Name: Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę pomiaru modułu sprężystości żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Technika ta umożliwia tworzenie dwuwymiarowych map sztywności komórkowej z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Paulowi Janmeyowi z University of Pennsylvania za udostępnienie linii komórkowych użytych w tym artykule. QW dziękuje również J.F. Byfieldowi i Evanowi Andersonowi za ich wnikliwe dyskusje na temat technik AFM.

1. Kalibracja stałej sprężystości wspornika
<ol>
	<li>Załaduj wspornik do AFM zgodnie z instrukcjami producenta. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów konieczne jest oczyszczenie uchwytu wspornika etanolem. Pomoże to ograniczyć kontaminację bakteriami kultury podczas pomiarów AFM.</li>
	<li> skalibruj InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity – odwrotna czułość optycznego dźwigniowego układu pomiarowego). Parametr ten opisuje odpowiedź fotodiody (w woltach) na nanometr ugięcia wspornika.</li>
	<li>Umieść czyste szkiełko przedmiotowe na stoliku z próbką, następnie zainstaluj głowicę AFM i ustaw wiązkę lasera oraz wyrównanie zgodnie z instrukcjami producenta. Przystaw końcówkę AFM do szkiełka przedmiotowego.</li>
	<li>Przy wycofanym piezoelektryku ponownie ustaw lustro tak, aby odczyt z fotodiody wynosił -2 V. Przeprowadź pomiar spektroskopii sił z punktem wyzwalającym (maksymalna odpowiedź fotodiody) wynoszącym +2 V.</li>
	<li>Przy wycofanym piezoelektryku ponownie ustaw lustro tak, aby odczyt z fotodiody wynosił -2 V. Przeprowadź pomiar spektroskopii sił z punktem wyzwalającym (maksymalna odpowiedź fotodiody) wynoszącym +2 V. Uwaga: Wartości napięć podane tutaj są specyficzne dla AFM marki Asylum. Wartość ta powinna być ustawiona zgodnie ze specyfikacją dostarczoną przez producenta. 
	Po zakończeniu akwizycji danych powiększ obszar kontaktu sztywnego na krzywej siły. Przeprowadź dopasowanie liniowe do tego obszaru, aby wyznaczyć nachylenie, które będzie wyrażone w V/nm. Odwrotność tej wartości opisuje czułość optyczną układu wspornik-fotodioda.</li>
	<li>Zresetuj ustawienie lustra do ugięcia swobodnego wynoszącego 0 V.</li>
	<li>Skalibruj stałą sprężystości wspornika. Do wyznaczenia stałej sprężystości wspornika stosowana jest metoda dostrojenia termicznego 28.</li>
	<li>Po skalibrowaniu InvOLS podnieś skaner nad stolik z próbką w taki sposób, aby nie występowały oddziaływania między końcówką a próbką.</li>
	<li>Rozpocznij rejestrację danych termicznych. Podczas tego procesu rejestrowane są wibracje termiczne belki wspornika. Oprogramowanie AFM analizuje widmo mocy takich wibracji termicznych i wyświetla je w oknie danych.</li>
	<li>Po kilku sekundach akwizycji danych wykonaj dopasowanie do segmentu danych skupionego wokół piku o najniższej częstotliwości (rezonans podstawowy), aby wyznaczyć stałą sprężystości.</li>
</ol>
2. Nakładanie próbki
<ol>
	<li>Zainstaluj akcesorium w postaci podgrzewacza do szalek na stole AFM, jeśli nie jest on jeszcze zamontowany.</li>
	<li>Ustaw temperaturę na 37 °C i odczekaj 20 min, aż system osiągnie stabilną równowagę termiczną.</li>
	<li>Umieść szalkę hodowlaną na stole AFM i zabezpiecz ją za pomocą zacisku dołączonego do podgrzewacza. Ważne jest, aby zminimalizować czas między wyjęciem szalki z inkubatora a umieszczeniem jej na stole, aby uniknąć uszkodzenia komórek. W przypadku pomiarów trwających dłużej niż 30 min, w miejsce standardowej pożywki hodowlanej należy zastosować pożywkę niezależną od CO2.</li>
	<li>Nanieś małą kroplę pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C na wierzchołek dźwigara AFM i obniż głowicę AFM, aż wierzchołek zostanie zanurzony w cieczy.</li>
	<li>Używając kamery CCD z widokiem z góry, ponownie ustaw wiązkę lasera na dźwigarze (ustawienie w cieczy będzie różnić się od ustawienia w powietrzu ze względu na zmianę współczynnika załamania światła ośrodka).</li>
