Name: Użyteczność specyficznej dla etapu izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-02T20:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności oogenezy. Technika umożliwia analizy molekularne, obrazowanie na żywo oraz badania in vitro dynamiki cytoszkieletu i procesów morfologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Thomasowi Lecuit (sqh-Utrophin::GFP line), Bloomington Stock Center oraz Developmental Studies Hybridoma Bank za odczynniki. Również dziękujemy wszystkim członkom Tootle Lab za pomocne dyskusje i krytykę manuskryptu. Finansowanie z National Science Foundation MCB-1158527 oraz fundusze startowe z Wydziału Anatomii i Biologii Komórki Uniwersytetu Iowa wsparły te prace. Grant na szkolenie przeddoktoranckie w dziedzinie nauk farmakologicznych T32GM067795 National Institutes of Health wspierał AJS. Wsparcie w zakresie przechowywania danych zostało zapewnione przez ICTS, które jest finansowane przez CTSA wspierane przez National Center for Research Resources i National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, poprzez Grant UL1RR024979.

1. Przygotowanie Drosophila przed etapem izolacji
<ol>
	<li>Przygotuj mokrą pastę drożdżową, łącząc 50 g aktywnych suchych drożdży z 90 ml wody destylowanej. Wymieszaj szpatułką do połączenia. Pozostaw mieszaninę na ~ 30 minut przed oceną konsystencji. Konsystencja powinna być na tyle gęsta, aby przylegała do boku fiolki z muchami, ale nie spływała po boku. Aby uzyskać pożądaną konsystencję, może być konieczne dodanie do 10 ml dodatkowej wody lub niewielkiej ilości suchych drożdży. Przechowywać w zakrytym pojemniku w temperaturze 4 °C. Przechowywane drożdże można stosować przez ~1-2 tygodnie.</li>
	<li>Zbierz <24-godzinne dorosłe muchy (zarówno samce, jak i samice) o pożądanych genotypach i umieść je w fiolce z pokarmem dla much oraz mokrą pastą drożdżową rozsmarowaną z boku fiolki. Temperatura, w której utrzymywane są muchy, będzie się różnić w zależności od eksperymentu. W przypadku rutynowych eksperymentów muchy są utrzymywane w temperaturze pokojowej. Natomiast eksperymenty, w których gen ulega nadekspresji przy użyciu systemu UAS/GAL415, mogą wymagać utrzymania muszek w temperaturze 25 °C lub wyższej, w zależności od przypadku.</li>
	<li>Codziennie przez 2 dni podawaj muchom świeży rozmaz pastę drożdżową. UWAGA: Ponieważ rozwój pęcherzyków jest ściśle regulowany przez stan odżywienia samicy muchy, konieczne jest dostarczenie muszce bogatej w składniki odżywcze pasty drożdżowej przez co najmniej 36 godzin przed preparacją.</li>
</ol>
2. Izolowanie średnich i późnych pęcherzyków Drosophila
<ol>
	<li>Pozwól, aby podłoże osiągnęło temperaturę pokojową (~30 min). Jeśli pęcherzyki w stadium mają być wykorzystane do testów rozwojowych in vitro, należy świeżo przygotować pożywkę IVEM (pożywka dla owadów Grace, 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca i 1x penicylina/streptomycyna). Jeśli pęcherzyki w stadium mają być wykorzystane do izolacji mRNA lub białka, należy użyć pożywki Grace Insect lub IVEM. WAŻNE: Temperatura mediów jest krytyczna. Jeśli podłoże jest zimne, zmieni zarówno cytoszkielety aktynowe, jak i mikrotubul i zablokuje rozwój.</li>
	<li>Znieczulić muchy w fiolce z drożdżami, wstrzykując gaz CO2 i umieść 3-5 samic much na podkładce na muchy pod CO2 . WAŻNE: Nie zostawiaj na okładce muchowej więcej samic, niż można wyciąć w ciągu 10 minut, ponieważ długotrwałe narażenie na CO2 może spowodować bezpłodność i śmierć.</li>
	<li>Napełnij jedną studzienkę 9-punktowej płytki pożywką i umieść ją na ciemnej powierzchni (dobrze sprawdza się kawałek czarnej pleksi). Skoncentruj lunetę preparacyjną na dnie studni.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy Dumont #5 podnieś pojedynczą samicę jedną ręką (najlepiej zrobić to za pomocą ręki dominującej). Często najłatwiej jest podnieść samicę za skrzydła, nogi lub klatkę piersiową do przejścia z brzucha. Zanurz samicę w dobrze wypełnionym nośniku. W razie potrzeby wyreguluj ostrość mikroskopu.</li>
	<li>Używając drugiej pary kleszczy trzymanych w niedominującej ręce, chwyć samicę za przedni koniec brzucha tak, aby tylny koniec był ustawiony w kierunku ręki dominującej (ryc. 2A). Upewnij się, że mucha jest zanurzona w nośniku.</li>
	<li>Dominującą ręką użyj kleszczy, aby chwycić naskórek w drugim najbardziej wysuniętym do tyłu segmencie pigmentowym i oderwać go od reszty brzucha (ryc. 2B-C).</li>
