Name: Protein WISDOM: Stół warsztatowy do projektowania in silico de novo biomolekuł (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metody projektowania białek in silico z wykorzystaniem narzędzia Protein WISDOM. Naucz się optymalizacji sekwencji i walidacji stabilności w biologii obliczeniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CAF z wdzięcznością dziękuje za wsparcie ze strony NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736) oraz Amerykańską Agencję Ochrony Środowiska, EPA (R 832721-010). Część z tych badań była możliwa dzięki wsparciu rządowemu Departamentu Obrony, Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych. JS z wdzięcznością dziękuje za wsparcie ze strony NIH (P50GM071508-06). MLBP z wdzięcznością dziękuje za wsparcie ze strony National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. GAK z wdzięcznością dziękuje za wsparcie ze strony National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu o numerze DGE-1148900.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ramy projektowania białek de novo składają się z dwóch etapów: etapu wyboru sekwencji i etapu walidacji. Struktura jest wystarczająco solidna, aby poradzić sobie ze sztywnymi i elastycznymi szablonami projektowymi i może być stosowana do projektowania pojedynczych białek lub złożonych projektów białkowych. Ramy te zostały z powodzeniem zastosowane w wielu układach białkowych z zastosowaniem w dziesiątkach chorób. Wiele z tych projektów zostało zweryfikowanych eksperymentalnie, dostarczając najsilniejszych inhibi...