	<li>Przyłoż głowicę AFM do czystego obszaru szalki hodowlanej.</li>
	<li>Przeprowadź kalibrację InvOLS zgodnie z powyższym opisem w celu określenia czułości dźwigara w środowisku ciekłym.</li>
</ol>
Uwaga: a) Jeśli komórki są hodowane na hydrożelach, kalibrację InvOLS należy przeprowadzić wcześniej względem dolnej powierzchni naczynia hodowlanego wypełnionego pożywką do hodowli komórkowej. Przy przejściu do próbek komórkowych należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie zmienić ustawienia wiązki lasera względem wspornika. b) InvOLS musi zostać ponownie skalibrowany przy każdej zmianie ustawienia lasera. c) Zaleca się również przyjmowanie wartości InvOLS jako średniej z kilku krzywych kalibracyjnych, ponieważ każda kalibracja generuje inną wartość InvOLS. Zmienność InvOLS jest jednak niewielka w porównaniu do wartości średniej. Na przykład 100-krotna kalibracja wspornika Bruker DNP-10 o stałej sprężystości 0,06 N/m w cieczy daje średnią wartość InvOLS wynoszącą 66,3 nm/V, przy odchyleniu standardowym wynoszącym zaledwie 0,5 nm/V.
3. Gromadzenie krzywych siły wklęśnięcia komórki
<ol>
	<li>Wybierz komórkę do wcięcia. Za pomocą mikroskopu optycznego przesuń stolik tak, aby umieścić wspornik nad komórką w taki sposób, by końcówka znajdowała się w regionie okołojądrowym. Precyzyjna regulacja pozycji wspornika może być osiągnięta poprzez zastosowanie przesunięć (offsets) skanerów X i Y. 
	Uwaga: Podczas przesuwania stolika z próbką w celu wyboru docelowej komórki, wspornik AFM musi zostać wycofany z powierzchni próbki. Zapobiega to uderzeniu wspornika w próbkę, ponieważ jej powierzchnia może nie być płaska.</li>
	<li>Przełącz urządzenie w tryb spektroskopii sił (Force Spectroscopy). Ustaw szybkość wcięcia (Indentation rate) w zakresie 1-10 μm/sec, na tyle niską, aby uniknąć efektów hydrodynamicznych.</li>
	<li>Ustaw punkt wyzwalania ugięcia (deflection trigger point), który ogranicza maksymalną siłę wcięcia w celu uniknięcia uszkodzenia komórek. Wybierz opcję wyzwalania względnego (Relative triggering), która skoryguje ewentualny dryft sygnału ugięcia. Maksymalna siła 2 nN jest dobrym punktem wyjścia dla większości próbek. Wartość ta powinna być jednak dostosowana do sztywności próbki. W przypadku próbek miękkich należy zastosować niższą wartość, aby uniknąć nadmiernego wcięcia w próbkę. W przypadku próbek sztywnych należy zastosować wyższą wartość, aby uzyskać mierzalne wcięcie.</li>
	<li>Ustaw dystans siły na tyle duży, aby zapewnić całkowite oddzielenie końcówki od komórki pomiędzy pomiarami siły. Zazwyczaj dystans siły ustawia się na 5 μm.</li>
	<li>Wydaj polecenie do AFM w celu wykonania pojedynczej krzywej siły.</li>
	<li>Zbierz co najmniej trzy krzywe siły w różnych miejscach regionu okołojądrowego każdej komórki. Chociaż pobieranie wielu krzywych z każdej komórki jest korzystne dla uzyskania wiarygodnych danych statystycznych, wykonanie zbyt wielu pomiarów może prowadzić do zmian sztywności komórki z powodu stresu wywołanego przez sondę AFM.</li>
	<li>Po zakończeniu zbierania danych wycofaj końcówkę i powtórz kroki 3.1-3.6 dla tak wielu komórek, jak jest to konieczne do uzyskania dobrych danych statystycznych dotyczących sztywności komórek w określonych warunkach próbki. Zazwyczaj mierzy się 30 komórek dla każdego stanu.</li>
</ol>
W celu charakterystyki rozkładu sztywności w obrębie pojedynczej komórki stosowany jest tryb mapowania sił (force-map). W trybie Force-map należy ustawić rozmiar skanowania obejmujący badany obszar, dobrać odpowiednią rozdzielczość oraz zdefiniować parametry wgłębienia analogicznie do tych wybranych dla pojedynczych krzywych siły; następnie AFM przeskanuje zdefiniowany obszar próbki, rejestrując pojedyncze krzywe siły dla każdego piksela w regionie próbki.