	<li>Używając kleszczy w dominującej ręce, delikatnie ściśnij przedni koniec brzucha, aż pojawią się jajniki (ryc. 2D-E). W razie potrzeby umieść kleszcze między dwoma jajnikami i wyciągnij je z tuszy.</li>
	<li>Przenieś jajniki do nowej studzienki ze świeżą pożywką (ryc. 2F) lub przenieś tuszę do ręcznika Kimwipe lub ręcznika papierowego. Jest to szczególnie ważne, jeśli pęcherzyki są izolowane do rozwoju in vitro.</li>
	<li>Powtarzaj, aż 3-5 par jajników zostanie odizolowanych. UWAGA: Każdy jajnik składa się z ~16 jajników lub łańcuchów kolejno dojrzewających pęcherzyków. Każdy jajnik jest zawarty w osłonce mięśniowej.</li>
	<li>Za pomocą imadeł szpilkowych i dołączonych do nich igieł delikatnie rozsuń jajnik, przesuwając igły między jajnikami (ryc. 2G). To czasami uwalnia również pojedyncze mieszki włosowe.</li>
	<li>Poszczególne jajniki i łatwe do odróżnienia etapy morfologiczne rozwoju pęcherzyków powinny być teraz widoczne (ryc. 2G, drażniony jajnik). Patrz rysunki 1 i 2H, aby zapoznać się z różnicami morfologicznymi, które można wykorzystać do rozróżnienia różnych etapów. Aby wyizolować pęcherzyki, które znajdują się w nienaruszonych jajnikach i nadal znajdują się w osłonce mięśniowej, użyj igły, aby przeciąć jajnik z przodu poprzedniego pęcherzyka i z tyłu pęcherzyka bezpośrednio po mieszku włosowym. Spowoduje to zerwanie osłonki mięśniowej, a mieszek włosowy będący przedmiotem zainteresowania można teraz odciąć od sąsiednich mieszków włosowych bez jego uszkodzenia.</li>
	<li>Po rozdzieleniu poszczególnych etapów przenieś interesujące nas pęcherzyki za pomocą szklanej pipety do nowej studzienki ze świeżą pożywką. Jest to szczególnie ważne w przypadku izolowania mieszków włosowych do rozwoju in vitro. UWAGA: Ważne jest, aby ścisnąć bańkę pipety przed włożeniem do pożywki, aby zapobiec redystrybucji pęcherzyków powietrza w interesujących nas pęcherzykach w całej studzience. Dodatkowo, jeśli mieszki włosowe przylegają do szklanej pipety, pipetę można wstępnie pokryć 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), kilkakrotnie pipetując roztwór BSA w górę iw dół i spłukując go środkiem preparacyjnym.</li>
	<li>Po wyizolowaniu wystarczającej liczby mieszków włosowych przystąp do kolejnych eksperymentów.</li>
</ol>
3. Rozwój pęcherzyków S10B in vitro
<ol>
	<li>Wyizoluj pęcherzyki S10B przy użyciu protokołu izolacji etapu (krok 2) w pożywce IVEM. Upewnij się, że mieszki włosowe są szybko odsuwane od zanieczyszczeń. Ponieważ pęcherzyki te będą nadal dojrzewać, ważne jest, aby S10B były zbierane przez 30-60 minut, a następnie umieszczane w wybranej pożywce do dojrzewania. UWAGA: Pęcherzyki S10B należy dokładnie odróżnić od pęcherzyków S10A (ryc. 1C w porównaniu z 1B), ponieważ pęcherzyki S10A nie dojrzeją w pożywce hodowlanej IVEM. Zarówno w pęcherzykach S10A, jak i S10B połowa długości składa się z komórek pielęgniarskich, a druga połowa to oocyt, ale w S10B długość pęcherzyka jest równa długości pęcherzyków S14.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety przenieś ~30 pęcherzyków S10B do dołka z 24-dołkową płytką do hodowli tkankowej. UWAGA: Upewnij się, że wszystkie przenoszone pęcherzyki są S10B i nie dojrzały do S11.</li>
	<li>Przygotować 1 μl pożywki dojrzewającej na dołek, tj. pożywki IVEM plus odczynniki farmakologiczne.</li>
	<li>Używając pipety z wyciągniętego szkła*, usuń jak najwięcej pożywki z dołka (krok 3.2) i szybko dodaj wybraną pożywkę do dojrzewania. UWAGA: Konieczne jest użycie pipety z ciągniętego szkła, ponieważ pęcherzyki włoskowe można łatwo pobrać za pomocą szklanych pipet lub końcówek do pipet za pomocą Pipetman. 
	*Aby zrobić pipety ciągnięte: 1) podgrzej cienką część długich, szklanych pipet w płomieniu palnika Bunsena, aż szkło zacznie mięknąć; 2) Natychmiast wyjmij pipetę z płomienia i pociągnij poziomo, aby wciągnąć pipetę do drobniejszej probówki; 3) Przerwij, aby wygenerować drobny punkt. UWAGA: Używaj ochrony oczu, ponieważ odłamki szkła mogą odlecieć.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.4 dla tylu studzienek, ile wymaga eksperyment.</li>
	<li>Pozwól pęcherzykom rozwijać się przez >10 godzin i oceń postęp rozwojowy w zakresie preparacyjnym. UWAGA: Eksperymenty są zwykle oceniane następnego dnia, aby dać wystarczająco dużo czasu na rozwój mieszków włosowych. S10B trwa ~5 godzin, S11 trwa ~30 minut, S12 trwa ~2 godziny, a S13 trwa ~1 godzinę w temperaturze 25 °C1, a rozwój w temperaturze pokojowej potrwa nieco dłużej. Eksperymenty podobne do opisanych dla pęcherzyków S10B można przeprowadzić przy użyciu pęcherzyków S11-S13.</li>
