśli to możliwe, użyj urządzenia do łączenia naczyń krwionośnych (Synovis, St Paul MN) do zespoleń żylnych (rozmiar 2,5-3,5 jest odpowiedni dla zwierząt o wadze 10-20 kg). To znacznie skraca czas niedokrwienia w porównaniu z konwencjonalnymi metodami.</li>
	<li>Wykonać zespolenia tętnicze konwencjonalną techniką szwów z szwem 9-0 (Synovis, St Paul MN)</li>
	<li>Po potwierdzeniu drożności naczyń zabezpiecz przeszczep na miejscu za pomocą szwów 3-0 PDS (ryc. 5). Mięśnie przeszczepu są przyszyte do mięśni ściany brzucha. Mięśnie przeszczepu nie powinny być przyszywane do mięśni uda biorcy, ponieważ może to być szkodliwe, gdy zwierzę porusza się po klatce.</li>
	<li>Zewnętrznie zewnętrzizować łopatkę skórną po stronie grzbietowo-bocznej w celu monitorowania immunologicznego (ryc. 6) i przyszyć ją do sąsiedniej skóry za pomocą szwów podskórnych 3-0 Vicryl i wchłanialnych przerywanych szwów skórnych 4-0 monofilamentowych.</li>
	<li>Zamknij skórę pachwiny warstwami za pomocą szwów podskórnych 3-0 Vicryl i wchłanialnych przerywanych szwów skórnych 4-0 monofilamentowych.</li>
	<li>Umieść plaster z fentanylem o stężeniu 50-100 mcg/h do znieczulenia pooperacyjnego.</li>
	<li>Po przeszczepie allogenu kończyn tylnych zwierzę po wybudzeniu i swobodnym oddychaniu wraca do kojca.</li>
</ol>

<ol><li>Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+bone+marrow-based+immunosuppression+inhibits+rejection+of+vascularized+composite+allografts+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates.</a> Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).</li>
<li>Brandacher, G., Gorantla, V. S., Schneeberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand%2FForearm+transplantation+using+a+novel+cell-based+immunomodulatory+protocol-experience+with+five+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hand/Forearm transplantation using a novel cell-based immunomodulatory protocol-experience with five patients.</a> Am. J. Transplant. 11, 190(2011).</li>
<li>Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+basic+and+translational+research+in+reconstructive+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation.</a> Birth Defects Res. C Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).</li>
<li>Brandacher, G., Lee, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Hand+Clin%22%5BJournal%5D)">Hand transplantation.</a> Hand Clin. 27, xiii-xiv (2011).</li>
<li>Hettiaratchy, S., Mendely, E., Randolph, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+to+composite+tissue+allografts+across+a+major+histocompatibility+barrier+in+miniature+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance to composite tissue allografts across a major histocompatibility barrier in miniature swine.</a> Transplantation. 27, 514-521 (2004).</li>
<li>Ibrahim, Z., Busch, J., Awwad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+physiologic+compatibilities+and+incompatibilities+between+human+and+porcine+organ+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems.</a> Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2005).</li>
<li>Kirk, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+bridge%3A+large+animal+models+in+translational+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research.</a> Immunol. Rev. 19, 176-196 (2003).</li>
<li>Lee, W. P., Rubin, J. P., Cober, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+swine+model+in+transplantation+of+vascularized+skeletal+tissue+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Use of swine model in transplantation of vascularized skeletal tissue allografts.</a> Transplant Proc. 30, 2743-2745 (1998).</li>
<li>Mathes, D. W., Hwang, B., Graves, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+to+vascularized+composite+allografts+in+canine+mixed+hematopoietic+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance to vascularized composite allografts in canine mixed hematopoietic chimeras.</a> Transplantation. 92 (12), 1301-1308 (2011).</li>
<li>Mathes, D. W., Randolph, M. A., Solari, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+tolerance+to+a+composite+tissue+allotransplant+in+a+swine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Split tolerance to a composite tissue allotransplant in a swine model.</a> Transplantation. 75 (1), 25-31 (2003).</li>
<li>Mezrich, J. D., Haller, G. W., Arn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histocompatible+miniature+swine%3A+an+inbred+largeanimal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Histocompatible miniature swine: an inbred largeanimal model.</a> Transplantation. 75 (6), 904-907 (2003).</li>
<li>Petruzzo, P., Lanzetta, M., Dubernard, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+International+Registry+on+Hand+and+Composite+Tissue+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation.</a> Transplantation. 90, 1590-1594 (2010).</li>
<li>Sucher, R., Lin, C., Zanoun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hind+limb+transplantation%3A+a+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).</li>
<li>Ustüner, E. T., Majzob, R. K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li>
<li>Ustüner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine%2Fmycophenolate+mofetil+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li>
<li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation%3A+a+translational+trial+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Historycznie rzecz biorąc, heterotopowy protokół przeszczepu kończyn tylnych obejmował eksterioryzację łopatki skórnej do brzusznej ściany brzucha, a naczynia były zespolene w sposób end-to-side (Hettiarachty 2004). Jednak w naszej zmodyfikowanej metodzie odwrócona klapa i zespolenia typu end-to-end przesuwają łopatkę skóry bardziej na boki, a tym samym ułatwiają monitorowanie odporności w pozycji stojącej zwierzęcia. Identyfikacja tętnicy łydkowej i stref maksymalnej perfuzji za pomocą angiografii laserowej w bliskiej p...

Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA), taka jak przeszczepy dłoni i twarzy, stała się rzeczywistością kliniczną z licznymi przeszczepami rąk i twarzy wykonywanymi na całym świecie12. Pomimo faktu, że wczesne i pośrednie wyniki są korzystne i bardzo zachęcające2, wymóg przewlekłej wielolekowej immunosupresji nadal ogranicza jej szerokie zastosowanie kliniczne. Postępy w mysich modelach VCA, w tym supermikrochirurgiczne zespolenia i techniki mankietów bez szwów13, 3, utorowały drogę do lepszego zrozumienia odpowiedzi alloimmunologicznych w VCA. Zaproponowano niezliczone protokoły immunomodulacyjne do zastosowań klinicznych w oparciu o nasze lepsze zrozumienie mechanizmów immunologicznych w VCA, ale muszą one zostać zweryfikowane na dużym modelu zwierzęcym, który byłby w rozsądny sposób przewidywał ich działanie u ludzi7. Opierając się na fizjologicznych i immunologicznych podobieństwach między układami narządów człowieka i świni6, modele VCA świń można uznać za wiarygodną i opłacalną alternatywę dla modeli u psów9 i naczelnych1.
Ten artykuł zawiera szczegółowy przegląd metodologii użytej w naszym zdefiniowanym przez MHC heterotopowym modelu przeszczepu kończyn tylnych świń, który służy jako podstawa dla naszych obecnych i przyszłych strategii immunomodulacyjnych mających na celu wywołanie tolerancji immunologicznej na VCA, a tym samym poszerzenie jej klinicznego zastosowania. Wykorzystujemy dobrze scharakteryzowane świnie wsobne wyhodowane do homozygotyczności w locus antygenu leukocytów świń specjalnie do ich wykorzystania w badaniach związanych z przeszczepami11. Podnosimy unaczyniony płat kostno-skórny oparty na naczyniach udowych. Płat zawiera nienaruszony unaczyniony szpik kostny w dystalnej części kości udowej i bliższej części kości piszczelowej. Przednio-przyśrodkowa skóra uda jest również włączona do przeszczepu i jest eksterioryczna do grzbietowo-bocznej części zwierzęcia biorcy w celu monitorowania immunologicznego najbardziej immunogennego składnika VCA. Ułożenie grzbietowo-boczne ułatwia badanie kliniczne w pozycji stojącej i siedzącej, a także utrzymuje skórę przeszczepu allogenicznego w stosunkowo czystej czystości.
Ustener et al. wprowadzili jeden z pierwszych dużych zwierzęcych modeli translacyjnych w VCA, przeszczepiając promieniowe płaty kostno-mięśniowo-skórne kończyn przednich u niekrewniaczych świń hodowlanych15. Grupa wykorzystała ten model, aby po raz pierwszy wykazać, że ostre odrzucenie VCA, które obejmowało wysoce immunogenny składnik skóry, można opóźnić i leczyć klinicznie istotną strategią bez znaczących powikłań i skutków ubocznych specyficznych dla leku. Korzystne wyniki uzyskane w tym badaniu stały się następnie kamieniem węgielnym w projektowaniu schematów leczenia do przeszczepów rekonstrukcyjnych u ludzi. Chociaż te wczesne modele VCA świń dobrze nadawały się do opracowywania protokołów zapobiegających odrzuceniu skóry, mięśni, kości, nerwów i naczyń, brakowało im wyspecjalizowanych struktur, takich jak chrząstka stawowa i błony maziowe stawów. Kolejne wysiłki koncentrowały się na