Projektowanie białek de novo to identyfikacja sekwencji białek, które dadzą pożądaną strukturę trzeciorzędową o ulepszonych właściwościach lub funkcji. Ponieważ natywnym fałdem białka jest konformacja, która leży na minimum energii swobodnej, projektowanie białek de novo poszukuje sekwencji, które będą miały minimum energii swobodnej w fałdzie docelowym. Problem ten został po raz pierwszy opisany przez Drexler1 i Pabo2 i był określany jako "problem odwrotnego składania". Jednak w przeciwieństwie do problemu fałdowania białek, w którym sekwencja może dać tylko jeden roztwór struktury pofałdowanej, problem projektowania białek de novo wykazuje degenerację. Wiele różnych sekwencji aminokwasów może dawać tę samą trzeciorzędową strukturę i funkcję.
Podczas gdy projektowanie białek tradycyjnie odbywało się eksperymentalnie poprzez racjonalne projektowanie i ukierunkowaną ewolucję, ostatnio zastosowano metody obliczeniowe, aby przezwyciężyć ograniczoną przestrzeń wyszukiwania właściwą metodom eksperymentalnym. Zastosowano różne metody obliczeniowe, w tym metody deterministyczne, metody stochastyczne i metody probabilistyczne. 3,4 Wczesne metody obliczeniowe wykorzystywały szablony o stałej sieci szkieletowej, aby ułatwić rozwiązanie problemu. 5-7 Wraz z pojawieniem się szybszych procesorów, wysokowydajnych systemów obliczeniowych i bardziej wydajnych algorytmów, elastyczność sieci szkieletowej została uwzględniona poprzez użycie zestawu szablonów stałej sieci szkieletowej8-14 lub poprzez włączenie prawdziwej elastyczności szkieletu poprzez wyrażenie szablonu w postaci zakresów odległości między atomami i kątów dwuściennych. 15,16
Ten artykuł szczegółowo opisuje Protein WISDOM, narzędzie online, które zostało udostępnione społeczności akademickiej w celu wykorzystania naszego obliczeniowego systemu projektowania białek de novo. Ramy te zostały zastosowane do projektowania wielu białek do zastosowań terapeutycznych ukierunkowanych na choroby takie jak HIV, rak, choroby dopełniacza i inne zaburzenia autoimmunologiczne. Wiele z przewidywanych peptydów zostało zweryfikowanych eksperymentalnie, co wykazało moc tej metody. Tabela 1 zawiera podsumowanie różnych białek, które zostały zaprojektowane, w tym wielkość białka lub peptydu, liczbę przewidywań i walidację eksperymentalną.
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Projektowanie białek</td>
			<td>Długość białka</td>
			<td># prognoz obliczeniowych</td>
			<td># walidacji eksperymentalnych</td>
			<td>odniesienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pełny projekt sekwencji ludzkiej beta-defensyny-2</td>
			<td>Rozdział 41</td>
			<td>340</td> szt.
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory komstatyny ludzkiego C3</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analogi kompstatyny, które wiążą się z C3c szczura</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analogi kompstatyny z rozszerzeniem di-seryny</td>
			<td>15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Struktura stabilizująca analogu compstatyny W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agoniści i antagoniści receptora C3a</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agoniści i antagoniści receptora C5a</td>
			<td>74 Rozdział 74</td>
			<td>61</td> szt.
			<td>2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory HIV-1 gp14</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory HIV-1 gp120</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory Bak Bcl-x L i Bcl-2</td>
			<td>16-18</td>
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory LSD1 i LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>Rozdział 41</td>
			<td>17/20</td> Pokój
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Podsumowanie zaprojektowanych białek i peptydów przy użyciu ram projektowania białek de novo. # przewidywań obliczeniowych jest przedstawiana jako liczba korzystnych przewidywań (tj. specyficzności krotności powyżej pewnego punktu odcięcia lub przybliżonego powinowactwa wiązania większego niż sekwencja natywna). # walidacji eksperymentalnych daje dwie liczby: pierwsza to liczba przewidywań, które zostały zweryfikowane eksperymentalnie, a druga to całkowita liczba przewidywań, które zostały przetestowane eksperymentalnie.
Projekt human-beta-defensin-2 (hβD-2) został wykonany w celu zwiększenia właściwości przeciwdrobnoustrojowych peptydu. 17 W tym projekcie rozważyliśmy dwa przypadki: 1) do 10 mutacji wzdłuż hβD-2 i 2) pełny projekt sekwencji wszystkich pozycji reszty hβD-2 z wyjątkiem cystein (8, 15, 20, 30, 37 i 38). W projekcie wykorzystano trzy różne szablony projektowe i trzy różne modele wyboru sekwencji. Zaobserwowano wysoki poziom podobieństwa mutacji między modelami średniej ważonej i modelu przedziału odległości zarówno dla projektu 10 mutacji, jak i projektu pełnej sekwencji. Ponadto stwierdzono, że duża liczba sekwencji ma korzystniejsze obliczone wartości swoistości krotności niż sekwencja natywna.
Inhibitory układu dopełniacza (C3, C3a i C5a) zostały zaprojektowane do zwalczania wielu chorób immunologicznych, takich jak udar, atak serca, choroba Alzheimera, astma, reumatoidalne zapalenie stawów, odrzucenie ksenotransplantacji, choroby układu oddechowego dorosłych, łuszczyca i choroba Leśniowskiego-Crohna. Trzy inhibitory C3c kompstatyny przewidywane przez ramy projektowania białek oraz trzy racjonalnie zaprojektowane sekwencje zostały eksperymentalnie potwierdzone jako lepsze spoiwa niż natywna compstatyna. Rozdział 18,19
Dalsze badania badały utratę aktywności kompstatyny przeciwko C3c innym niż naczelne i zaprojektowały szereg potencjalnych inhibitorów C3c dla szczurów i myszy. Wykazano, że pięć sekwencji ma korzystniejsze energie wolne od asocjacji ze szczurzym C3c niż mutant kompstatyny W4A9, o którym wiadomo, że hamuje C3c. Dzieje się tak za sprawą nowego mostka solnego utworzonego przez Arg1. 20 Przewidywano, że osiem sekwencji z N-końcowym rozszerzeniem będzie lepszymi spoiwami niż W4A9 z przedłużeniem di-seryny. Wreszcie, przewidywano, że 18 sekwencji kompstatyny stabilizuje związaną konformację W4A9, dostarczając silnych kandydatów na inhibitory C3c naczelnych i innych niż naczelne.
