Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest pomiar modułu sprężystości żywych komórek przy użyciu mikroskopu sił atomowych. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności pomiarów spektroskopii sił FM w różnych miejscach na komórce. W drugim kroku każda krzywa siła-odległość jest analizowana w celu wyznaczenia punktu, w którym końcówka AFM nawiązuje wstępny kontakt z komórką.

Następnie, zaczynając od punktu styku, pierwsze 200 do 300 nanometrów danych z wciskania dopasowuje się do modelu Hertza. Aby wyznaczyć moduł sprężystości, wyniki generują dwuwymiarową mapę sztywności komórki uzyskaną przy użyciu trybu mapowania siły, w którym każdy piksel reprezentuje pojedynczą krzywą siła-odległość. Procedurę zaprezentuje Guen Thomas, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oczyścić uchwyt wspornika 70% etanolem i pozostawić go do wyschnięcia.

Następnie zainstaluj w AFM wspornik bru DNP 10 zgodnie z instrukcją producenta. Następnie skalibruj czułość odwrotnej dźwigni optycznej. Parametr ten opisuje odpowiedź fotodiody wyrażoną w woltach na nanometr ugięcia wspornika.

Aby to osiągnąć, najpierw umieść czyste szkiełko przedmiotowe na stoliku z próbką. Zainstaluj głowicę AFM i dostrój wiązkę lasera oraz wyrównanie zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyrównaniu, zetknij końcówkę AFM ze szkiełkiem przedmiotowym przy wycofanym P eight O.

Ponownie ustaw lustro tak, aby odczyt fotodiody wynosił minus dwa wolty. Następnie przeprowadź pomiar spektroskopii sił z maksymalną odpowiedzią fotodiody lub punktem wyzwalającym wynoszącym plus dwa wolty. Po zakończeniu akwizycji danych powiększ obszar sztywnego kontaktu na krzywej siły i wykonaj dopasowanie liniowe do tego regionu.

Aby wyznaczyć nachylenie w woltach na nanometr, należy zresetować ustawienie lustra do swobodnego ugięcia wynoszącego 0 V. Następnie należy skalibrować stałą sprężystości wspornika metodą strojenia termicznego opisaną przez Levy i Malam. Na początek należy podnieść skaner nad stolik z próbką, aby wyeliminować oddziaływania między wierzchołkiem a próbką.

Następnie zarejestruj dane termiczne, mierząc drgania termiczne belki wspornika. Oprogramowanie AFM analizuje widmo mocy tych drgań termicznych i wyświetla je w oknie danych. Następnie przeprowadź dopasowanie do segmentu danych wycentrowanego na najniższej częstotliwości, znanej również jako podstawowy peak rezonansowy, aby wyznaczyć stałą sprężystości.

W celu przygotowania a FM do płytek hodowlanych, zainstaluj akcesorium w postaci podgrzewacza naczyń na stoliku a FM i ustaw temperaturę na 37 °C. Odczekaj 20 minut, aż system osiągnie stabilną równowagę termiczną. Po wstępnym podgrzaniu umieść naczynie hodowlane na stoliku a FM i zabezpiecz je za pomocą zacisku dołączonego do podgrzewacza naczyń; w przypadku pomiarów trwających powyżej 30 minut należy zastosować pożywkę niezależną od dwutlenku węgla w miejsce standardowej pożywki hodowlanej.

Następnie nanieś małą kroplę pożywki hodowlanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na końcówkę wspornika AFM i obniż głowicę AFM, aż końcówka zostanie całkowicie zanurzona w cieczy. Używając kamery CCD z widokiem z góry, ponownie ustaw wiązkę lasera na wsporniku. Ustawienie w cieczy będzie różnić się od ustawienia w powietrzu ze względu na zmianę współczynnika załamania światła ośrodka.

Po wyrównaniu należy przyłożyć końcówkę AFM do obszaru naczynia hodowlanego wolnego od komórek i przeprowadzić kalibrację czułości odwróconej dźwigni optycznej w środowisku ciekłym. Aby rozpocząć pomiary właściwości mechanicznych komórek, należy umieścić końcówkę wspornika nad obszarem oka perły komórki, korzystając z mikroskopu optycznego. Precyzyjne korekty położenia wspornika wykonuje się poprzez wprowadzanie przesunięć w skanerach X i Y.

Następnie przełącz AFM w tryb spektroskopii sił i ustaw szybkość wgłębiania na 5 µm/s, co jest wartością wystarczająco niską, aby uniknąć efektów hydrodynamicznych. Następnie ustaw punkt wyzwalania ugięcia na 2 nN. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, dostosuj tę wartość do sztywności próbki.