uwzględnieniu przyśrodkowego palca zwierzęcia, co wymagało umieszczenia gipsu na całej długości, aby zapobiec przemieszczeniu się przeszczepu14. Chociaż model ten nadaje się do badania odrzucenia wszystkich głównych elementów przeszczepu kończyny, jednym z głównych ograniczeń tego modelu były trudności w ambulatoryjnej sytuacji po przeszczepie spowodowane umieszczeniem gipsu. W związku z tym stworzono heterotopowe modele allotransplantacji kończyn świń, składające się z kości piszczelowej, strzałkowej, stawu kolanowego, dystalnej kości udowej, otaczających mięśni i łopatki skórnej, aby przede wszystkim badać immunologiczne aspekty VCA, umożliwiając jednocześnie zwierzęciu swobodne poruszanie się po operacji z minimalnym zachorowalnością 8.
Rozwój dobrze scharakteryzowanych, zdefiniowanych przez SLA świń wsobnych dzięki pionierskiej pracy dr Davida H. Sachsa doprowadził do nowej ery translacyjnych badań VCA. Wykorzystując heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych w warunkach niewielkiego niedopasowania antygenowego, Mathes i wsp.10 wykazało nieograniczone przeżycie składników układu mięśniowo-szkieletowego po krótkim cyklu leczenia cyklosporyną. Przeżycie składników skóry było jednak wydłużone tylko w porównaniu z brakiem kontroli leczenia. Utratę składnika skórnego przeszczepu przypisano izolowanej i bardzo energicznej odpowiedzi immunologicznej, w szczególności na naskórek. Podobnie, przy użyciu w pełni niedopasowanych świń z wyczerpaniem limfocytów T, krótki cyklosporyna i cytokina mobilizowały komórki jednojądrzaste krwi obwodowej dawcy indukowały tolerancję tylko na składniki mięśniowo-szkieletowe, a składnik skórny był nadalodrzucany5. Zjawisko to, zwane "rozdwojoną tolerancją", przyniosło zmianę paradygmatu w badaniach nad VCA, z większym naciskiem na wysoce immunogenny składnik skóry, który jest integralnym składnikiem większości wykonanych do tej pory przeszczepów rekonstrukcyjnych.
W tym zmodyfikowanym modelu wykorzystujemy zespolenie typu end-to-end, podwiązując tętnicę udową biorcy i obracając ją w kierunku głowowym (Rysunek 1). To nie tylko skraca czas niedokrwienia, umożliwiając użycie konwencjonalnego urządzenia sprzęgającego, ale także zmniejsza ryzyko niepowodzenia zespolenia. Nie zaobserwowaliśmy żadnych zdarzeń niedokrwiennych po podwiązaniu tętnicy udowej u naszych biorców, co wskazywałoby, że krążenie oboczne było wystarczające do zapewnienia unaczynienia rodzimej nodze. Dodatkowo, w tej zmodyfikowanej metodzie, zewnętrzniony komponent skórny jest mobilizowany w oparciu o leżące poniżej naczynia perforacyjne i jest umieszczony bocznie (ryc. 1) w przeciwieństwie do brzusznego położenia pachwiny w tradycyjnym modelu10. Pozwala to na łatwą wizualizację przeszczepu w celu monitorowania odporności w pozycji stojącej lub siedzącej zwierzęcia.
Stąd niezawodny i powtarzalny duży model zwierzęcy jest niezbędny do zbadania strategii indukcji tolerancji w stosunku do składnika skórnego VCA i opracowania nowych nieinwazyjnych strategii monitorowania immunologicznego dla lepszego przewidywania przeżycia przeszczepu.