4. Analiza danych
Zarejestrowane krzywe siły są analizowane przy użyciu niestandardowej procedury w programie MATLAB w celu obliczenia sztywności komórki. Poniżej znajduje się krótki opis procedury MATLAB:
<ol>
	<li>Program MATLAB identyfikuje współrzędne punktu styku z0 i d0 (patrz Rysunek 1) przy użyciu algorytmu przyjętego z opublikowanej metody Lin et al. 29:</li>
	<li>Dla każdego punktu danych na krzywej siły wykonuje się dopasowanie liniowe danych po lewej stronie punktu zainteresowania oraz dopasowanie do modelu Hertza po prawej stronie (przyjmując wybrany punkt jako początkowy punkt styku), aż do ustawionego maksymalnego wgniecenia (zalecane 200-300 nm).</li>
	<li>Dla każdego punktu oblicza się względny błąd RMS obu dopasowań i sumuje te wartości.</li>
	<li>Punkt, który osiąga minimalny całkowity błąd dopasowania, jest wybierany jako początkowy punkt styku. 
	Uwaga: Czas obliczeń można skrócić, implementując przeszukiwanie złotym podziałem zamiast liniowego skanowania całej krzywej siły.</li>
	<li>Deformację próbki δ oraz siłę wgniecenia F oblicza się jako: 
	<img alt="Równania równowagi statycznej, δ i F, szczegółowo opisujące warunki dla z w analizie równowagi." fo:content-width="3.073in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Do dopasowania danych F w funkcji δ w obszarze po kontakcie, z ≥ z0, do modelu Hertza w celu wyznaczenia modułu Younga E komórki stosuje się metodę najmniejszych kwadratów: 
	<img alt="Wzór mechaniki kontaktu, równania siły wgniecenia, schemat wyjaśniający końcówki sferyczne i stożkowe." fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
	, gdzie v to liczba Poissona. 
	Uwaga: Gdy δ przekracza 10% grubości próbki (wysokości komórki), zmierzona sztywność komórki jest wpływana przez sztywność podłoża. Grubość obszaru okołojądrowego wynosi zazwyczaj rzędu kilku mikrometrów. Dlatego do modelu Hertza dopasowuje się tylko pierwsze 200-300 nm krzywej F-δ.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Wagner, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Softness%2C+strength+and+self-repair+in+intermediate+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks.</a> Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).</li>
<li>Kasza, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A+is+essential+for+active+cell+stiffening+but+not+passive+stiffening+under+external+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force.</a> Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanics+as+an+indicator+of+cytoskeletal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).</li>
<li>Schafer, A., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+myosin+II+activity+on+stiffness+of+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells.</a> Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).</li>
<li>Guck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deformability+as+an+inherent+cell+marker+for+testing+malignant+transformation+and+metastatic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence.</a> Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).</li>
<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Rotsch, C., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+changes+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+in+fibroblasts%3A+an+atomic+force+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.</a> Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).</li>
<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+extract+selectively+targets+nanomechanics+of+live+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 22, 215101(2011).</li>
<li>Hoffman, B. D., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+dissecting+the+physical+responses+of+cells+to+force%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).</li>
<li>Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consensus+mechanics+of+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The consensus mechanics of cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).</li>
<li>Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology%2C+stress+fluctuations%2C+and+active+behavior+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells.</a> Physical Review Letters. 91, 198101(1981).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+probes+length+scale+dependent+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Microrheology probes length scale dependent rheology.</a> Physical Review Letters. 96, 118104(2006).</li>
<li>Deng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+dynamics+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Fast and slow dynamics of the cytoskeleton.</a> Nature Materials. 5, 636-640 (2006).</li>
