Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest utworzenie komórek przypominających oocyty z somatycznych komórek macierzystych pochodzących ze skóry. Osiąga się to poprzez wykorzystanie czystych, niedróżnicowanych komórek macierzystych wyizolowanych ze skóry noworodka myszy. W drugim kroku komórki macierzyste są dysocjowane, co przygotowuje je do różnicowania.

Następnie komórki macierzyste wysiewa się na zdefiniowane podłoże różnicujące. Aby indukować powstawanie komórek linii zarodkowej, uzyskuje się wyniki wykazujące ekspresję markerów specyficznych dla oocytów w oparciu o półilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu.

Dzięki zapewnieniu zamkniętego systemu do badania komórek zarodkowych oraz ich formowania i rozwoju, wszystkie media wymagane w protokole powinny zostać przygotowane od dwóch do trzech godzin przed użyciem i umieszczone z poluzowaną zakrętką w inkubatorze do hodowli komórkowych, w którym będzie przeprowadzany eksperyment. Dwa rodzaje mediów zastosowane w tej procedurze to medium dla komórek macierzystych, składające się z D-M-A-M-F 12 uzupełnionego o B 27, BFGF i EGF, oraz medium do różnicowania komórek zarodkowych, składające się z M1 99 uzupełnionego o FSH, LH, B-S-A-I-T-S, pirogronian sodu, tuin i EGF, a komórki macierzyste wyizolowano z noworodka myszy.

Do różnicowania komórek linii zarodkowej in vitro wykorzystuje się przejścia od drugiego do czwartego. Ponieważ wydajność powstawania komórek przypominających cyty lub OLC jest bezpośrednio powiązana z jakością wyjściowych komórek macierzystych, najlepiej rozpocząć różnicowanie, gdy populacja wydaje się czysta i zdrowa, co zazwyczaj następuje około drugiego przejścia. Na 48 godzin przed rozpoczęciem różnicowania należy przeprowadzić subkulturę komórek macierzystych; za pomocą pipety serologicznej usunąć wszystkie zawieszone sferyczne agregaty komórkowe oraz zużyte medium z naczynia hodowlanego i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Ważne jest, aby zbierać wyłącznie zawieszone sferyczne agregaty komórek, a nie komórki przytwierdzone do dna naczynia, które ulegają spontanicznemu różnicowaniu.

Odwiruj komórki z prędkością 500 ×g przez pięć minut, odlej supernatant i resuspenduj komórki w 500 µL świeżej pożywki do komórek macierzystych. Podgrzej do 37 °C. Delikatnie pipetuj agregaty, aby częściowo rozdzielić komórki.

Nie pipetuj gwałtownie komórek, ponieważ zmniejszy to ich żywotność. Przemyj częściowo dysocjowane komórki 9,5 mililitrów świeżego, uprzednio ogrzanego medium do komórek macierzystych na 10 centymetrowym naczyniu hodowlanym o niskiej adhezji. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%CO2 na 48 godzin.

Aby rozpocząć procedurę różnicowania OLC, należy za pomocą pipety serologicznej przenieść komórki macierzyste z naczynia hodowlanego do probówki o pojemności 15 ml. Pozostawić wszelkie przytwierdzone komórki. Wirować komórki przy 500 ×g przez pięć minut, odrzucić nadsącz i resuspender komórki w 500 µL sterylnego PBS; energicznie pipetować komórki przy użyciu końcówki 1000 µL o szerokim otworze, tworząc skupiska nie większe niż od 10 do 20 komórek.

Dla powodzenia tego protokołu kluczowe jest regularne sprawdzanie stopnia dysocjacji, aby upewnić się, że w trakcie procesu uzyskano odpowiedni poziom. Okresowo należy pobrać niewielką ilość komórek i zbadać ją pod mikroskopem światła przechodzącego, aby potwierdzić, że zagregowane komórki tworzą skupiska od 10 do 20 pojedynczych komórek. Nie należy dopuścić do nadmiernej dysocjacji komórek, ponieważ spowoduje to obniżenie ich żywotności.