<table><tr><tbody><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>HTK</td><td>Custodial</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Electric Pen Drive</td><td>Synthes, Westchester PA</td><td>05.001.011</td><td>Piła szablasta</td></tr><tr><td>Urządzenie do sprzęgania naczyniowego</td><td>Synovis, Newtown PA</td><td>21003B</td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych świń do badań nad translacyjną unaczynioną allotransplantacją kompozytową (vca)

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA), taka jak przeszczepy dłoni i twarzy, stanowi realną opcję leczenia złożonych urazów mięśniowo-szkieletowych i wyniszczającej utraty tkanek. Pomimo korzystnych i bardzo zachęcających wczesnych i pośrednich wyników funkcjonalnych, odrzucenie wysoce immunogennego składnika skórnego VCA i potencjalne skutki uboczne przewlekłej wielolekowej immunosupresji nadal utrudniają powszechne zastosowanie kliniczne VCA. Dlatego badania w tej nowej dziedzinie muszą koncentrować się na badaniach translacyjnych związanych z unikalnymi cechami immunologicznymi VCA oraz na opracowaniu nowych strategii immunomodulacyjnych w zakresie immunomodulacji i indukcji tolerancji po VCA bez konieczności długotrwałej immunosupresji.
Ten artykuł opisuje niezawodny i powtarzalny translacyjny duży zwierzęcy model VCA, który składa się z płata kostno-skórnego w allotransplantacji heterotopowych kończyn tylnych świń zdefiniowanych przez MHC. Krótko mówiąc, dobrze unaczyniona łopatka skórna jest identyfikowana w przednio-przyśrodkowej okolicy uda za pomocą angiografii laserowej w bliskiej podczerwieni. Leżące poniżej mięśnie, staw kolanowy, dystalna część kości udowej i bliższa kość piszczelowa są pobierane na szypułce naczynia udowego. Ten przeszczep allogeniczny może być uważany zarówno za VCA, jak i unaczyniony przeszczep szpiku kostnego z jego unikalnymi cechami uprzywilejowanymi immunologicznie. Przeszczep jest przeszczepiany do podskórnej kieszonki brzusznej u zwierzęcia biorcy z elementem skóry zewnętrznie skierowanym do obszaru grzbietowo-bocznego w celu monitorowania immunologicznego.
Trzy zespoły chirurgiczne pracują jednocześnie w dobrze skoordynowany sposób, aby skrócić czas znieczulenia i niedokrwienia, poprawiając w ten sposób efektywność tego modelu i zmniejszając potencjalne czynniki zakłócające w protokołach eksperymentalnych. Model ten służy jako podstawa dla przyszłych strategii terapeutycznych mających na celu zmniejszenie i potencjalne wyeliminowanie potrzeby przewlekłej wielolekowej immunosupresji w VCA.

Wykonano dwadzieścia cztery heterotopowe przeszczepy kończyn tylnych świń zdefiniowane przez SLA, stosując naszą zmodyfikowaną technikę, przy średnim czasie niedokrwienia wynoszącym 78 min (zakres: 62-94 min). U wszystkich zwierząt bez trudności osiągnięto prawidłowe wszczepienie graftu oraz rozmieszczenie skórnego płata grzbietowo-bocznego. Angiografia laserowa w bliskiej podczerwieni wykazała doskonałe ukrwienie graftu u wszystkich biorców. Pierwszych dwanaście zespoleń żylnych wykonano przy użyciu konwencjonalnych tec...

Unaczynione allotransplantacje kompozytowe (VCA) stały się kliniczną rzeczywistością. Jednak szerokie zastosowanie kliniczne VCA jest ograniczone przez przewlekłą wielolekową immunosupresję. Autorzy prezentują wiarygodny i powtarzalny duży model zwierzęcy do tłumaczenia nowych strategii immunomodulacyjnych, które mogą zminimalizować lub potencjalnie wyeliminować potrzebę immunosupresji w VCA.

Zmodyfikowany heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych świń do badań nad translacyjną unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA)