</ol>
4. Izolacja etapu dla obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Wyizoluj pęcherzyki w późnym stadium (S10B-14) wyrażające wybrany marker fluorescencyjny przy użyciu protokołu izolacji etapu (krok 2) w pożywce IVEM, szybko odsuwając pęcherzyki od zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść interesujące nas pęcherzyki do nowych pożywek, a następnie przenieść szklaną pipetą na dolną płytkę Petriego z szkiełka nakrywkowego. Uważaj, aby dodać podłoże tak, aby bulgotało w dolnej części szkiełka nakrywkowego, ale nie rozlało się.</li>
	<li>W przypadku dłuższych filmów poklatkowych czasami konieczne jest utrzymanie wilgotności wewnątrz płytki Petriego poprzez dodanie zwiniętej chusteczki Kimwipe, zwilżonej wodą, do wewnętrznej krawędzi płytki Petriego. Umieść pokrywkę na górze.</li>
	<li>Obraz pod mikroskopem odwróconym. Szczegółowa rozdzielczość będzie wymagała mikroskopii konfokalnej. Konieczne jest zrównoważenie częstotliwości obrazowania, siły oświetlenia i długości obrazowania; Będzie to musiało zostać opracowane niezależnie dla każdego narzędzia do etykietowania i procesu rozwoju.</li>
</ol>
5. Izolacja etapu do przygotowania mRNA
<ol>
	<li>Wyizoluj poszczególne pęcherzyki etapowe za pomocą protokołu izolacji etapów (krok 2) za pomocą pożywek Grace's lub IVEM.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety przenieś poszczególne interesujące nas etapy do nowych studzienek z pożywką; możliwe jest pobranie wielu etapów jednocześnie.</li>
	<li>Utrzymuj czas pobierania poniżej 1 godziny. Przenieś mieszki włosowe za pomocą szklanej pipety do probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Krótko zakręć probówką w mini-mikrowirówce, aby zebrać wszystkie mieszki włosowe. Za pomocą wyciągniętej szklanej pipety (patrz krok 3.4) ostrożnie usuń wszystkie media. UWAGA: Jeśli używasz pełnowymiarowej mikrowirówki, odwiruj mieszki włosowe z niską prędkością.</li>
	<li>Dodaj 100 μl Trizolu i miel ręcznie przez ~20 sekund za pomocą plastikowego tłuczka. Zakręć z pełną prędkością w mikrowirówce i przenieś Trizol do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie naruszyć żadnych granulowanych zanieczyszczeń. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Powtarzać kroki 5.1-5.5, aż do uzyskania wystarczającej liczby pęcherzyków do eksperymentu. Rutynowo ~75 pęcherzyków S10B, ~75 S12 i ~100 S14 daje ~10 μg RNA.</li>
	<li>Rozmrozić próbki na lodzie. Połączyć próbki, w zależności od potrzeb, w jednej probówce do mikrofuge i zwiększyć objętość Trizolu do 800 μl. Kontynuuj izolację RNA zgodnie z zaleceniami producenta. WAŻNE: Pamiętaj, aby DNazę traktować wyizolowanym RNA DNazą wolną od RNazy.</li>
</ol>
6. Izolacja etapu dla Western Blotting
<ol>
	<li>Rozgrzej blok grzewczy do 100 °C.</li>
	<li>Wyizoluj poszczególne pęcherzyki etapowe za pomocą protokołu izolacji etapów (krok 2) za pomocą pożywek Grace's lub IVEM. UWAGA: Konieczne jest empiryczne określenie, ile pęcherzyków w danym stadium jest potrzebnych do obserwacji każdego określonego białka. W przypadku białek o wysokiej ekspresji 1-3 pęcherzyki S10B / studzienka wystarczy, aby zobaczyć silny sygnał na western blot. Jednak ważne jest, aby pobrać reprezentatywną próbkę, pobierając mieszki włosowe od wielu samic. W ten sposób zwykle pobiera się 15-20 mieszków włosowych na danym etapie.</li>
	<li>Przenieś mieszki włosowe za pomocą szklanej pipety do probówki o pojemności 1,5 ml. Krótko odwirować w mini-mikrowirówce, aby otoczkować mieszki włosowe (patrz krok 5.4). Ostrożnie usunąć wszystkie podłoża za pomocą pipety z wyciągniętego szkła (patrz krok 3.4) i dodać 50 μl 1x PBS i 50 μl 2x buforu Laemmli.</li>
	<li>Miel ręcznie przez ~20 sekund za pomocą plastikowego tłuczka. UWAGA: Plastikowe tłuczki można ponownie wykorzystać do mielenia zachodnich próbek poprzez ich mycie i autoklawowanie.</li>
	<li>Gotować próbki przez 10 minut w bloku grzewczym.</li>
	<li>Schłodzić krótko na lodzie i wirować na pełnych obrotach przez 15 sekund w mikrowirówce. Albo natychmiast załadować na żel SDS-PAGE, albo przechowywać w temperaturze -20 °C. UWAGA: Jeśli próbki są przechowywane, należy pamiętać o ponownym naprzędzeniu próbek przed załadowaniem do żelu.</li>
	<li>Wykonaj analizę western blot zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
</ol>