<li>Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+Aspiration+of+Substrate-attached+Cells+to+Estimate+Cell+Stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness.</a> J. Vis. Exp. (67), e3886(2012).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).</li>
<li>Levental, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+indentation+device+for+measuring+micrometer-scale+tissue+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys-Condens.+Mat%22%5BJournal%5D)">A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness.</a> J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).</li>
<li>Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+viscoelastic+properties+of+thin+regions+of+fibroblasts+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).</li>
<li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+elastic+properties+of+biological+samples+with+the+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%3A+The+Quarterly+Magazine+of+the+Engineering+in+Medicine+%26+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).</li>
<li>Crocker, J. C., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-particle+tracking+and+two-point+microrheology+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).</li>
<li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (54), e2911(2011).</li>
<li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).</li>
<li>Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+l929+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%3A+Effects+of+anticytoskeletal+drugs+and+membrane+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking.</a> Scanning. 20, 389-397 (1998).</li>
<li>Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+viscoelastic+properties+of+human+platelets+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).</li>
<li>Levy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers%3A+thermal+fluctuations+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).</li>
<li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft%2C+inhomogeneous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).</li>
<li>Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+expression+of+genes+implicated+in+proliferative+vitreoretinopathy+is+influenced+by+substrate+elastic+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).</li>
<li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+elasticity%3A+Measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li>
<li>Lele, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+study+cell+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools to study cell mechanics and mechanotransduction.</a> Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).</li>
<li>A-Hassan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).</li>
<li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Hertzian+approach+to+analyzing+mechanical+properties+of+endothelial+cells+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).</li>
<li>Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+nanomechanics+of+live+neuronal+growth+cones+analyzed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).</li>
<li>Byfield, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+filamin+A+prevents+cells+from+responding+to+stiffness+gradients+on+gels+coated+with+collagen+but+not+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin.</a> Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).</li>
<li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+analysis+of+human+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">AFM-based analysis of human metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 19, 384003(2008).</li>
<li>Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elasticity+in+biological+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li>
<li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+physics+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Solid+State+%26+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072(2010).</li>
<li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Metoda wgłębiania AFM ma zalety w charakterystyce właściwości mechanicznych żywych komórek. Chociaż jest mniej czuły niż magnetyczna cytometria skręcająca i pęseta optyczna, które mogą mierzyć siły na poziomie pikonewtonu32, AFM może wykryć siłę oporu od próbek od dziesiątek pikoniutonów do setek nanoniutonów, porównywalną z zakresem siły, którą można przyłożyć do komórek za pomocą mikropipety19. Ten zakres siły odpowiada potrzebom tworzenia mierzalnych deformacji we wszystkich typach komórek19...