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest stworzenie wiarygodnego i powtarzalnego translacyjnego modelu transplantacji kończyny dolnej u dużych zwierząt, zawierającego nienaruszoną unaczynioną szpik kostny, w celu badania wyników immunologicznych klinicznie istotnych protokołów immunomodulacyjnych. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie płata kostno-mięśniowo-skórnego w celu zbadania unikalnych cech immunologicznych komponentu skórnego w ramach unaczynionego przeszczepu złożonego (VCA) wraz z unaczynionym szpikiem kostnym. Następnie alloprzeszczep jest transplantowany do podskórnej kieszeni w ścianie brzusznej, co czyni ten model technicznie wykonalnym bez ograniczania lokomocji biorcy.Następnie komponent skóry zostaje wyeksponowany na boczno-grzbietową ścianę brzuszną, aby umożliwić monitorowanie przeszczepu poprzez bezpośrednią inspekcję wizualną zwierzęcia w pozycji stojącej. Wyniki pokazują, że jest to wiarygodny i powtarzalny model do testowania klinicznie istotnych protokołów immunomodulacyjnych z wykorzystaniem terapii komórkowych oraz czynników biologicznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi modelami, takimi jak modele VCA u psów i naczelnych, jest wyższa efektywność kosztowa, najniższe ryzyko zakażeń odzwierzęcych oraz dostępność zdefiniowanych szczepów dawcy i biorcy pod kątem SLA.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transplantologii rekonstrukcyjnej dotyczące unikalnej cechy przywileju immunologicznego unaczynionego szpiku kostnego i utoruje drogę do opracowania klinicznie istotnego protokołu immunomodulacyjnego, który zminimalizuje konieczność stosowania immunosupresji. Koncepcję tego modelu przeszczepu, w którym badaliśmy immunogenność różnych komponentów allograftu kończyny i wykazaliśmy zjawisko tolerancji podzielonej, opracowaliśmy prawie dwie dekady temu. Przed pobraniem allograftu kończyny świnię dawcę poddaje się sedacji i podłącza do respiratora w celu podawania izofluranu, fluoru i tlenu przez cały czas trwania procedury.Po ogoleniu, umyciu i zdezynfekowaniu pola operacyjnego, umieść zwierzę dawcę w pozycji grzbietnej na stole operacyjnym i przykryj je sterylnym obłożeniem. Następnie, wykorzystując angiografię laserową w bliskiej podczerwieni, zidentyfikuj perforatory skóry pośredniej. Potem wstrzyknij zieleń indocyjaninową w soli fizjologicznej poprzez obwodowy dostęp naczyniowy.Około 10 sekund później przeprowadź od 30 sekund do dwóch minut rejestracji w bliskiej podczerwieni. Następnie, na podstawie zidentyfikowanych perforatorów, wyznacz obszar skóry dla płata skórnego, który zostanie później wykorzystany do monitorowania odporności. Po sprawdzeniu głębokości znieczulenia zwierzęcia za pomocą odruchu powiekowego i odruchu na uciśnięcie palców, użyj skalpela, aby wykonać nacięcie skóry w pachwinie zgodnie z wyznaczeniami dla płata skórnego; odwarstw skórę i tkankę podskórną, zachowując obszar płata skórnego.Przyszyj brzegi skóry do leżących poniżej mięśni, aby zapobiec przykurczowi podczas pobierania płata. Następnie zidentyfikuj naczynia udowe i wyizoluj je bliżej niż poziom więzadła pachwinowego. Podwiąż gałęzie w odcinku dystalnym aż do poziomu skóry. Aby uzyskać optymalną długość czterech centymetrów, wykonaj osteotomię tuż nad stawem skokowym za pomocą piły reciprocating.Następnie należy użyć elektrokoagulacji w celu rozdzielenia mięśni w bliższym odcinku uda. Przetnij kość udową dawcy na poziomie środka trzonu, pozostawiając płat kostno-mięśniowo-skórny na naczyniowym płacie skóry. Płat ten obejmuje płat skóry z podścielającymi go mięśniami uda, dolną częścią kości udowej i staw kolanowy, górną częścią kości piszczelowej, a tym samym nienaruszony unaczyniony szpik kostny.Ze względu na unikalne cechy immunologiczne, należy utrzymywać przeperfuzjowany przeszczep dawcy na jego szypule naczyniowej do momentu przygotowania naczyń udowych biorcy. Natychmiast po rozpoczęciu nacięcia u dawcy, należy podłączyć świnię biorcę do respiratora