Następnie do rozdzielonych komórek dodaj 9,5 ml PBS i przenieś 15 µL tej zawiesiny komórkowej do hemocytometru w celu zliczenia komórek. Odwiruj komórki przy 500 ×g przez pięć minut. Po odlaniu supernatantu resuspenduj komórki w medium różnicującym do stężenia 1,32 × 10⁶ komórek/ml.

Przenieś komórki na płytkę, dodając 500 µL na każdą studzienkę płaskodنnej płytki 24-dołkowej do hodowli w zawiesinie. Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 48 godzin. Po 48 godzinach usuń 250 µL medium z każdej studzienki i przelej do odpowiednio oznakowanej probówki 1,5 ml.

Do każdej studzienki dodaj 250 µL świeżego medium do różnicowania, odwiruj zużyte medium przy 500 ×g przez pięć minut, odlej nadsącz i resuspender wszelkie zgranulowane komórki w 50 µL świeżego medium do różnicowania. Przenieś zawiesinę komórkową z powrotem do odpowiedniej studzienki hodowlanej na płytce do różnicowania. Co 48 godzin, aż do 12. dnia różnicowania, wymieniaj połowę medium w ten sam sposób.

W początkowej fazie różnicowania komórki przywierają do dna naczynia hodowlanego i rozprzestrzeniają się. Ten reprezentatywny obraz przedstawia komórki w 42. do 72. godzinie różnicowania, wykazujące obecność OCT4. Marker niezróżnicowanych komórek macierzystych zaznaczono kolorem zielonym, natomiast jądra komórkowe wybarwiono Hoechstem i zaznaczono kolorem niebieskim.

W miarę postępu różnicowania, niektóre agregaty komórkowe będą wykazywać obecność komórek pozytywnych pod kątem OCT four zaznaczonych na zielono, otoczonych przez komórki negatywne pod kątem OCT four. Pasek skali dla tego obrazu wynosi 100 microns. Rysunek ten przedstawia obraz w świetle białym struktury przypominającej pęcherzyk po oddzieleniu od powierzchni hodowli, pasek skali reprezentuje 40 microns.

Przy dalszej hodowli LCS urosną do średnicy około 45 micronów. Pasek skali na tym obrazie reprezentuje 10 micronów. Można zauważyć duże, pozytywne pod kątem OCT4 LCS, które są albo otoczone przez komórki, albo występują pojedynczo w hodowli.

Te LCS można zbierać wraz z komórkami wspierającymi lub poddać działaniu trypsyny, aby uzyskać LCS bez przytwierdzonych innych komórek. W celu potwierdzenia, że LCS wykazują ekspresję transkryptów podobnych do naturalnych miejsc OO, LCS zostały zebrane i przetestowane pod kątem ekspresji typowych markerów miejsc OO, takich jak Z-P-C-S-C-P three CMOs, T four BMP 15 oraz vasa. Rysunek ten przedstawia poziomy transkrypcyjne tych markerów w 10 LCS w stosunku do 10 oocytów nowonarodzonego myszy.

Wyniki wskazują, że LCS wykazują mniejszą ekspresję ZPC niż cytes. Ponieważ ZPC jest składnikiem specyficznej dla CYTE struktury błonowej zop lucidum, może to wyjaśniać kruchość oraz cieńszą błonę zita w LCS. Ekspresja białka mejozy SCP three jest wyższa w LCS w porównaniu do naturalnych cytes.

Niemniej jednak inny marker mejozy, CMOs, wykazuje niższy poziom ekspresji. Ta rozbieżność w poziomach ekspresji może częściowo wyjaśniać obecną niemożność LCS do ukończenia mejozy. Inne markery, takie jak BMP 15 i vasa, nie wykazują istotnych różnic między LCS a miejscami O.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że stan zdrowotny wyjściowej populacji komórek macierzystych ma krytyczne znaczenie dla powodzenia procesu.