Oprócz inhibitorów C3c, agoniści i antagoniści receptora C3a i C5a zostali zaprojektowani na podstawie struktur C3a i C5a. Siedem sekwencji C3a przewidywanych przez model zostało przetestowanych eksperymentalnie. Dwie z tych sekwencji były silnymi agonistami, podczas gdy dwie inne były częściowymi agonistami. 21 Dwaj silni agoniści wykazali 58-krotną poprawę w stosunku do wcześniej odkrytego "superagonisty". Konstrukcja agonistów i antagonistów receptora C5a pozwoliła na stworzenie zestawu 61 sekwencji. Wszystkie sekwencje zostały zsyntetyzowane i okazało się, że dwie z nich są nowymi agonistami C5a.
Inhibitory fuzji HIV-1, wirusa wywołującego AIDS, zostały zaprojektowane, aby zapobiec infekowaniu komórek przez HIV-1. Pierwszy projekt był ukierunkowany na gp41, glikoproteinę otoczkową wirusa HIV-1. Ramy projektowania białek przewidywały sześć sekwencji, które były lepszymi spoiwami niż sekwencja natywna. Cztery z tych przewidywanych sekwencji zostały eksperymentalnie potwierdzone pod kątem hamowania HIV-1, przy czym najlepsza sekwencja miała IC50 tak niskie, jak 29 μM. Sekwencja ta wykazała 3-15-krotną poprawę w stosunku do sekwencji natywnej i nie miała utraty aktywności przeciwko szczepowi wirusa opornemu na enfuwirtyd. 22 Drugi projekt był ukierunkowany na gp120, inną glikoproteinę otoczkową HIV-1. Przewidywano, że czternaście sekwencji będzie spoiwami gp120 i zapewni dodatkowe potencjalne inhibitory fuzji HIV-1.
Liczne białka związane z rakiem stanowiły obiecujące cele dla terapii przeciwnowotworowych. Bcl-2 i Bcl-xL są białkami antyapoptotycznymi, które zapobiegają śmierci komórki. Inhibitory tych dwóch białek zostały zaprojektowane w celu indukowania śmierci komórek nowotworowych. Przewidywano, że dziesięć sekwencji będzie lepszymi spoiwami niż natywne, a wyniki te uchwyciły wcześniejsze wyniki eksperymentalne i mutagenezy. 23 Inne białko docelowe, ERK2, bierze udział w kaskadach transdukcji sygnału, co czyni je obiecującym celem w antyproliferacyjnych terapiach przeciwnowotworowych. Przewidywano, że dwadzieścia pięć sekwencji będzie inhibitorami ERK2.
Metylotransferazy histonowe i demetylazy dynamicznie kontrolują metylację histonów, która jest powiązana z wieloma typami raka, w tym prostatą, piersią, chłoniakiem, szpiczakiem, pęcherzem moczowym, okrężnicą, skórą, wątrobą, endometrium, płucami i żołądkiem. Ramy projektowania białek de novo zidentyfikowały 17 inhibitorów EZH2 (metylotransferazy lizyny) i stwierdzono, że spośród dziesięciu testowanych eksperymentalnie wszystkie hamują EZH2. 24 Najsilniejszy peptyd miał IC50 wynoszący około 13 μM, był równie skuteczny przy podwyższonych stężeniach enzymów i nie konkurował z kofaktorem. Peptydy te były pierwszym zestawem inhibitorów EZH2. 53 inhibitory LSD1 (demetylazy) zostały przewidziane przez ramy, a z 20 testowanych eksperymentalnie, 17 było inhibitorami LSD1, a 18 było inhibitorami LSD2. Najlepsze inhibitory miały wartości IC50 poniżej 1 μM, co czyni je najsilniejszymi inhibitorami peptydowymi odkrytymi do tej pory.
Ostatnie dwa systemy białkowe dostarczyły celów do leczenia różnych chorób autoimmunologicznych, takich jak celiakia, cukrzyca typu 1, toczeń rumieniowaty układowy, zespół Sjögrena, zespół Churga-Straussa, zapalenie tarczycy Hashimoto, choroba Gravesa-Basedowa, idiopatyczna plamica małopłytkowa, reumatoidalne zapalenie stawów i alergie. Żaden z tych potencjalnych inhibitorów nie został zweryfikowany eksperymentalnie, jednak ramy przewidywały sześć sekwencji, które wiążą się z HLA-DR1 i 13 sekwencji, które wiążą się z PNP.
Tabela 2 podsumowuje eksperymentalnie potwierdzone inhibitory i agonistów przewidywane przy użyciu struktury projektowania białek de novo. Przybliżona metryka powinowactwa wiązania została wykorzystana do przewidzenia dziewięciu sekwencji (inhibitorów ludzkiego C3c, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 i LSD2), podczas gdy metryka swoistości krotności została wykorzystana do identyfikacji czterech sekwencji (agonistów/antagonistów C3aR). Peptydy te podkreślają sukces ram projektowania białek de novo, w szczególności dodanego przybliżonego wskaźnika powinowactwa wiązania. Framework jest niezwykle wszechstronny w swoim zastosowaniu. Sześć różnych białek związanych z dwudziestoma pięcioma różnymi chorobami zostało z powodzeniem zaprojektowanych i zweryfikowanych eksperymentalnie.
<table border="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nazwa</td>
			<td>Silnik IC50</td>
			<td>Klasa EC50</td>
			<td>Białko docelowe</td>
			<td>Obowiązujące choroby</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ027</td>
			<td>0,94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c u ludzi</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">udar mózgu, atak serca, choroba Alzheimera, astma, reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy, stwardnienie rozsiane, łuszczyca, cukrzyca typu I, choroba Leśniowskiego-Crohna, zapalenie trzustki i mukowiscydoza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ086</td> powiedział:
			<td>1,98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c u ludzi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ059</td> powiedział:
			<td>4,73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c u ludzi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td> powiedział:
			<td> </td>
			<td>15,2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td> powiedział:
			<td> </td>
			<td>36,4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ007-5</td>
			<td>15,4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ002-5</td>
			<td>26,1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 gp41</td>
			<td>AIDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ037</td>
			<td>13,57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td> powiedział:
			<td colspan="1" rowspan="5">rak prostaty, piersi, chłoniaka, szpiczaka, pęcherza moczowego, okrężnicy, skóry, wątroby, endometrium, płuc i żołądka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td> powiedział:
			<td>0,521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>Przekaźnik LSD1</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td> powiedział:
			<td>0,249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>Przekaźnik LSD1</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał SQ026-1</td>
			<td>2,51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>Zobacz materiał LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td> powiedział:
			<td>1,332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>Zobacz materiał LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Peptydy przewidywane obliczeniowo i potwierdzone eksperymentalnie ukierunkowane na różne choroby.