i rozpocząć znieczulenie izofluranem, zgodnie z procedurą przeprowadzoną u świni dawcy. Należy wprowadzić cewnik do podawania soli fizjologicznej oraz podać buprenorfinę w ramach leczenia uprzedzającego oraz antybiotyki profilaktyczne.Umieść zwierzę w pozycji na plecach z dobrym dostępem do bocznej powierzchni grzbietowej i sprawdź poziom znieczulenia. Następnie wykonaj nacięcie w pachwinie, aby odsłonić naczynia udowe i wyizoluj je na odcinku od trzech do czterech centymetrów, dystalnie i proksymalnie względem poziomu więzadła pachwinowego. Następnie utwórz kieszeń podskórną od pachwiny do bocznej grzbietowej ściany brzucha w celu wszczepienia graftu.Następnie podwiąż naczynia dawcy i użyj roztworu histydyno-tryptofano-ketoglutaranu lub roztworu HTK do przepłukania tkanki przeszczepu. Jeśli jest to ostatni pobór od dawcy, natychmiast przeprowadź eutanazję zwierzęcia zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt, aby wykonać wszczepienie przeszczepu. Ułóż go w sposób odwrócony, tak aby przecięty koniec udowy był skierowany odpowiednio, co pozwoli na wykonanie anastomozy bez napięcia naczyń przy użyciu urządzenia do sprzęgania naczyniowego.Jeśli jest to możliwe, przygotuj zespolenie żylne. Urządzenie to znacząco skróci czas niedokrwienia. Następnie, używając szwów 8-0 i konwencjonalnej techniki szycia, wykonaj zespolenie tętnicze po potwierdzeniu drożności naczyniowej.Użyj trzech szwów OPDS, aby przymocować przeszczep, przyszywając mięśnie przeszczepu do mięśni ściany brzusznej biorcy w celu monitorowania odporności. Wyprowadź płat skóry po stronie grzbietowo-bocznej. Następnie zaszyj głębokie warstwy, używając trzech szwów Vicryl 3-0, a tkankę przyszyj do skóry biorcy za pomocą czterech szwów skórnych przerywanych, wchłanialnych, monofilamentowych 4-0.Na koniec zamknij skórę w pachwinie warstwowo, stosując szwy podskórne Vicryl 3-0, a następnie przerywane szwy skórne z wchłanialnego monofilamentu 4-0. W celu zapewnienia przeciwbólowej opieki pooperacyjnej, naklej zwierzęciu plaster z fentanylem 50 µg/h, gdy tylko zwierzę się obudzi i zacznie swobodnie oddychać samodzielnie.Zwróć zwierzę do zagrody i pozwól mu na jedzenie oraz picie wody ad libitum. Obserwuj zwierzę pod kątem oznak bólu lub stresu co cztery godziny przez pierwsze 24 godziny, a następnie dwa razy dziennie. Z zastosowaniem naszej zmodyfikowanej techniki wykonano 19 heterotopowych przeszczepów kończyn tylnych u świń zdefiniowanych pod kątem MHC.Przeszczepy te wykonano w celu opracowania strategii terapeutycznych mających na celu indukcję tolerancji immunologicznej w VCA. Model ten z powodzeniem wykorzystano do opracowania nowych strategii terapeutycznych w zakresie tolerancji immunologicznej w VCA z długoterminowym odrzutem; grupy kontrolne z wolnym przeżyciem wykazały przyspieszone odrzucanie przeszczepu po zaprzestaniu konwencjonalnej immunosupresji. Po opanowaniu techniki procedura ta może być przeprowadzona w czasie od jednej do dwóch godzin dla każdej kończyny dawcy oraz od dwóch do trzech godzin dla każdej procedury biorcy, jeśli jest wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że przeciwległa kończyna dawcy jest przeszczepiana do kieszeni w ścianie brzusznej biorcy w taki sposób, że kończyna prawa jest przeszczepiana do lewej pachwiny i odwrotnie po jej wykształceniu.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny transplantologii rekonstrukcyjnej do poszukiwania nowych protokołów immunomodulacyjnych, które mogą zminimalizować konieczność dożywotniej immunosupresji, a tym samym poprawić bilans korzyści i ryzyka tej innowacyjnej metody. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat aspektów technicznych heterotopowego przeszczepu kończyny tylnej zawierającego nienaruszoną unaczynioną szpik kostny. Ten niezawodny i powtarzalny model transplantacji kończyny umożliwi opracowanie nowych protokołów immunomodulacyjnych, które zminimalizują lub potencjalnie wyeliminują potrzebę przewlekłej wielolekowej immunosupresji.