<ol><li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).</li>
<li>Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filament+cables+in+Drosophila+nurse+cells+are+composed+of+modules+that+slide+passively+past+one+another+during+dumping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping.</a> J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).</li>
<li>Horne-Badovinac, S., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transit%3A+epithelial+morphogenesis+in+the+Drosophila+egg+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber.</a> Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).</li>
<li>McCall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eggs+over+easy%3A+cell+death+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary.</a> Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).</li>
<li>Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+shell+game%3A+patterning+genes+and+morphological+change%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change.</a> Trends Genet. 21, 346-355 (2005).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49, 411-424 (2006).</li>
<li>Tootle, T. L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Pxt%3A+a+cyclooxygenase-like+facilitator+of+follicle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation.</a> Development. 135, 839-847 (2008).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Fascin+is+a+novel+downstream+target+of+prostaglandin+signaling+during+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).</li>
<li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).</li>
<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li>
<li>Bianco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+modes+of+guidance+signalling+during+collective+migration+of+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells.</a> Nature. 448, 362-365 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flytrap%2C+a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li>
<li>Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+eggshell+production%3A+identification+of+new+genes+and+coordination+by+Pxt%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt.</a> PLoS. One. 6, e19943(2011).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Pęcherzyk Drosophila składa się tylko z niewielkiej liczby typów komórek, dzięki czemu idealnie nadaje się zarówno do analiz morfologicznych, jak i molekularnych. Ponadto, ze względu na budowę jajnika, stosunkowo łatwo jest uzyskać dużą liczbę określonych etapów rozwoju pęcherzyka przy wspólnym zakresie preparacyjnym i minimalnym treningu. Ponieważ każdy etap reprezentuje krótkie okno czasowe, izolacja etapu może dostarczyć istotnych informacji molekularnych na temat procesów rozwojowych zachodzących na tym etap...