protein wisdom: stół warsztatowy do projektowania in silico de novo biomolekuł

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Celem projektowania białek de novo jest znalezienie sekwencji aminokwasów, które złożą się w pożądaną trójwymiarową strukturę z poprawą specyficznych właściwości, takich jak powinowactwo wiązania, zachowanie agonisty lub antagonisty lub stabilność, w stosunku do natywnej sekwencji. Projektowanie białek leży w centrum obecnych postępów w projektowaniu i odkrywaniu leków. Projektowanie białek nie tylko dostarcza prognoz dla potencjalnie użytecznych celów leków, ale także poszerza naszą wiedzę na temat procesu fałdowania białek i interakcji białko-białko. Metody eksperymentalne, takie jak ewolucja ukierunkowana, okazały się skuteczne w projektowaniu białek. Jednak takie metody są ograniczone przez ograniczoną przestrzeń sekwencji, którą można przeszukiwać w sposób wykonalny. W przeciwieństwie do tego, strategie projektowania obliczeniowego pozwalają na przesiewanie znacznie większego zestawu sekwencji obejmujących szeroki zakres właściwości i funkcjonalności. Opracowaliśmy szereg obliczeniowych metod projektowania białek de novo, które są w stanie zająć się kilkoma ważnymi obszarami projektowania białek. Obejmują one projektowanie białek monomerycznych w celu zwiększenia stabilności i kompleksów w celu zwiększenia powinowactwa do wiązania.
Aby rozpowszechnić te metody do szerszego zastosowania, prezentujemy Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), narzędzie, które dostarcza zautomatyzowanych metod dla różnych problemów związanych z projektowaniem białek. Szablony konstrukcyjne są przesyłane w celu zainicjowania procesu projektowania. Pierwszym etapem projektowania jest etap wyboru sekwencji optymalizacyjnej, który ma na celu poprawę stabilności poprzez minimalizację energii potencjalnej w przestrzeni sekwencji. Wybrane sekwencje są następnie przeprowadzane przez etap specyficzności krotności i etap powinowactwa wiązania. Uporządkowana lista sekwencji dla każdego etapu procesu, wraz z odpowiednimi zaprojektowanymi strukturami, zapewnia użytkownikowi kompleksową ocenę ilościową projektu. W tym miejscu podajemy szczegóły każdej metody projektowania, a także kilka godnych uwagi sukcesów eksperymentalnych osiągniętych dzięki zastosowaniu tych metod.

