Name: Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek macierzystych ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do oocytów in vitro. Technika ta umożliwia badanie biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PWD jest wspierane przez stypendium Canadian Institutes of Health Research (CIHR) oraz grant CIHR dla Geralda M. Kiddera na Western University. Autor pragnie również podziękować Julang Li z Uniwersytetu w Guelph za pomoc w opracowaniu przedstawionego tutaj protokołu.

1. Przygotowanie mediów	
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę na 2-3 godziny przed użyciem i umieść z poluzowaną nakrętką w inkubatorze do hodowli komórkowych, w którym będzie się odbywał eksperyment. Nośniki używane w niniejszym protokole:
			<ol>
				<li>Przygotować pożywkę z komórek macierzystych składającą się z DMEM/F12 uzupełnioną 1 x B27, 40 ng/ml bFGF i 20 ng/ml EGF.</li>			 
				<li>Przygotować pożywkę do różnicowania komórek rozrodczych składającą się z m199 uzupełnionego 0,05 j.m. FSH, 0,03 j.m. LH, 3 mg/ml BSA, 5 μl/ml ITS, 0,23 mM pirogronianu sodu, 1 mg/ml fetuiny i 1 ng/ml EGF. Pożywka bazowa składająca się ze wszystkich dodatków, ale z pominięciem FSH, LH i EGF, może być przygotowana i przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>			
			</ol>
		</li>	
	</ol>
	2. Przygotowanie hodowli komórek macierzystych	
	<ol>
		<li>Wyizoluj komórki macierzyste od nowonarodzonych młodych myszy, jak opisano wcześniej12. Wykorzystaj komórki macierzyste w pasażu 2-4 do różnicowania komórek rozrodczych in vitro. Efektywność tworzenia OLC jest bezpośrednio związana z jakością wyjściowych komórek macierzystych. Najlepiej jest rozpocząć różnicowanie, gdy tylko populacja wydaje się czysta i zdrowa, co zwykle ma miejsce około pasażu 2. Dalsza hodowla komórek macierzystych po pasażu 2 negatywnie wpływa na efektywność tworzenia OLC (wyniki niepublikowane).</li>	 
	 <li>48 godzin przed rozpoczęciem subhodowli różnicowania komórek macierzystych. Usunąć wszystkie zawieszone kuliste agregaty komórek i zużyte pożywki z naczynia hodowlanego za pomocą pipety serologicznej i umieścić w probówce o pojemności 15 ml. Ważne jest, aby zbierać tylko zawieszone kuliste agregaty komórek, a nie komórki przyczepione do dna naczynia, które spontanicznie się różnicują.</li>	 
	 <li>Osadzać komórki w masie 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 500 μl świeżej pożywki z komórek macierzystych ogrzanej do temperatury 37 °C. Delikatnie pipetować agregaty, aby częściowo oddzielić komórki. Nie należy agresywnie pipetować komórek, ponieważ zmniejszy to ich żywotność. Umyj częściowo zdysocjowane komórki w 9,5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki z komórek macierzystych na naczyniu do hodowli komórkowych o niskim nasadce o średnicy 10 cm.</li>	 
	 <li>Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 48 godzin przed rozpoczęciem różnicowania.</li>	
	</ol>
	3. Różnicowanie OLC	
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej usunąć komórki macierzyste z szalki hodowlanej i umieścić w probówce o pojemności 15 ml, pozostawiając wszelkie przyczepione komórki. Osadzać komórki w stężeniu 500 x g i ponownie zawiesić w 500 μl sterylnego PBS. Energicznie pipetować komórki za pomocą końcówki o szerokim otworze 1 000 μl w grudki nie większe niż 10-20 komórek. Okresowo usuwaj niewielką ilość komórek podczas dysocjacji i sprawdzaj pod mikroskopem światła białego, aby potwierdzić, że zagregowane komórki znajdują się w kępkach 10-20 pojedynczych komórek. Nadmierna dysocjacja spowoduje zmniejszoną żywotność komórek.</li>	 
		<li>Dodać 9,5 ml PBS do zdysocjowanych komórek i dodać 15 μl tej zawiesiny komórek do hemocytometru w celu zliczenia komórek. Granulować komórki w rozmiarze 500 x g przez 5 minut.</li>	 
	 <li>Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1,32X106 komórek/ml w pożywce różnicowej.</li>	 
	 <li>Płytki na płytki komórek, dodając 500 μl na studzienkę do naczynia na zawiesinę z płaskim dnem 24-dołkowym.</li>	 
	 <li>Umieścić 24-dołkową szalkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 48 godzin. Usunąć 250 μl pożywki z każdej studzienki i umieścić w odpowiednio oznakowanej probówce o pojemności 1,5 ml. Do każdego dołka dodać 250 μl świeżej pożywki różnicującej. Odwirować zużytą pożywkę o sile 500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić wszystkie granulowane komórki w 50 μl świeżej pożywki różnicującej i powrócić do odpowiedniej hodowli na płytce różnicującej.</li>	 
	 <li>Co 48 godzin zmieniaj połowę podłoża do 12 dnia różnicowania.</li>	
	</ol>