Każdy jajnik Drosophila składa się z ~16 jajników, czyli łańcuchów kolejno dojrzewających komór jajowych lub pęcherzyków. Każdy pęcherzyk składa się z pojedynczego oocytu, 15 komórek pielęgniarskich lub podporowych pochodzących z linii zarodkowej oraz ~ 650 komórek somatycznych zwanych komórkami pęcherzykowymi (ryc. 1A). Oogeneza Drosophila dzieli się na 14 morfologicznie zdefiniowanych etapów rozwoju1. Każdy etap rozwoju pęcherzyka jest obserwowany wiele razy w obrębie jednej muchy, co sprawia, że stosunkowo łatwo jest wyizolować znaczną liczbę pęcherzyków specyficznych dla danego etapu.
Średnie i późne etapy oogenezy (Etapy 10B-14) są szczególnie dobrze przystosowane do izolacji etapów (Rysunek 1). W stadium 10B (S10B) pęcherzyk jest w pełni wydłużony (tj. jego długość jest równa długości pęcherzyka w stadium 14 (S14), patrz rysunek 1 i rysunek 2H), a połowa długości pęcherzyka składa się z komórek pielęgniarskich, podczas gdy druga połowa to oocyt (ryc. 1C). Na tym etapie komórki pielęgniarskie przechodzą dramatyczną przebudowę aktyny, wzmacniając aktynę korową i generując równoległe wiązki włókien aktynowych2. W tym samym czasie populacja komórek pęcherzykowych, zwana komórkami dośrodkowymi, migruje między komórkami pielęgniarki a oocytem, a dwie grzbietowe grupy komórek pęcherzykowych zostają określone do migracji w celu utworzenia przydatków grzbietowych, kanalików oddechowych dla zarodka3. Komórki pielęgniarskie następnie kurczą się (S11), wyciskając swoją zawartość cytoplazmatyczną do oocytu w procesie zwanym zrzucaniem komórek macierzystych, który dostarcza oocytowi czynników niezbędnych do zakończenia embriogenezy (ryc. 1D). Komórki pielęgniarskie następnie przechodzą śmierć komórkową (S12-S13)4, a komórki pęcherzykowe wydzielają i tworzą wzór skorupki jaja5 (ryc. 1E-G). Tak więc koniec oogenezy jest bogaty w ważne procesy rozwojowe i morfogenetyczne.
Izolowane pęcherzyki w średnim i późnym stadium (S10B-S14) mogą być używane do różnych celów, w tym do analiz molekularnych. Na przykład mRNA z pęcherzyków w stadium można wyizolować do analiz RT-PCR, mikromacierzy lub sekwencyjnych RNA. Pozwala to spojrzeć na ekspresję genów w krótkim oknie rozwojowym, przy obecności tylko kilku typów komórek, i określić, w jaki sposób ekspresja genów jest zmieniana przez perturbacje farmakologiczne lub genetyczne. Izolacja etapów może być również wykorzystana do przyjrzenia się białkom za pomocą western blot. Taka analiza jest ważna, ponieważ pozwala określić ilościowo poziom ekspresji białek w typie dzikim w porównaniu z mutantami na określonych etapach. Podczas gdy można by użyć analiz immunofluorescencyjnych w celu uzyskania podobnych wyników, kwantyfikacja fluorescencji jest mniej wiarygodna ze względu na surowe wymagania, aby wszystkie piksele mieściły się w liniowym zakresie detekcji6. Dodatkowo, analiza western blot może dostarczyć innych informacji, takich jak to, czy białko jest modyfikowane potranslacyjnie, czy też ulega ekspresji z określonej izoformy splicingu. Wyizolowane etapy można również wykorzystać do dalszego oczyszczania białek, w tym frakcjonowania subkomórkowego lub koimmunoprecypitacji.
Specyficzna dla etapu izolacja pęcherzyków może być również stosowana do testów rozwojowych in vitro 7 i obrazowania na żywo8. Wyizolowane pęcherzyki S10B-S13 będą nadal rozwijać się do S14 w prostych pożywkach hodowlanych (patrz poniżej). Ważne jest, aby pamiętać, że pęcherzyki S10A nie będą postępować poprzez zrzucanie komórek pielęgniarskich przy użyciu warunków hodowli omówionych w tym manuskrypcie. Użyliśmy testów rozwojowych S10B in vitro, aby określić rolę prostaglandyn, zarówno farmakologicznie, jak i genetycznie, w regulacji przebudowy aktyny poprzez wykorzystanie zrzucania i rozwoju komórek pielęgniarskich jako odczytów7,9. Podobnie, późniejsze etapy rozwoju można również wyizolować w celu określenia wpływu leczenia farmakologicznego lub manipulacji genetycznych na określone procesy, takie jak migracja komórek dośrodkowych, migracja/tworzenie się grzbietowego uszka10 i śmierć komórki pielęgniarskiej. Takie testy mogą być wykorzystywane do wykonywania dominujących badań przesiewowych interakcji lub testów; na przykład, podczas gdy heterozygotyczność mutacji w PXT lub samej faszynie nie ma wpływu na rozwój S10B in vitro, pęcherzyki z podwójnych heterozygot wykazują defekty zrzucania komórek pielęgniarskich i blokadę w rozwoju9.
Dodatkowo, ponieważ S10B-13 może rozwijać się w kulturze, wszystkie procesy zachodzące w tym czasie mogą być obserwowane przez obrazowanie na żywo. Takie obrazowanie można wykonać po prostu za pomocą światła przechodzącego (jeśli interesują nas tylko ogólne zmiany w morfologii) lub za pomocą mikroskopii konfokalnej z użyciem transgenicznych muszek z ekspresją sond fluorescencyjnych lub mieszków włosowych barwionych barwnikami obrazowania na żywo. Obrazowanie na żywo jest wykorzystywane do znacznego pogłębienia naszej wiedzy na temat procesów rozwojowych. Rzeczywiście, obrazowanie na żywo pęcherzyków w późnym stadium poszerzyło wiedzę na temat migracji przydatków grzbietowych, co jest przykładem tubulogenezy10. Spodziewamy się, że obrazowanie na żywo dodatkowych procesów w późnym stadium, w tym dynamiki aktyny podczas zrzucania komórek pielęgniarki, dostarczy nowych informacji na temat tych zdarzeń rozwojowych. Ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy S10A i wczesne etapy rozwoju pęcherzyków nie będą nadal rozwijać się w S14 w hodowli, obrazowanie na żywo zdarzeń zachodzących na tych etapach rozwoju jest możliwe przy użyciu alternatywnych warunków hodowli11-14 (więcej informacji można znaleźć w Dyskusji).
Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły izolacji pęcherzyków w późnym stadium do rozwoju in vitro i obrazowania na żywo, lub analiz molekularnych (izolacja mRNA i białek).