De Novo Projektowanie inhibitorów wejścia dla HIV-1
Struktura projektowania de novo zaimplementowana w Protein WISDOM została wykorzystana do zaprojektowania peptydów inhibitorowych dla kilku istotnych układów terapeutycznych (Tabele 1 i 2). Jednym z istotnych przykładów jest projektowanie peptydów hamujących wniknięcie HIV-1 do receptora CD4 w komórce gospodarza, który posłuży tutaj jako reprezentatywny układ do zademonstrowania praktycznego zastosowania interf...

Opracowaliśmy obliczeniowe metody projektowania białek de novo, które są w stanie zająć się kilkoma ważnymi obszarami projektowania białek. Aby rozpowszechnić te metody, prezentujemy Protein WISDOM, internetowe narzędzie do projektowania białek (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Zaczynając od szablonu strukturalnego, można zaprojektować białka monomeryczne w celu zwiększenia stabilności i kompleksów w celu zwiększenia powinowactwa wiązania.

Protein WISDOM: Stół warsztatowy do projektowania in silico de novo biomolekuł

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest projektowanie białek lub peptydów o poprawionym fałdowaniu, wiązaniu lub właściwościach funkcjonalnych. Osiąga się to poprzez przesłanie struktury białka lub kompleksu oraz zdefiniowanie ograniczeń mutacyjnych i biologicznych. W drugim kroku, w celu zdefiniowania celu projektowego, przeprowadza się optymalizację wyboru sekwencji, co pozwala na uzyskanie dużej liczby możliwych sekwencji białek lub peptydów o poprawionej stabilności i właściwościach oddziaływania. Następnie następuje etap fałdowania.Obliczenia specyficzności i lub przybliżonego powinowactwa wiązania są przeprowadzane na zaprojektowanej sekwencji w celu walidacji zaprojektowanych białek lub peptydów pod kątem pożądanych, ulepszonych właściwości. Uzyskane wyniki wykazują ulepszone właściwości zaprojektowanych sekwencji na podstawie analizy obliczeniowej struktur wytworzonych w ramach procedury. Niniejszy protokół został opracowany w laboratorium profesora Chrisa Dolesa, flutysty na Uniwersytecie Princeton.Ten ogólny obliczeniowy protokół projektowania białek de novo pozwala na rozwiązywanie problemów w kilku istotnych obszarach projektowania białek. Należą do nich projektowanie białek monomerycznych w celu zwiększenia ich stabilności oraz kompleksów w celu zwiększenia powinowactwa wiązania. Osiągnęliśmy kilka znaczących sukcesów w projektowaniu w różnych obszarach terapeutycznych, w tym inhibitory H-I-V-G-P 41, inhibitory celujące w EZH two w terapii nowotworów oraz inhibitory celujące w składniki dopełniacza C3 A. Aby udostępnić metodologię projektowania białek szerszej społeczności akademickiej, opracowaliśmy interfejs internetowy o nazwie Protein Wisdom.Ten interfejs umożliwia użytkownikowi pełną kontrolę nad przesyłaniem szablonu, definiowaniem ograniczeń projektowych oraz określaniem parametrów metody, co pozwala na łatwe zastosowanie metod projektowania w szerokim zakresie problemów projektowych. Po rejestracji użytkownika w serwisie Protein Wisdom, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przesłać sekwencję białka i strukturę szablonu, klikając przycisk logowania użytkownika. Po rozpoczęciu eksperymentu projektowania białka użytkownikowi wyświetla się strona główna, na której znajduje się liczba przesłanych zadań, liczba przesłanych struktur oraz lista struktur przesłanych do tej pory. Rozpocznij nowe zadanie projektowe.Po kliknięciu przycisku utworz nowy projekt, użytkownik zostanie przeniesiony na stronę przesyłania projektów. Nadaj projektowi nazwę i wskaż, czy opiera się on na poprzednim projekcie. Kliknij kontynuuj.Prześlij strukturę białkową szablonu projektu. Szablon ten musi być w standardowym formacie Protein Data Bank lub PDB. Może to być szablon sztywny z jednym zestawem współrzędnych dla każdego atomu lub szablon elastyczny z wieloma modelami, np. uzyskanymi z struktur rozwiązanych metodą NMR.W przypadku projektowania pojedynczego białka może istnieć tylko jeden łańcuch. W sekcji szablonu użytkownik może przesłać nowy szablon lub wybrać spośród szablonów przesłanych wcześniej. Jeśli przesłano wiele szablonów, należy upewnić się, że każdy model rozpoczyna się od numeru modelu i kończy frazą end model.Upewnij się, że każdy resztowy aminokwas jest oznaczony naturalnym aminokwasem. Kliknij kontynuuj. Po pomyślnym