Dodatkowo wybierz opcję wyzwalania względnego (relative triggering), która skoryguje ewentualny dryft sygnału ugięcia. Następnie ustaw odległość siły na 5 µm, aby zapewnić całkowite oddzielenie końcówki od komórki pomiędzy pomiarami siły. Zbierz trzy krzywe siły w różnych miejscach obszaru jądra dla co najmniej 30 komórek w każdym wariancie.

Chociaż korzystne jest wykonanie wielu pomiarów krzywych dla każdej komórki, to w celu uzyskania wiarygodnych danych statystycznych należy pamiętać, że zbyt duża ich liczba może prowadzić do zmian sztywności komórki wskutek stresu wywołanego przez sondę AFM. Dalszą charakterystykę rozkładu właściwości mechanicznych w obrębie pojedynczej komórki przeprowadzono przy użyciu trybu mapowania sił.

W trybie mapowania sił ustaw rozmiar skanowania na 30 micrometers, rozdzielczość na 32 na 32, a parametry wgłębienia pozostaw takie same, jak wybrane dla pojedynczych krzywych sił. A FM wykona następnie pomiary pojedynczych krzywych sił dla każdego piksela w obszarze próbki, tworząc mapę sztywności całego regionu. Następnie przeanalizuj zarejestrowane krzywe sił za pomocą programu MATLAB, aby obliczyć sztywność komórki.

Należy rozpocząć od zastosowania algorytmu opublikowanego pierwotnie przez Lynette Al, który oblicza dopasowanie liniowe oraz dopasowanie Herzowskie dla każdego punktu przy użyciu programu matlab. Oblicz względny błąd RMS dla obu dopasowań i zsumuj te wartości w każdym punkcie. Punkt, dla którego całkowity błąd dopasowania jest minimalny, zostaje wybrany jako początkowy punkt kontaktu; zlokalizowanie tego punktu jest kluczowe dla dokładnego pomiaru modułu Younga komórek.

Następnie oblicz deltę odkształcenia próbki. Skorzystaj z poniższych równań, przyjmując, że odkształcenie wynosi zero przed kontaktem z komórką, gdy Z jest mniejsze niż Z zero, oraz że jest ono równe różnicy między ugięciem wspornika D a całkowitym dystansem Z poza punktem kontaktu. Następnie oblicz siłę wgłębiania F, korzystając z poniższych równań, gdzie siła wynosi zero przed kontaktem z komórką, gdy Z jest mniejsze niż Z zero, oraz jest ona równa stałej sprężystości K wspornika pomnożonej przez ugięcie wspornika poza punktem kontaktu.

Następnie dopasowanie kwadratu Elise jest stosowane do danych dotyczących odkształcenia próbki w funkcji siły wciskania w obszarze po kontakcie modelu Hertza, w celu wyznaczenia modułu Younga komórki na podstawie kształtu użytej końcówki. Przedstawiono tutaj reprezentatywne krzywe siły uzyskane z trzech komórek fibroblastów T3 hodowanych na trzech różnych powierzchniach. Jak widać, różne powierzchnie mogą w znacznym stopniu wpływać na sztywność cytoszkieletu komórkowego.

Średnia deformacja komórek hodowanych na twardej powierzchni plastikowej zaznaczona jest kolorem czerwonym. Komórki hodowane na sztywnym żelu poliakrylamidowym zaznaczono kolorem fioletowym, a komórki hodowane na elastycznym żelu poliakrylamidowym kolorem niebieskim. Po dokładnym zidentyfikowaniu punktów styku na krzywych można precyzyjnie przedstawić siły wciskania jako funkcję deformacji komórek.

Dodatkowo, ich moduł Younga można precyzyjnie obliczyć z pierwszych 300 nanometrów wniknięcia po nawiązaniu kontaktu. Przedstawiony tutaj fibroblast został przetransfekowany mentoną, rodzajem włókien pośrednich, znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym. Im jaśniejszy obraz, tym więcej mentony znajduje się w danym obszarze.

Może to być związane ze sztywnością cytoszkieletu komórkowego. Wykorzystując przedstawioną tutaj technikę mapowania sił A FM, można uzyskać podobną mapę sztywności fibroblasta o rozdzielczości 32 na 32 piksele, gdzie każdy piksel reprezentuje obszar powierzchni komórki o wymiarach 2,5 na 2,5 mikrona. Po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli dobre wyobrażenie o tym, jak wykorzystać mikroskopię sił atomowych do pomiaru elastyczności żywych komórek tkankowych.