a-modified-heterotopic-swine-hind-limb-transplant-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zmodyfikowany model przeszczepu kończyny tylnej świni heterotopowej dla translacyjnych badań nad przeszczepianiem złożonych tkanek unaczynnionej (VCA)

Aby zbadać łączoną allotransplantację narządów litych i unaczynionych kompozytów, opisujemy nowy heterotopowy model przeszczepu en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i serca u myszy przy użyciu techniki mankietu szyjki macicy bez szwów.

Nowatorski model mikrochirurgiczny do heterotopowego, en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i przeszczepu serca u myszy

Ten nowatorski model do ortotopowego przeszczepu kończyn tylnych u myszy, wykorzystujący technikę mankietu bez szwów do zespolenia supermikronaczyniowego, stanowi potężne narzędzie do mechanistycznych badań immunologicznych in vivo związanych z unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA).

Ortotopowy przeszczep kończyn tylnych u myszy

Obecnie każdy rodzaj unaczynionej allotransplantacji kompozytowej zależy od długotrwałej immunosupresji, co jest trudne do wsparcia w przypadku wskazań niekrytycznych dla życia. Przedstawiamy nowy model VCA kości piszczelowej świni, który można wykorzystać do badania VCA kości i zademonstrowania zastosowania angiogenezy chirurgicznej w celu utrzymania żywotności kości bez konieczności długotrwałej modulacji immunologicznej.

Angiogeneza chirurgiczna w allotransplantacji kości piszczelowej świń: nowy model allotransplantacji kompozytowej z unaczynionymi kośćmi dużych zwierząt

Unaczyniony kompozytowy przeszczep allogeniczny oferuje korzyści zmieniające życie biorcom przeszczepów, ale biologiczne przyczyny odrzucenia przeszczepu i waskulopatii pozostają słabo poznane. Przedstawiony tutaj model chirurgiczny gryzoni oferuje powtarzalny, klinicznie istotny model przeszczepu, umożliwiając naukowcom ocenę zdarzeń odrzucenia przeszczepu i potencjalnych strategii terapeutycznych zapobiegających ich wystąpieniu.

Zmodyfikowany heterotopowy model płata kostno-skórnego kończyn tylnych u szczura do translacyjnych badań nad allotransplantacją unaczynionych kompozytów

Ten protokół przedstawia solidny, powtarzalny model unaczynionego kompozytowego allotransplantu (VCA) nastawiony na jednoczesne badanie immunologii i funkcjonalnego odzyskiwania. Czas zainwestowany w skrupulatną technikę przeszczepu ortotopowego prawej kończyny tylnej w połowie uda z ręcznie szytymi zespoleniami naczyniowymi i koaaptacją neuronalną daje możliwość badania funkcjonalnej regeneracji.

Kolejny krok: ortotopowy model przeszczepu kończyn tylnych z koaaptacją neuronalną w celu maksymalizacji powrotu do sprawności u szczura

Ten artykuł przedstawia częściowy protokół heterotopowego przeszczepu płata kostno-skórnego u szczurów i jego potencjalne wyniki w obserwacji średnioterminowej.

Częściowy heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych u szczurów

Obecny protokół opisuje model płata powięziowo-skórnego świń i jego potencjalne zastosowanie w badaniach nad unaczynionymi tkankami kompozytowymi.

Niezawodny model płata powięziowo-skórnego świni do badań bioinżynieryjnych unaczynionych kompozytowych przeszczepów allogenicznych

Przedstawiamy powtarzalny model myszy heterotopowej allotransplantacji naczyń tylnych kończyn do szyi, unaczynionej allotransplantacji. Ten protokół supermikrochirurgiczny, obejmujący anastomozę naczyń o średnicy 0,3-0,5 mm, integruje naprowadzanie z włókna nylonowego oraz mankietowanie żylne. Stanowi wiarygodną platformę do badań translacyjnych nad tolerancją, uszkodzeniem niedokrwienia i reperfuzją oraz mechanizmami immunologicznymi w naczyniowej allotransplantacji złożonej.

Heterotopowa transplantacja kończyny tylnej do szyi u myszy: supermikrochirurgiczny model unaczynionej alotransplantacji kompozytowej

Technika jest demonstrowana dla procedury mikrochirurgicznej do heterotopowego przeszczepu serca u myszy, w tym uproszczone metody pobierania dawców i zespolenia naczyń biorców.

Zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy

W manuskrypcie opisano kroki wymagane do przeprowadzenia heterotopowego przeszczepu serca u myszy.

Mysia heterotopowa technika przeszczepu serca

Poznaj zmodyfikowany model heterotopowego przeszczepu kończyn tylnych świń z zachowanym unaczynionym szpikiem kostnym do badań nad immunomodulacją w transplantacji kompozytowej.

Zmodyfikowany heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych świń do badań nad translacyjną unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA) (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowany heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych świń do badań nad translacyjną unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA)

Przeglądaj więcej filmów