przesłaniu i potwierdzeniu szablonu użytkownik zostanie przeniesiony na główną stronę sterowania.Na tej stronie użytkownik może sprawdzić status zadania, zmodyfikować zestawy mutacji oraz ograniczenia biologiczne, a następnie przesłać zadanie do pierwszego etapu wyboru sekwencji. Na tym etapie, ponieważ pierwszy etap nie został jeszcze zakończony, nie ma dostępnych opcji dla drugiego etapu. Pojawią się one po uzyskaniu wyników z pierwszego etapu.Następnie kliknij łącze zestawów mutacji (mutation sets) na głównej stronie sterowania, aby zdefiniować zestawy mutacji, wybrać reszty, które mogą ulec mutacji, oraz określić aminokwasy, na które mogą zostać zamutowane. Domyślnie dopuszczalne aminokwasy dla danej pozycji są wybierane na podstawie powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika (solvent accessible surface area) lub wymaganych zestawów mutacji SSA. Po wybraniu zestawów mutacji kliknij przycisk zapisz zmiany (save changes).Należy zwrócić uwagę na złożoność obliczeniową optymalizacji do rozwiązania. Górna granica dopuszczalnej złożoności obliczeniowej wynosi 20 do potęgi 25. Następnie należy kliknąć łącze ograniczeń biologicznych na głównej stronie sterowania, aby zdefiniować ograniczenia biologiczne, określając ograniczenia dotyczące ładunku lub zawartości aminokwasów dla całego białka lub ograniczonej części białka.Całkowita liczba mutacji, które mogą wystąpić w razie potrzeby; ograniczenia biologiczne są opcjonalne. Po zakończeniu powróć do głównej strony sterowania. Kliknij łącze rozpoczynające etap pierwszy, aby przejść do strony przesyłania etapu pierwszego.Wybierz łańcuch, aby określić liczbę sekwencji służących do wygenerowania pola sił zależnego od odległości oraz do obliczeń modelu. Szczegółowe informacje dotyczące tych wyborów znajdują się w protokole tekstowym. Po przesłaniu zadania użytkownik zostanie przekierowany z powrotem do głównej strony sterowania.Status zadania będzie aktualizowany, aby wskazać bieżący postęp jego realizacji. Po przesłaniu zadanie zostanie zablokowane do edycji. Po zakończeniu zadania użytkownik otrzyma wiadomość e-mail z wynikami, które stanowią listę zaprojektowanych sekwencji.Wyniki są również widoczne na głównej stronie sterowania. Na stronie pojawia się pole dotyczące specyficzności foldingu etapu drugiego, aby umożliwić użytkownikowi przeprowadzenie tej walidacji; w tym celu należy kliknąć „begin stage two fold specificity”. Aby przejść do strony budowy etapu drugiego, należy zdefiniować górne i dolne granice odległości między węglami alfa poprzez określenie współczynnika elastyczności matrycy, albo jako procent odległości, albo jako odległość stałą.Następnie należy zdefiniować górne i dolne granice kątów dla kątów dwuściennych PHI oraz bocznych. Po określeniu współczynnika elastyczności szablonu w procentach, kliknij przycisk zatwierdzenia, określ liczbę struktur do wygenerowania dla każdej sekwencji i kliknij Kontynuuj. Należy pamiętać, że górna granica liczby struktur do wygenerowania wynosi 500 na sekwencję.Następnie kliknij przycisk kontynuuj, aby potwierdzić chęć przesłania do walidacji sfałdowania. Etap pierwszy i drugi są zablokowane do edycji aż do zakończenia etapu drugiego. Po zakończeniu zadania użytkownik otrzyma wiadomość e-mail z wynikami, które są również widoczne na głównej stronie sterowania.W tym miejscu można przejrzeć i pobrać pliki tekstowe zawierające zaprojektowane sekwencje, odpowiadające im wartości energii z pierwszego etapu oraz wartości specyficzności zwijania z drugiego etapu. Ponadto użytkownik może kliknąć link „view results”, który wyświetla w przeglądarce tabelę z rankingami i wartościami energii z pierwszego etapu, a także rankingami i wartościami specyficzności zwijania z drugiego etapu. Przybliżone obliczenia powinowactwa wiązania są wykorzystywane do określenia powinowactwa zaprojektowanego białka ligandowego lub peptydowego do reszty kompleksu.Obliczenia te można przeprowadzić bezpośrednio po pierwszym etapie lub po zakończeniu obliczeń specyficzności zwijania. Aby rozpocząć, należy kliknąć numer sekwencji, aby ją wybrać. W celu rozpoczęcia obliczania przybliżonego powinowactwa wiązania użytkownik zostanie przekierowany na stronę wyboru sekwencji, na której znajduje się lista sekwencji projektowych wraz z ich rangami wyboru sekwencji i specyficzności zwijania.Po