<table><tbody><tr><td>Aktywne suche drożdże</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Każde źródło aktywnych suchych drożdży jest w porządku</td></tr><tr><td>Grace' s Pożywka dla owadów</td><td>Lonza</td><td>04-457F</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050H</td><td>dowolnym cieplnie inaktywowanym FBS powinien działać</td></tr><tr><td>10x Pióro / Strep</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Imadła i igły</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>Płytka punktowa, dziewięciodołkowa</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>24 płytki wielodołkowe</td><td>Becton Dickinson</td><td>35 3226</td><td>Każde 24-dołkowe naczynie do hodowli tkankowej powinno działać</td></tr><tr><td>Płytki nakrywkowe (35 mm)</td> <td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>Grubość szkiełka nakrywkowego zależy od mikroskopu/ Używany obiektyw</td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>Corning</td><td>7095B-5x (do przenoszenia mieszków włosowych)</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane - długie</td><td>Corning</td><td>7095B-9 (do produkcji pipet ciągniętych)</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do próbek (1,5 &mu; l; Bez RNaz / DNaz)</td><td>Research Products International</td><td>199228</td><td>Każdy plastikowy tłuczek, który pasuje do 1,5 i mu; l można stosować rurki do mikrofug</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr></tbody></table>

użyteczność specyficznej dla etapu izolacji mieszków włosowych drosophila w połowie i późności