<ol><li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth%2C+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li>
<li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li>
<li>Lawson, K. A., Hage, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+origin+of+primordial+germ+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse.</a> Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).</li>
<li>Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation.</a> Development. 110, 521-528 (1990).</li>
<li>Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocytes+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells.</a> Science. 300, 1251-1256 (2003).</li>
<li>Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+can+form+germ+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).</li>
<li>Wang, L., Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-like+Cells+Induced+from+Mouse+Spermatogonial+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells.</a> Cell Biosci. 2, 27(2012).</li>
<li>Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+germline+potential+of+stem+cells+derived+from+fetal+porcine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin.</a> Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).</li>
<li>Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocyte-like+cells+from+a+clonal+pancreatic+stem+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line.</a> Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).</li>
<li>Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP15+gene+is+activated+during+human+amniotic+fluid+stem+cell+differentiation+into+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells.</a> DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).</li>
<li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+porcine+multipotent+stem%2Fstromal+cells+derived+from+skin%2C+adipose%2C+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li>
<li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339(2011).</li>
<li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263(2009).</li>
<li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Do tej pory funkcjonalne OLC nie zostały opracowane przy użyciu testu całkowicie in vitro. Niedawne badanie przeprowadzone przez Hayashi i wsp. było w stanie wyprodukować potomstwo z komórek podobnych do PGC utworzonych in vitro i przeniesionych in vivo w celu dalszego rozwoju14. Zaczynając od komórek ES lub indukowanych komórek pluripotencjalnych, były one w stanie tworzyć komórki podobne do PGC, które po odzyskaniu po przeszczepieniu in vivo były w stanie dojrzeć,...