wybraniu i zapisaniu sekwencji użytkownik zostaje przekierowany do głównej strony sterowania. Następnie należy kliknąć „Begin stage two, approximate binding affinity”, aby wysłać zadanie; po jego zakończeniu wyniki zostaną przesłane do użytkownika pocztą elektroniczną w formie załącznika zawierającego numer sekwencji, przybliżone powinowactwo wiązania oraz wartości funkcji przejścia. W przypadku każdego kolejnego zadania dotyczącego przybliżonego powinowactwa wiązania, plik ten zawiera wyniki dla wszystkich ukończonych sekwencji.Pełne wyniki można również wyświetlić, przechodząc do głównej strony sterowania dla wyświetlanego zadania. Oto szablon projektowy dla inhibitorów wnikania HIV-1, który stanowi strukturę krystaliczną 14-członowego peptydnu sieciowanego w kompleksie z rdzeniem GP41. Peptyd szablonowy ten jest znanym silnym inhibitorem i został przekazany z usuniętym czynnikiem sieciującym.Po zdefiniowaniu parametrów wejściowych projektu system zostaje przekazany do pierwszego etapu selekcji sekwencji. Do posortowanych wyników selekcji sekwencji można uzyskać dostęp poprzez łącza wyświetlania wyników na głównej stronie zadania. Łącze to zapewnia łatwo czytelne podsumowanie wszystkich wyników obliczonych dla danego systemu, które można sortować według wyników dowolnego etapu.W celu szybkiej analizy wyniki można również zwizualizować za pomocą linku do wyników sekwencji, który przedstawia podsumowanie wybranych sekwencji w trójliterowym kodzie aminokwasowym. Trzecią opcją uzyskania dostępu do wyników jest link do wyników energii, który zawiera podsumowanie uruchomienia modelu optymalizacji z wybranymi sekwencjami, ich energią oraz czasem potrzebnym na rozwiązanie modelu. Po zakończeniu pierwszego etapu, czyli wyboru sekwencji i przesłania metod specyficzności składania oraz przybliżonego powinowactwa wiązania z drugiego etapu, dostęp do wyników oraz możliwość ich sortowania znajdują się w sekcji wyników w widoku podsumowania.Alternatywnie można je przeglądać pojedynczo w sekcji wyniki swoistości zwijania (fold Specificity Results); numer sekwencji oraz wartości swoistości zwijania są przedstawione w formie tablicy. Wyniki obliczeń przybliżonego powinowactwa wiązania próbek są prezentowane jako lista z możliwością sortowania. W sekcji przeglądaj wyniki (view results) wszystkie sekwencje, dla których przeprowadzono obliczenia przybliżonego powinowactwa wiązania, posiadają wyróżniony link w kolumnie widok (view). Link ten przenosi użytkownika na stronę z informacjami o projekcie.Na tej stronie znajdują się do pobrania pliki zip zawierające wszystkie wykorzystane struktury kompleksów i peptydów. W końcowym kroku projektowania struktur, zarówno dla kompleksów, jak i peptydów, przedstawiono 10 struktur o najniższej energii w formie listy uporządkowanej według rangi. Przy każdej strukturze znajduje się link do podglądu, który umożliwia użytkownikowi obejrzenie struktury w interaktywnym środowisku JM O.Dostępny jest również link do pobierania, który umożliwia użytkownikowi pobranie każdej struktury indywidualnie. Dalsze szczegóły wyników przedstawiono w sekcji wyników przybliżonego powinowactwa wiązania. Sekcja ta zawiera wartości funkcji partycji dla białka peptydowego i kompleksu, a także końcową wartość przybliżonego powinowactwa wiązania.Podczas pracy z protein wisdom należy pamiętać, że wybór ograniczeń projektowych może mieć znaczący wpływ na końcowe wyniki projektowania. Ograniczenia projektowe nie tylko przyspieszają ogólny proces przeszukiwania poprzez ograniczenie obszaru przestrzeni sekwencji, który muszą eksplorować algorytmy optymalizacji, ale wykorzystanie ograniczeń optymalizacji wynikających z informacji eksperymentalnych może prowadzić do uzyskania biologicznie istotnych projektów białek. Mamy nadzieję, że dostępność metod projektowania poprzez interfejs internetowy protein wisdom pozwoli na szersze zastosowanie tych metod.Kontynuujemy rozszerzanie i rozwój możliwości metod projektowania i mamy nadzieję, że w najbliższej przyszłości uogólnimy ten framework, aby obejmował systemy multimeryczne, oddziaływania białko-DNA oraz projektowanie z modyfikacjami potranslacyjnymi i niekanonicznymi aminokwasami. Każda kolejna rozbudowa, dzięki dostępności metod poprzez Protein Wisdom, umożliwi łatwe i efektywne zastosowanie ich przez społeczność akademicką.