Właściwości mechaniczne, a w szczególności sztywność poszczególnych komórek oraz otaczających je macierzy zewnątrzkomórkowych (ECM), mają kluczowe znaczenie dla wielu procesów biologicznych, w tym dla wzrostu, ruchliwości, podziału i różnicowania komórek oraz homeostazy tkankowej.1 Wykazano, że sztywność mechaniczna komórek jest determinowana głównie przez cytoszkielet, zwłaszcza przez sieci aktyny, filamenty pośrednie oraz inne białka z nimi powiązane.2 Wyniki testów mechanicznych przeprowadzonych na sieciach aktyny i filamentów pośrednich in vitro sugerują, że mechanika komórkowa w dużym stopniu zależy od struktury cytoszkieletu oraz naprężeń wstępnych w cytoszkielecie.3-5 Sztywność żywych komórek jest zatem uznawana za wskaźnik pozwalający ocenić strukturę cytoszkieletu6, aktywność miozyny7 oraz wiele innych procesów komórkowych. Co więcej, zmiany właściwości mechanicznych komórek często okazują się ściśle powiązane z różnymi stanami chorobowymi, takimi jak tworzenie się guzów i przerzuty.8-10 Monitorowanie sztywności mechanicznej żywych komórek może zatem stanowić nową metodę monitorowania fizjologii komórki, wykrywania i diagnozowania chorób8 oraz oceny skuteczności leczenia farmakologicznego.11,12
Opracowano wiele metod pomiaru elastyczności komórek, w tym mikrorheologię śledzenia cząstek,13-16 magnetyczną cytometrię skrętnej,17 aspirację mikropipetą18,19 oraz mikroindentację.20-22 Mikrorheologia śledzenia cząstek polega na śledzeniu drgań termicznych wstrzykniętych do komórek fluorescencyjnych cząstek submikronowych lub znaczników referencyjnych wewnątrz cytoszkieletu komórkowego.23 Właściwości sprężyste i lepkie komórek oblicza się z pomiarów przemieszczeń cząstek przy użyciu twierdzenia o fluktuacjach i dyssypacji.14,23 Metoda ta umożliwia jednoczesny pomiar lokalnych właściwości mechanicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną w różnych miejscach komórki. Jednakże wstrzykiwanie cząstek fluorescencyjnych do komórek może prowadzić do zmian w funkcjach komórkowych, strukturze cytoszkieletu, a w konsekwencji do zmiany mechaniki komórki. Metoda aspiracji mikropipetą polega na przyłożeniu podciśnienia w mikropipecie o średnicy od 1 do 5 μm, aby wciągnąć niewielki fragment błony komórkowej do wnętrza pipety. Sztywność komórki oblicza się na podstawie przyłożonego podciśnienia i deformacji błony komórkowej.18 Metoda ta nie pozwala jednak na wykrycie heterogenicznego rozkładu sztywności w obrębie komórki. Magnetyczna cytometria skrętna (MTC) wykorzystuje pole magnetyczne do wytworzenia momentu obrotowego na superparamagnetycznych kuleczkach przyczepionych do błony komórkowej.17 Sztywność komórki wyznacza się w tej metodzie z zależności między przyłożonym momentem obrotowym a deformacją skrętną błony komórkowej. W metodzie MTC trudno jest kontrolować lokalizację kuleczek magnetycznych, a wyzwanie stanowi również charakterystyka deformacji skrętnej z wysoką rozdzielczością. Mikroindentacja polega na wciskaniu w komórkę indentora o określonej geometrii. Siła wciskania i wynikająca z niej indentacja w komórkach często odpowiadają przewidywaniom modelu Hertza. Moduły Younga komórek można obliczyć z krzywych siła-indentacja poprzez dopasowanie ich do modelu Hertza. Metoda ta jest szeroko stosowana do badania właściwości mechanicznych tkanek i komórek, pomimo takich ograniczeń jak niepewność w określaniu punktu styku, stosowalność modelu Hertza oraz ryzyko fizycznego uszkodzenia komórek. Wśród wielu urządzeń do mikroindentacji20, mikroskop sił atomowych (AFM) jest dostępny komercyjnie i jest powszechnie wykorzystywany do charakterystyki właściwości mechanicznych żywych komórek i tkanek21,24-27.
Niniejsza praca prezentuje procedurę wykorzystania AFM Asylum MFP3D-Bio do charakterystyki mechaniki komórek. AFM nie tylko zapewnia topografię komórek o wysokiej rozdzielczości, ale jest również szeroko stosowany do charakterystyki właściwości mechanicznych komórek tkankowych. Zasada indentacji AFM została przedstawiona na Rysunku 1. Cantilever AFM zbliża się do komórki z odległości kilku mikrometrów; nawiązuje kontakt z komórką; wgniata komórkę tak, aby ugięcie cantilevera osiągnęło wcześniej wybrany punkt nastawy (set point); a następnie odsuwa się od komórki. Podczas tego procesu ugięcie cantilevera jest rejestrowane jako funkcja jego położenia, co pokazano na Rysunku 1. Przed nawiązaniem kontaktu z komórką cantilever porusza się w medium bez żadnego widocznego ugięcia. Podczas indentacji komórki cantilever ugina się, a sygnał ugięcia wzrasta. Cantilevery są modelowane jako belki sprężyste, dzięki czemu ich ugięcie jest proporcjonalne do siły przyłożonej do komórki. Poprzez ustawienie maksymalnego ugięcia cantilevera, maksymalna wartość siły przyłożonej do próbki jest ograniczona, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Odcinek krzywej siły od punktu b do punktu c na Rysunku 1, w którym końcówka wgniata się w komórkę, jest dopasowywany do modelu Hertza w celu wyznaczenia sztywności komórki.
