Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar modułu sprężystości żywych komórek za pomocą mikroskopu sił atomowych. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw pomiarów spektroskopii sił FM w różnych miejscach na komórce. W drugim kroku analizowana jest każda krzywa wymuszonej odległości w celu określenia punktu, w którym końcówka A FM początkowo styka się z komórką.

Następnie, zaczynając od punktu kontaktu, pierwsze 200 do 300 nanometrów danych o wgłębieniach jest dopasowywane do modelu herców. Aby wyodrębnić moduł sprężystości, wyniki dają mapę 2D sztywności komórki uzyskaną przy użyciu trybu mapowania siły, w którym każdy piksel reprezentuje pojedynczą krzywą wymuszonej odległości. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść uchwyt wspornikowy 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.

Następnie załaduj wspornik bru DNP 10 do A FM zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie skalibruj czułość odwrotnej dźwigni optycznej. Ten parametr opisuje wielkość odpowiedzi fotodiody w woltach na nanometr ugięcia wspornika.

Aby to osiągnąć, najpierw załaduj czyste szklane szkiełko na stolik na próbkę. Zamontuj głowicę FM i wyreguluj wiązkę laserową i wyrównanie zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyrównaniu zaczep końcówkę A FM na szklanym szkiełku przy wycofanym P eight O.

Ustaw lustro na odczycie fotodiody o ujemnych dwóch woltach. Następnie wykonaj pomiar spektroskopii sił z maksymalną odpowiedzią fotodiody lub punktem wyzwalania dodatnim dwoma woltami. Po zakończeniu zbierania danych powiększ obszar stałego kontaktu krzywej siły i wykonaj dopasowanie liniowe do tego obszaru.

Aby znaleźć nachylenie w woltach na nanometr, zresetuj wyrównanie lustra do swobodnego odchylenia zera woltów. Następnie skalibruj stałą sprężystości wspornika za pomocą metody strojenia termicznego opisanej przez Levy'ego i Malama. Aby rozpocząć, podnieś skaner z dala od stolika na próbkę, aby nie było żadnych interakcji między końcówką a próbką.

Następnie uchwyć dane termiczne, rejestrując drgania termiczne belki wspornikowej. Oprogramowanie A FM analizuje widmo mocy takich drgań termicznych i wykreśla je w oknie danych. Następnie wykonaj dopasowanie do segmentu danych wyśrodkowanego na najniższej częstotliwości, znanej również jako podstawowy pik rezonansowy, aby określić stałą sprężystości.

Aby przygotować FM do płytek hodowlanych, zainstaluj akcesorium do podgrzewania naczyń na stoliku FM i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Odczekaj 20 minut, aż system osiągnie stabilną równowagę termiczną. Po wstępnym podgrzaniu umieść naczynie hodowlane na stage FM i zabezpiecz je za pomocą zacisku dostarczonego z podgrzewaczem do naczyń w przypadku pomiarów dłuższych niż 30 minut, należy użyć pożywki niezależnej od dwutlenku węgla, aby zastąpić normalną pożywkę hodowlaną.

Następnie nałóż niewielką kroplę pożywki hodowlanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na końcówkę wspornika A FM i opuść głowicę FM, aż końcówka zostanie zanurzona w płynie. Korzystając z kamery CCD z widokiem z góry, wyrównaj wiązkę lasera na wsporniku. Wyrównanie w cieczy będzie inne niż w powietrzu ze względu na zmianę współczynnika załamania światła.

Po wyrównaniu wsuń końcówkę A FM w obszar naczynia hodowlanej wolny od komórek i wykonaj kalibrację odwrotnej czułości dźwigni optycznej w środowisku ciekłym. Aby rozpocząć pomiary właściwości mechanicznych komórek, umieść końcówkę wspornika nad obszarem oka perle komórki za pomocą mikroskopu optycznego. Precyzyjna regulacja położenia wsporników odbywa się poprzez zastosowanie przesunięć do skanerów X i Y.

Następnie przełącz FM w tryb spektroskopii czterech i ustaw szybkość wgłębiania na pięć mikrometrów na sekundę, która jest wystarczająco niska, aby uniknąć efektów hydrodynamicznych. Następnie ustaw punkt wyzwalania odchylenia na dwa nano niutony. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, dostosuj tę wartość do sztywności próbki.

Dodatkowo wybierz opcję wyzwalania względnego, która skoryguje wszelkie odchylenia w sygnale odchylenia. Następnie ustaw odległość siły na pięć mikrometrów, aby upewnić się, że końcówka zostanie całkowicie odłączona od ogniwa między pomiarami siły. Zbierz trzy krzywe siły w różnych miejscach w obszarze jąder co najmniej 30 komórek dla każdego warunku.

Chociaż korzystne jest wykonanie wielu krzywych w każdej komórce. W przypadku wiarygodnych danych statystycznych, pobranie zbyt wielu danych może prowadzić do zmian sztywności ogniwa na stres spowodowany sondą A FM. Dokładniej scharakteryzuj rozkład właściwości mechanicznych w pojedynczej komórce przy użyciu trybu mapy sił.

W trybie mapy sił ustaw rozmiar skanu na 30 mikrometrów, rozdzielczość na 32 na 32, a parametry wcięć są takie same, jak te wybrane dla pojedynczych krzywych siły. Następnie A FM weźmie pojedyncze krzywe siły dla każdego piksela w obszarze próbki i dostarczy mapę sztywności całego obszaru. Następnie przeanalizuj zarejestrowane krzywe siły za pomocą MATLAB, aby obliczyć sztywność komórki.

Zacznij od przyjęcia algorytmu opublikowanego po raz pierwszy przez Lynette Al, który oblicza zarówno dopasowanie liniowe, jak i hercowe z każdego punktu za pomocą matlaba. Oblicz względny błąd RMS obu pasowań i zsumuj te wartości w każdym punkcie. Punkt, który osiąga minimalny całkowity błąd dopasowania, jest wybierany jako początkowy punkt kontaktu, którego lokalizacja ma kluczowe znaczenie dla dokładnego pomiaru modułu młodego ogniwa.

Następnie oblicz deltę odkształcenia próbki. Korzystając z poniższych równań z odkształceniem, jest równe zeru przed kontaktem z komórką, gdzie Z jest mniejsze niż zero Z i jest równe różnicy między ugięciem wspornika D a całkowitą odległością Z za punktem kontaktu. Następnie oblicz siłę wcięcia F, korzystając z następujących równań, gdzie siła jest równa zeru przed kontaktem komórki, gdzie Z jest mniejsze niż zero Z i jest równe stałej sprężystości K wspornika pomnożonej przez ugięcie wspornika za punktem styku.

Dopasowanie kwadratu Elise jest następnie stosowane do danych dotyczących odkształcenia próbki w stosunku do siły wcięcia w obszarze po kontakcie modelu hercowego w celu wyodrębnienia modułu Younga komórki na podstawie pokazanego kształtu użytej końcówki. Oto reprezentatywne krzywe siły pobrane z trzech komórek T three fiberblast hodowanych na trzech różnych powierzchniach. Jak widać tutaj, różne powierzchnie mogą mieć duży wpływ na sztywność cytoszkieletu komórkowego.

Średnie odkształcenia komórek hodowanych na twardej powierzchni z tworzywa sztucznego są pokazane na czerwono. Te wyhodowane na sztywnym żelu z poliakryloamidu są pokazane na fioletowo, a te wyhodowane na elastycznym żelu z poliakryloamidu są pokazane na niebiesko. Po dokładnym zidentyfikowaniu punktów styku na krzywych, można dokładnie pokazać siły wcięcia w funkcji deformacji komórki.

Dodatkowo, ich modularność Younga, I można dokładnie obliczyć na podstawie pierwszych 300 nanometrów wgłębienia po kontakcie. Pokazany tutaj jest fibroblast, który został transfekowany zielonym białkiem fluorescencyjnym oznaczonym mentonem, rodzajem włókna pośredniego. Im jaśniejszy obraz, tym więcej mentonu znajduje się w tym obszarze.

Może to być związane ze sztywnością cytoszkieletu komórki. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mapowania siły A FM, możliwe jest pokazanie podobnej mapy sztywności strumienia światłowodowego o rozdzielczości 32 na 32 piksele, gdzie każdy piksel reprezentuje 2,5 na 2,5 mikrona powierzchni komórki. Po obejrzeniu tego filmu będzie miał dobry pomysł, jak wykorzystać mikroskopię sił atomowych do pomiaru elastyczności żywych komórek tkankowych.