protein-wisdom-workbench-for-silico-de-novo-design

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protein WISDOM: Stacja robocza do in silico de novo projektowania BioCząsteczek

Syntetyczne sekwencje białek oparte na motywach konsensusu zazwyczaj ignorują współewoluujące resztki, które implikują zależności interpozycyjne (IPD).  IPD mogą być niezbędne do działania, a projekty, które je ignorują, mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami.  Protokół ten wykorzystuje StickWRLD do identyfikacji IPD i pomaga w racjonalnym projektowaniu białek, co skutkuje bardziej wydajnymi wynikami.

Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Kluczową umiejętnością w modelowaniu biomolekularnym jest wyświetlanie i opisywanie aktywnych miejsc w białkach. Technika ta została zademonstrowana przy użyciu czterech popularnych darmowych programów do wizualizacji makromolekularnej: iCn3D, Jmol, PyMOL i UCSF ChimeraX.

Modelowanie miejsca aktywnego enzymu za pomocą darmowego oprogramowania do wizualizacji molekularnej

Ten protokół zapewnia podejście do optymalizacji receptur w stosunku do czynników badania mieszanego, ciągłego i kategorycznego, które minimalizuje subiektywne wybory w konstrukcji eksperymentalnego projektu. W fazie analizy stosowana jest skuteczna i łatwa w użyciu procedura modelowania dopasowania.

Przepływ pracy w celu optymalizacji formułowania nanocząstek lipidowych (LNP) przy użyciu zaprojektowanych eksperymentów z procesem mieszaniny i samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM)

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Projektowanie białek polega na budowie sekwencji aminokwasów i włączaniu określonych motywów w celu stworzenia funkcjonalnych wariantów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla opracowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) do zwalczania patogenów opornych na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę budowy białek z wykorzystaniem różnych narzędzi bioinformatycznych.

Zastosowanie I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, serwera HADDOCK i lorii HEX do projektowania białek De Novo i In Silico

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Przedstawiamy procedurę tworzenia samoorganizującej się monowarstwy z poli(glikolu etylenowego) (PEG-SAM) na podłożu krzemowym z mikroelektrodami złotymi. Warstwa PEG-SAM jest tworzona w jednym kroku i zapobiega biofoulingowi na powierzchniach krzemu oraz złota. Następnie wykorzystuje się elektroforezę do rozmieszczania biomolekuł w skali nanometrycznej.

Antyfouling samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do wzorcowania biomolekuł

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Poznaj metody projektowania białek in silico z wykorzystaniem narzędzia Protein WISDOM. Naucz się optymalizacji sekwencji i walidacji stabilności w biologii obliczeniowej.

Protein WISDOM: Stół warsztatowy do projektowania in silico de novo biomolekuł

Przeglądaj więcej filmów