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Oogeneza Drosophila lub rozwój pęcherzyków był szeroko stosowany do pogłębiania wiedzy o złożonych procesach rozwojowych i biologicznych komórek. W tym artykule opisano sposób izolowania pęcherzyków w średnim i późnym stadium (etap 10B-14) i wykorzystania ich do uzyskania nowego wglądu w zdarzenia molekularne i morfologiczne zachodzące w napiętych oknach rozwojowych. Wyizolowane pęcherzyki mogą być wykorzystywane do różnych technik eksperymentalnych, w tym do testów rozwoju in vitro, obrazowania na żywo, analizy ekspresji mRNA i analizy białek western blot. Pęcherzyki w stadium 10B (S10B) lub później zakończą rozwój w kulturze; Pozwala to na połączenie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych z rozwojem in vitro w celu określenia wpływu takich manipulacji na procesy zachodzące w określonych okresach rozwoju. Dodatkowo, ponieważ pęcherzyki te rozwijają się w hodowli, idealnie nadają się do badań obrazowych na żywo, które często ujawniają nowe mechanizmy pośredniczące w zdarzeniach morfologicznych. Wyizolowane pęcherzyki mogą być również wykorzystywane do analiz molekularnych. Na przykład zmiany w ekspresji genów, które wynikają z perturbacji genetycznych, można zdefiniować dla określonych okien rozwojowych. Dodatkowo, poziom białka, stabilność i/lub stan modyfikacji potranslacyjnej podczas określonego etapu rozwoju pęcherzyków może być badany za pomocą analiz western blot. W związku z tym specyficzna dla danego etapu izolacja mieszków włosowych Drosophila stanowi bogate źródło informacji na temat szeroko zachowanych procesów rozwoju i morfogenezy.

Podczas izolowania konkretnych etapów rozwoju pęcherzyka jajnikowego Drosophila niezbędne jest dokładne rozróżnienie poszczególnych stadiów morfologicznych. Jest to dość trudne w przypadku stadiów S10A i S10B, ponieważ na tych etapach komórki pielęgnowate oraz oocyt zajmują każdy po połowie długości pęcherzyka (Rysunek 1B w porównaniu z 1C). Jednak pęcherzyki w stadium S10A są krótsze niż pęcherzyki w stadium S10B, gdyż te ostatnie są w pełni wydłużone i tym samym mają długość r...