Podczas wczesnej embriogenezy, gametogeneza zachodzi poprzez szereg etapów, w tym tworzenie pierwotnych komórek rozrodczych (PGC), migrację i w końcu kolonizację grzbietów gonad. W tym czasie PGC ulegają proliferacji i różnicowaniu w coraz bardziej dojrzałe gamety 1. Fakt, że PGC migrują z podstawy allantois do zarodka jelita tylnego, a na końcu wzdłuż ściany grzbietowej, ostatecznie kolonizując grzbiety gonad, sprawia, że są one niezwykle trudne do zbadania 2. Pomimo postępów w tej dziedzinie, badania mające na celu zrozumienie powstawania i różnicowania PGC były utrudnione ze względu na ich ograniczoną liczbę, lokalizację i charakter migracyjny 3,4. 	
	W ostatnich latach wykazano, że embrionalne komórki macierzyste mają potencjał do tworzenia komórek rozrodczych in vitro 5,6. Podobnie, wykazano również, że kilka somatycznych komórek macierzystych ma potencjał do tworzenia komórek rozrodczych po hodowli in vitro 7-11. Niedawno komórki macierzyste wyizolowane ze skóry nowonarodzonych myszy zróżnicowano in vitro w komórki rozrodcze i oocyty we wczesnym stadium rozwoju 12. W trakcie różnicowania zwiększył się podzbiór komórek macierzystych wykazujących ekspresję Oct4 i powstały struktury przypominające kompleksy wzgórek-oocyt. Komórki podobne do oocytów (OLC) można pobrać z kultur i porównać z naturalnymi oocytami. Za pomocą tej metody hodowli uzyskuje się OLC o wielkości 40-45 μm, które wyrażają podobne markery do oocytów, takich jak Gdf9b, VASA i DAZL. Do tej pory powstałe OLC nie są w stanie dojrzeć ani zostać zapłodnione 12.	
	Chociaż OLC nadal nie są w stanie funkcjonować, protokół używany do tworzenia tych OLC może nadal być użyteczny jako test do badania powstawania i rozwoju komórek rozrodczych na wczesnym etapie w zamkniętym systemie in vitro. W oryginalnej publikacji omawiającej tworzenie OLC z somatycznych komórek macierzystych wykorzystano skórę płodu świni jako źródło komórek macierzystych 8. Rozszerzając to badanie, wykazano, że komórki podobne do PGC, które powstały wcześnie podczas indukowanego różnicowania, są prekursorami OLC i wyrażają takie markery PGC, jak OCT4, VASA, STELLA, C-KIT i DAZL 13. Dane te potwierdzają potencjał wykorzystania tego systemu do badania powstawania i różnicowania komórek rozrodczych in vitro. Protokół wykorzystany do tworzenia OLC ze skóry nowonarodzonej myszy zostanie zademonstrowany w tym artykule wideo. Protokół ten oferuje model in vitro do badania rozwoju komórek rozrodczych, który może dostarczyć środków do wyjaśnienia czynników ważnych dla ich proliferacji i różnicowania.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>925</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia 10 cm</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>15 ml dętki</td><td>BD</td><td>352095</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Badanie powstawania i różnicowania komórek rozrodczych było tradycyjnie bardzo trudne ze względu na małą liczbę komórek i ich lokalizację głęboko w rozwijających się zarodkach. Dostępność "zamkniętego" systemu opartego na in vitro może okazać się nieoceniona dla naszego zrozumienia gametogenezy. Tworzenie komórek podobnych do oocytów (OLC) z somatycznych komórek macierzystych, wyizolowanych ze skóry nowonarodzonych myszy, zostało zademonstrowane i może być wizualizowane w tym protokole wideo. Powstałe OLC wyrażają różne markery zgodne z oocytami, takimi jak Oct4 , Vasa , Bmp15 i Scp3. Jednak pozostają niezdolne do dojrzewania lub zapłodnienia z powodu nieukończenia mejozy. Protokół ten zapewni system, który jest przydatny do badania wczesnego etapu powstawania i różnicowania się komórek rozrodczych w bardziej dojrzałe gamety. Podczas wczesnego różnicowania liczba komórek wykazujących ekspresję Oct4 (potencjalne komórki rozrodcze) osiąga ~5%, jednak obecnie tworzenie OLC pozostaje stosunkowo nieefektywne. Protokół jest stosunkowo prosty, chociaż należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że początkowa populacja komórek jest zdrowa i we wczesnym okresie przejścia.

Początkowo komórki przywierają do dna naczynia hodowlanego i rozprzestrzeniają się. W 42-72 godzinie różnicowania tworzą się i proliferują małe, zawieszone komórki wykazujące pozytywną ekspresję OCT4 (Rycina 1A). Wkrótce po pojawieniu się tych komórek większość z nich znika, a komórki przywierające tworzą gęste agregaty kolonii na dnie hodowli. Po kilku dniach agregaty te odrywają się od powierzchni hodowli. W niektórych z tych agregatów można zaobserwować dużą komórkę (Rycina 1b i <stro...

W ostatnich latach tworzenie komórek rozrodczych przy użyciu metod hodowli in vitro zostało zademonstrowane przy użyciu kilku różnych typów somatycznych komórek macierzystych. W tym artykule wizualnie przedstawimy różnicowanie nowonarodzonych komórek macierzystych pochodzących od myszy do wczesnych komórek podobnych do oocytów.

Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest utworzenie komórek przypominających oocyty z somatycznych komórek macierzystych pochodzących ze skóry. Osiąga się to poprzez wykorzystanie czystych, niedróżnicowanych komórek macierzystych wyizolowanych ze skóry noworodka myszy. W drugim kroku komórki macierzyste są dysocjowane, co przygotowuje je do różnicowania.Następnie komórki macierzyste wysiewa się na zdefiniowane podłoże różnicujące. Aby indukować powstawanie komórek linii zarodkowej, uzyskuje się wyniki wykazujące ekspresję markerów specyficznych dla oocytów w oparciu o półilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu.Dzięki zapewnieniu zamkniętego systemu do badania komórek zarodkowych oraz ich formowania i rozwoju, wszystkie media wymagane w protokole powinny zostać przygotowane od dwóch do trzech godzin przed użyciem i umieszczone z poluzowaną zakrętką w inkubatorze do hodowli komórkowych, w którym będzie przeprowadzany eksperyment. Dwa rodzaje mediów zastosowane w tej procedurze to medium dla komórek macierzystych, składające się z D-M-A-M-F 12 uzupełnionego o B 27, BFGF i EGF, oraz medium do różnicowania komórek zarodkowych, składające się z M1 99 uzupełnionego o FSH, LH, B-S-A-I-T-S, pirogronian sodu, tuin i EGF, a komórki macierzyste wyizolowano z noworodka myszy.Do różnicowania komórek linii zarodkowej in vitro wykorzystuje się przejścia od drugiego do czwartego. Ponieważ wydajność powstawania komórek przypominających cyty lub OLC jest bezpośrednio powiązana z jakością wyjściowych komórek macierzystych, najlepiej rozpocząć różnicowanie, gdy populacja wydaje się czysta i zdrowa, co zazwyczaj następuje około drugiego przejścia. Na 48 godzin przed rozpoczęciem różnicowania należy przeprowadzić subkulturę komórek macierzystych; za pomocą pipety serologicznej usunąć wszystkie zawieszone sferyczne agregaty komórkowe oraz zużyte medium z naczynia hodowlanego i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Ważne jest, aby zbierać wyłącznie zawieszone sferyczne agregaty komórek, a nie komórki przytwierdzone do dna naczynia, które ulegają spontanicznemu różnicowaniu.Odwiruj komórki z prędkością 500 ×g przez pięć minut, odlej supernatant i resuspenduj komórki w 500 µL świeżej pożywki do komórek macierzystych. Podgrzej do 37 °C. Delikatnie pipetuj agregaty, aby częściowo rozdzielić komórki.Nie pipetuj gwałtownie komórek, ponieważ zmniejszy to ich żywotność. Przemyj częściowo dysocjowane komórki 9,5 mililitrów świeżego, uprzednio ogrzanego medium do komórek macierzystych na 10 centymetrowym naczyniu hodowlanym o niskiej adhezji. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%CO2 na 48 godzin.Aby rozpocząć procedurę różnicowania OLC, należy za pomocą pipety serologicznej przenieść komórki macierzyste z naczynia hodowlanego do probówki o pojemności 15 ml. Pozostawić wszelkie przytwierdzone komórki. Wirować komórki przy 500 ×g przez pięć minut, odrzucić nadsącz i resuspender komórki w 500 µL sterylnego PBS; energicznie pipetować komórki przy użyciu końcówki 1000 µL o szerokim otworze, tworząc skupiska nie większe niż od 10 do 20 komórek.Dla powodzenia tego protokołu kluczowe jest regularne sprawdzanie stopnia dysocjacji, aby upewnić się, że w trakcie procesu uzyskano odpowiedni poziom. Okresowo należy pobrać niewielką ilość komórek i zbadać ją pod mikroskopem światła przechodzącego, aby potwierdzić, że zagregowane komórki tworzą skupiska od 10 do 20 pojedynczych komórek. Nie należy dopuścić do nadmiernej dysocjacji komórek, ponieważ spowoduje to obniżenie ich żywotności.Następnie do rozdzielonych komórek dodaj 9,5 ml PBS i przenieś 15 µL tej zawiesiny komórkowej do hemocytometru w celu zliczenia komórek. Odwiruj komórki przy 500 ×g przez pięć minut. Po odlaniu supernatantu resuspenduj komórki w medium różnicującym do stężenia 1,32 × 10⁶ komórek/ml.Przenieś komórki na płytkę, dodając 500 µL na każdą studzienkę płaskodنnej płytki 24-dołkowej do hodowli w zawiesinie. Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 48 godzin. Po 48 godzinach usuń 250 µL medium z każdej studzienki i przelej do odpowiednio oznakowanej probówki 1,5 ml.Do każdej studzienki dodaj 250 µL świeżego medium do różnicowania, odwiruj zużyte medium przy 500 ×g przez pięć minut, odlej nadsącz i resuspender wszelkie zgranulowane komórki w 50 µL świeżego medium do różnicowania. Przenieś zawiesinę komórkową z powrotem do odpowiedniej studzienki hodowlanej na płytce do różnicowania. Co 48 godzin, aż do 12. dnia różnicowania, wymieniaj połowę medium w ten sam sposób.W początkowej fazie różnicowania komórki przywierają do dna naczynia hodowlanego i rozprzestrzeniają się. Ten reprezentatywny obraz przedstawia komórki w 42. do 72. godzinie różnicowania, wykazujące obecność OCT4. Marker niezróżnicowanych komórek macierzystych zaznaczono kolorem zielonym, natomiast jądra komórkowe wybarwiono Hoechstem i zaznaczono kolorem niebieskim.W miarę postępu różnicowania, niektóre agregaty komórkowe będą wykazywać obecność komórek pozytywnych pod kątem OCT four zaznaczonych na zielono, otoczonych przez komórki negatywne pod kątem OCT four. Pasek skali dla tego obrazu wynosi 100 microns. Rysunek ten przedstawia obraz w świetle białym struktury przypominającej pęcherzyk po oddzieleniu od powierzchni hodowli, pasek skali reprezentuje 40 microns.Przy dalszej hodowli LCS urosną do średnicy około 45 micronów. Pasek skali na tym obrazie reprezentuje 10 micronów. Można zauważyć duże, pozytywne pod kątem OCT4 LCS, które są albo otoczone przez komórki, albo występują pojedynczo w hodowli.Te LCS można zbierać wraz z komórkami wspierającymi lub poddać działaniu trypsyny, aby uzyskać LCS bez przytwierdzonych innych komórek. W celu potwierdzenia, że LCS wykazują ekspresję transkryptów podobnych do naturalnych miejsc OO, LCS zostały zebrane i przetestowane pod kątem ekspresji typowych markerów miejsc OO, takich jak Z-P-C-S-C-P three CMOs, T four BMP 15 oraz vasa. Rysunek ten przedstawia poziomy transkrypcyjne tych markerów w 10 LCS w stosunku do 10 oocytów nowonarodzonego myszy.Wyniki wskazują, że LCS wykazują mniejszą ekspresję ZPC niż cytes. Ponieważ ZPC jest składnikiem specyficznej dla CYTE struktury błonowej zop lucidum, może to wyjaśniać kruchość oraz cieńszą błonę zita w LCS. Ekspresja białka mejozy SCP three jest wyższa w LCS w porównaniu do naturalnych cytes.Niemniej jednak inny marker mejozy, CMOs, wykazuje niższy poziom ekspresji. Ta rozbieżność w poziomach ekspresji może częściowo wyjaśniać obecną niemożność LCS do ukończenia mejozy. Inne markery, takie jak BMP 15 i vasa, nie wykazują istotnych różnic między LCS a miejscami O.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że stan zdrowotny wyjściowej populacji komórek macierzystych ma krytyczne znaczenie dla powodzenia procesu.

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowo narodzonego mysiego szczura w komórki przypominające komórki zarodkowe in vitro

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Opisujemy sekcję i hodowlę ex vivo skóry embrionalnej myszy. System hodowli utrzymuje granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni tkanki i umożliwia obrazowanie pod mikroskopem odwróconym. Melanoblasty, składnik rozwijającej się skóry, są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala na obserwację ich zachowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Hodowla skóry embrionalnej myszy i obrazowanie na żywo migracji melanoblastów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Poznaj metodę różnicowania komórek macierzystych ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do oocytów in vitro. Technika ta umożliwia badanie biologii rozrodu.

Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Przeglądaj więcej filmów