<img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Proces ugięcia wspornika w mikroskopii sił atomowych; schemat z wykresem ugięcia w funkcji pozycji." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ilustracja mikroindentacji AFM i interpretacja krzywej siły. Górny panel przedstawia ruch wspornika AFM sterowanego przez skaner piezoelektryczny. Podczas procesu rejestrowane są pionowa pozycja wspornika z oraz sygnał ugięcia wspornika d. Wspornik startuje z punktu a, kilku mikrometrów nad komórką. Podczas zbliżania się do komórki wgniecenie próbki δ pozostaje równe zeru, aż do osiągnięcia punktu b, w którym końcówka styka się z komórką. Współrzędne punktu b na wykresie są wartościami krytycznymi dla analizy danych, oznaczonymi jako (z0, d0&gt;). Od punktu b do c wspornik wnika w komórkę, aż ugięcie wspornika osiągnie wartość zadaną, która jest określona jako stosunek docelowej maksymalnej siły wgniecenia do stałej sprężystości wspornika. Gdy sygnał ugięcia osiągnie zadaną wartość maksymalną, wspornik jest wycofywany z komórki do punktu d, w którym często jest przyciągany w dół z powodu adhezji końcówki do próbki, następnie odrywa się od komórki i powraca do położenia początkowego w punkcie e. Prawy panel ilustruje zależność między wgnieceniem a rejestrowanym sygnałem z i d . Na dolnym lewym panelu znajduje się wykres reprezentatywnej krzywej siły; maksymalne wgniecenie wspornika, którego zmierzona stała sprężystości wynosi 0,07N/m, zostało ustawione na 17 nm, tak aby maksymalna siła wgniecenia przyłożona do próbki wynosiła 1,2 nN. Zaznaczono kluczowe położenia podczas procesu indentacji.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop sił atomowych </td><td>Azyl badawczy</td><td>MFP3D-BIO</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Właściwości mechaniczne komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w różnicowaniu komórek macierzystych, tworzeniu nowotworów i gojeniu się ran. Zmiany sztywności komórek i ECM są często oznakami zmian w fizjologii komórek lub chorób tkanek. W związku z tym sztywność komórek jest wskaźnikiem służącym do oceny stanu kultur komórkowych. Wśród wielu metod stosowanych do pomiaru sztywności komórek i tkanek, mikrowgłębienie za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) zapewnia sposób na wiarygodny pomiar sztywności żywych komórek. Metoda ta jest szeroko stosowana do charakteryzowania sztywności w skali mikro dla różnych materiałów, od powierzchni metalowych po miękkie tkanki biologiczne i komórki. Podstawową zasadą tej metody jest wcięcie komórki z końcówką AFM o wybranej geometrii i zmierzenie przyłożonej siły od zgięcia wspornika AFM. Dopasowanie krzywej siła-wgniecenie do modelu Hertz dla odpowiedniej geometrii końcówki może dać ilościowe pomiary sztywności materiału. W artykule przedstawiono procedurę charakteryzowania sztywności żywych komórek za pomocą AFM. Przedstawiono kluczowe kroki, w tym proces kalibracji AFM, akwizycję krzywej siły i analizę danych przy użyciu procedury MATLAB. Omówiono również ograniczenia tej metody.

Rysunek 2a przedstawia trzy reprezentatywne krzywe siły uzyskane z fibroblastów 3T3 hodowanych odpowiednio na powierzchni plastikowej oraz na żelach poliakrylamidowych o modułach Younga 3 000 Pa i 17 000 Pa. Po dokładnym zidentyfikowaniu punktów styku na krzywych, siła wciskania jako funkcja deformacji komórki została naniesiona na Rysunek 2b. Przy sile o wartości mniejszej niż 0,3 nN, końcówka o kształcie piramidy wnika na głębokość 3 micrometers do wnętrza komórki hodowanej na żelu pol...