Specyficzna dla danego etapu izolacja mieszków włosowych Drosophila jest przydatna do różnych celów. Takie pęcherzyki rozwijają się w hodowli, co pozwala na połączenie manipulacji genetycznych i/lub farmakologicznych z testami rozwoju in vitro i obrazowaniem na żywo. Dodatkowo pęcherzyki mogą być wykorzystywane do badań molekularnych, takich jak izolowanie mRNA i białka.

Użyteczność specyficznej dla etapu izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja konkretnych stadiów pęcherzyków jajnikowych od wczesnych do późnych w celu przeprowadzenia różnych eksperymentów, w tym analiz molekularnych, obrazowania żywych komórek oraz testów rozwoju in vitro. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie jajników, a następnie rozdzielenie ich na poszczególne pęcherzyki. Po wyizolowaniu pęcherzyków na konkretnych stadiach mogą one zostać wykorzystane do analiz molekularnych, obrazowania żywych komórek lub rozwoju in vitro.W ostateczności wyniki mogą wykazać, które aspekty późnej oogenezy u drosophila są regulowane przez konkretne czynniki poprzez manipulacje farmakologiczne i genetyczne w połączeniu z tymi analizami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju i biologii komórki, takie jak dynamika aktyny i cytoszkieletu, procesy morfologiczne, geneza cewek oraz sekrecja i wzorowanie macierzy zewnątrzkomórkowej. W ramach niniejszego protokołu należy zebrać dobrze odżywione młode dorosłe muchy obu płci na dwa dni przed izolacją pęcherzyków.Jeśli pęcherzyki na danym etapie mają zostać wykorzystane do rozwoju in vitro, osoby przeprowadzające badania powinny prz

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Użyteczność izolacji pęcherzyka Drosophila w średnim do późnym etapie rozwoju

Drosophila melanogaster jądra można szybko i efektywnie wyizolować z dorosłych samców za pomocą igieł sekcyjnych. Dzięki praktyce w ciągu jednego lub dwóch dni można bez trudności wyizolować ilość jąder wystarczającą do analizy DNA lub RNA za pomocą sekwencjonowania wysokoprzepustowego lub bardziej tradycyjnych metod biologii molekularnej, a także białek do testów opartych na przeciwciałach lub enzymach.

Izolacja jąder Drosophila melanogaster

Ten film opisuje metodę mechanicznego usuwania błon kosmówkowych i witelinowych z wcześniej utrwalonych dojrzałych oocytów Drosophila. Przedstawiony protokół przedstawia szczegółową demonstrację procedury, w wyniku której uzyskuje się oocyty kompatybilne z fluorescencyjnymi testami hybrydyzacji in situ.

Mechaniczne usuwanie kosmówki i błony witeliny: metoda przygotowania oocytów Drosophila do bezpośredniej obserwacji

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę nienaruszonych jąder i torbieli linii zarodkowej poczwarek Drosophila melanogaster. Metoda ta pozwala na mikroskopową obserwację spermatogenezy ex vivo. Ponadto opisano test farmakologiczny wpływu inhibitorów na określone etapy rozwoju komórek rozrodczych w jądrach poczwarki.

Ex vivo Posiew jądra poczwarki Drosophila i pojedyncze torbiele linii zarodkowej samca: rozwarstwienie, obrazowanie i leczenie farmakologiczne

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Tutaj prezentujemy protokół dysocjacji i sortowania określonej populacji komórek z męskich gruczołów dodatkowych (komórek wtórnych) Drosophila do sekwencjonowania RNA i RT-qPCR. Izolacja komórek odbywa się poprzez oczyszczanie FACS komórek wtórnych eksprymujących GFP po wieloetapowym procesie dysocjacji wymagającym sekcji, trawienia proteaz i dyspersji mechanicznej.

Oparty na FACS protokół izolacji RNA z komórek wtórnych męskich gruczołów dodatkowych Drosophila

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj metodę izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności oogenezy. Technika umożliwia analizy molekularne, obrazowanie na żywo oraz badania in vitro dynamiki cytoszkieletu i procesów morfologicznych.

Użyteczność specyficznej dla etapu izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności

Przeglądaj więcej filmów