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest pomiar modułu sprężystości żywych komórek przy użyciu mikroskopu sił atomowych. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności pomiarów spektroskopii sił FM w różnych miejscach na komórce. W drugim kroku każda krzywa siła-odległość jest analizowana w celu wyznaczenia punktu, w którym końcówka AFM nawiązuje wstępny kontakt z komórką.Następnie, zaczynając od punktu styku, pierwsze 200 do 300 nanometrów danych z wciskania dopasowuje się do modelu Hertza. Aby wyznaczyć moduł sprężystości, wyniki generują dwuwymiarową mapę sztywności komórki uzyskaną przy użyciu trybu mapowania siły, w którym każdy piksel reprezentuje pojedynczą krzywą siła-odległość. Procedurę zaprezentuje Guen Thomas, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oczyścić uchwyt wspornika 70% etanolem i pozostawić go do wyschnięcia.Następnie zainstaluj w AFM wspornik bru DNP 10 zgodnie z instrukcją producenta. Następnie skalibruj czułość odwrotnej dźwigni optycznej. Parametr ten opisuje odpowiedź fotodiody wyrażoną w woltach na nanometr ugięcia wspornika.Aby to osiągnąć, najpierw umieść czyste szkiełko przedmiotowe na stoliku z próbką. Zainstaluj głowicę AFM i dostrój wiązkę lasera oraz wyrównanie zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyrównaniu, zetknij końcówkę AFM ze szkiełkiem przedmiotowym przy wycofanym P eight O.Ponownie ustaw lustro tak, aby odczyt fotodiody wynosił minus dwa wolty. Następnie przeprowadź pomiar spektroskopii sił z maksymalną odpowiedzią fotodiody lub punktem wyzwalającym wynoszącym plus dwa wolty. Po zakończeniu akwizycji danych powiększ obszar sztywnego kontaktu na krzywej siły i wykonaj dopasowanie liniowe do tego regionu.Aby wyznaczyć nachylenie w woltach na nanometr, należy zresetować ustawienie lustra do swobodnego ugięcia wynoszącego 0 V. Następnie należy skalibrować stałą sprężystości wspornika metodą strojenia termicznego opisaną przez Levy i Malam. Na początek należy podnieść skaner nad stolik z próbką, aby wyeliminować oddziaływania między wierzchołkiem a próbką.Następnie zarejestruj dane termiczne, mierząc drgania termiczne belki wspornika. Oprogramowanie AFM analizuje widmo mocy tych drgań termicznych i wyświetla je w oknie danych. Następnie przeprowadź dopasowanie do segmentu danych wycentrowanego na najniższej częstotliwości, znanej również jako podstawowy peak rezonansowy, aby wyznaczyć stałą sprężystości.W celu przygotowania a FM do płytek hodowlanych, zainstaluj akcesorium w postaci podgrzewacza naczyń na stoliku a FM i ustaw temperaturę na 37 °C. Odczekaj 20 minut, aż system osiągnie stabilną równowagę termiczną. Po wstępnym podgrzaniu umieść naczynie hodowlane na stoliku a FM i zabezpiecz je za pomocą zacisku dołączonego do podgrzewacza naczyń; w przypadku pomiarów trwających powyżej 30 minut należy zastosować pożywkę niezależną od dwutlenku węgla w miejsce standardowej pożywki hodowlanej.Następnie nanieś małą kroplę pożywki hodowlanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na końcówkę wspornika AFM i obniż głowicę AFM, aż końcówka zostanie całkowicie zanurzona w cieczy. Używając kamery CCD z widokiem z góry, ponownie ustaw wiązkę lasera na wsporniku. Ustawienie w cieczy będzie różnić się od ustawienia w powietrzu ze względu na zmianę współczynnika załamania światła ośrodka.Po wyrównaniu należy przyłożyć końcówkę AFM do obszaru naczynia hodowlanego wolnego od komórek i przeprowadzić kalibrację czułości odwróconej dźwigni optycznej w środowisku ciekłym. Aby rozpocząć pomiary właściwości mechanicznych komórek, należy umieścić końcówkę wspornika nad obszarem oka perły komórki, korzystając z mikroskopu optycznego. Precyzyjne korekty położenia wspornika wykonuje się poprzez wprowadzanie przesunięć w skanerach X i Y.Następnie przełącz AFM w tryb spektroskopii sił i ustaw szybkość wgłębiania na 5 µm/s, co jest wartością wystarczająco niską, aby uniknąć efektów hydrodynamicznych. Następnie ustaw punkt wyzwalania ugięcia na 2 nN. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, dostosuj tę wartość do sztywności próbki.Dodatkowo wybierz opcję wyzwalania względnego (relative triggering), która skoryguje ewentualny dryft sygnału ugięcia. Następnie ustaw odległość siły na 5 µm, aby zapewnić całkowite oddzielenie końcówki od komórki pomiędzy pomiarami siły. Zbierz trzy krzywe siły w różnych miejscach obszaru jądra dla co najmniej 30 komórek w każdym wariancie.Chociaż korzystne jest wykonanie wielu pomiarów krzywych dla każdej komórki, to w celu uzyskania wiarygodnych danych statystycznych należy pamiętać, że zbyt duża ich liczba może prowadzić do zmian sztywności komórki wskutek stresu wywołanego przez sondę AFM. Dalszą charakterystykę rozkładu właściwości mechanicznych w obrębie pojedynczej komórki przeprowadzono przy użyciu trybu mapowania sił.W trybie mapowania sił ustaw rozmiar skanowania na 30 micrometers, rozdzielczość na 32 na 32, a parametry wgłębienia pozostaw takie same, jak wybrane dla pojedynczych krzywych sił. A FM wykona następnie pomiary pojedynczych krzywych sił dla każdego piksela w obszarze próbki, tworząc mapę sztywności całego regionu. Następnie przeanalizuj zarejestrowane krzywe sił za pomocą programu MATLAB, aby obliczyć sztywność komórki.Należy rozpocząć od zastosowania algorytmu opublikowanego pierwotnie przez Lynette Al, który oblicza dopasowanie liniowe oraz dopasowanie Herzowskie dla każdego punktu przy użyciu programu matlab. Oblicz względny błąd RMS dla obu dopasowań i zsumuj te wartości w każdym punkcie. Punkt, dla którego całkowity błąd dopasowania jest minimalny, zostaje wybrany jako początkowy punkt kontaktu; zlokalizowanie tego punktu jest kluczowe dla dokładnego pomiaru modułu Younga komórek.Następnie oblicz deltę odkształcenia próbki. Skorzystaj z poniższych równań, przyjmując, że odkształcenie wynosi zero przed kontaktem z komórką, gdy Z jest mniejsze niż Z zero, oraz że jest ono równe różnicy między ugięciem wspornika D a całkowitym dystansem Z poza punktem kontaktu. Następnie oblicz siłę wgłębiania F, korzystając z poniższych równań, gdzie siła wynosi zero przed kontaktem z komórką, gdy Z jest mniejsze niż Z zero, oraz jest ona równa stałej sprężystości K wspornika pomnożonej przez ugięcie wspornika poza punktem kontaktu.Następnie dopasowanie kwadratu Elise jest stosowane do danych dotyczących odkształcenia próbki w funkcji siły wciskania w obszarze po kontakcie modelu Hertza, w celu wyznaczenia modułu Younga komórki na podstawie kształtu użytej końcówki. Przedstawiono tutaj reprezentatywne krzywe siły uzyskane z trzech komórek fibroblastów T3 hodowanych na trzech różnych powierzchniach. Jak widać, różne powierzchnie mogą w znacznym stopniu wpływać na sztywność cytoszkieletu komórkowego.Średnia deformacja komórek hodowanych na twardej powierzchni plastikowej zaznaczona jest kolorem czerwonym. Komórki hodowane na sztywnym żelu poliakrylamidowym zaznaczono kolorem fioletowym, a komórki hodowane na elastycznym żelu poliakrylamidowym kolorem niebieskim. Po dokładnym zidentyfikowaniu punktów styku na krzywych można precyzyjnie przedstawić siły wciskania jako funkcję deformacji komórek.Dodatkowo, ich moduł Younga można precyzyjnie obliczyć z pierwszych 300 nanometrów wniknięcia po nawiązaniu kontaktu. Przedstawiony tutaj fibroblast został przetransfekowany mentoną, rodzajem włókien pośrednich, znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym. Im jaśniejszy obraz, tym więcej mentony znajduje się w danym obszarze.Może to być związane ze sztywnością cytoszkieletu komórkowego. Wykorzystując przedstawioną tutaj technikę mapowania sił A FM, można uzyskać podobną mapę sztywności fibroblasta o rozdzielczości 32 na 32 piksele, gdzie każdy piksel reprezentuje obszar powierzchni komórki o wymiarach 2,5 na 2,5 mikrona. Po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli dobre wyobrażenie o tym, jak wykorzystać mikroskopię sił atomowych do pomiaru elastyczności żywych komórek tkankowych.

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Badanie właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Badania biomechaniki ściany komórkowej są niezbędne do zrozumienia wzrostu i morfogenezy roślin. Zaproponowano następujący protokół do zbadania cienkich pierwotnych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych organów roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Poznaj metodę pomiaru modułu sprężystości żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Technika ta umożliwia tworzenie dwuwymiarowych map sztywności komórkowej z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów