Pasażowanie komórek

Pasażowanie, czyli subkultywacja komórek, to powszechna procedura, w której komórki z danej hodowli są dzielone, czyli „splitowane”, na nowe hodowle i zasilane świeżą pożywką w celu umożliwienia ich dalszej ekspansji. Choć sama koncepcja jest stosunkowo prosta, w tym filmie omówimy niektóre z najważniejszych kroków niezbędnych do skutecznego utrzymania i namnażania linii komórkowych.

Toksyczne metabolity gromadzą się w pożywkach hodowlanych wraz z upływem czasu. Podczas namnażania komórek szczególnie ważne jest regularne zmienianie pożywki w celu utrzymania zdrowia komórek oraz monitorowanie ekspansji, aby zapobiec ich nadmiernemu rozrostowi.

Zazwyczaj subkulturowo dwa główne typy komórek: linie komórkowe unieśmiertelnione oraz linie komórek macierzystych

Linie komórkowe unieśmiertelnione to komórki pochodzące z organizmów wielokomórkowych, które uległy mutacji wpływającej na regulację cyklu komórkowego, co pozwala im na nieograniczoną proliferację. Być może najsłynniejszą unieśmiertelnioną linią komórkową jest linia HeLa, pochodząca z zmiany nowotworowej szyjki macicy pobranej podczas biopsji od pani Henrietty Lacks w 1951 roku.

W przeciwieństwie do linii unieśmiertelnionych przez proces nowotworowy, linie komórek macierzystych są generowane poprzez izolację komórek zdolnych do samoodnowienia i wielopotencjalnych z różnych tkanek, zarówno dorosłych, jak i embrionalnych. W odpowiednich warunkach komórki te, takie jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste widoczne tutaj, mogą być utrzymywane w kulturze w nieskończoność.

Komórki są hodowane optymalnie albo w zawiesinie, jak unieśmiertelnione komórki izolowane z krwi, albo rosną najlepiej po przytwierdzeniu do powierzchni, co ma miejsce w przypadku wielu komórek pochodzących z tkanek.

Wzrost tych komórek adherentnych musi być ściśle monitorowany, aby zapewnić ich zdrowie. W zależności od typu komórek, większość komórek adherentnych wymaga pasażowania, gdy osiągną 70-90% konfluencji, czyli gdy pokryją 70-90% powierzchni naczynia hodowlanego.

Należy pamiętać, że linie komórkowe zachowują wiele cech pierwotnej kultury, ale z każdym kolejnym pasażem mogą zacząć nabywać cechy charakterystyczne dla kultury ekspandowanej. Dlatego warto rozważyć ograniczenie liczby pasażowań pojedynczej kultury komórkowej.

Podczas pasażowania komórek ważne jest stosowanie technik sterylnych oraz odpowiednich odczynników i sprzętu.

Niezbędne jest użycie odpowiednich pożywek dla optymalnego wzrostu i ekspansji danej linii komórkowej. Każda linia komórkowa wymaga specyficznego koktajlu suplementów wzrostowych, jednak większość linii wymaga co najmniej suplementacji następującymi składnikami: surowicą, taką jak płodowa surowica bydlęca, która musi zostać poddana obróbce termicznej w celu inaktywacji dopełniacza bydlęcego i która dostarcza niezbędnych czynników wzrostu dla komórek, antybiotykami, takimi jak penicylina i streptomycyna, które pomagają ograniczyć wzrost zanieczyszczeń w hodowli, oraz innymi czynnikami wzrostu, takimi jak czynnik wzrostu fibroblastów, aby wspomóc przedłużenie wzrostu i ekspansji linii komórkowych. Suplementowaną, czyli „pełną”, pożywkę do hodowli komórkowych należy przechowywać w temperaturze 4 C, gdy nie jest używana.

Najpierw należy zwrócić uwagę na kolor pożywki do hodowli tkanek. Świeża pożywka do hodowli komórkowych jest bogata w składniki odżywcze i ma przejrzysty, pomarańczowy kolor, co wynika częściowo z dodania wskaźnika pH, czerwieni fenolowej.

W miarę jak komórki zużywają składniki odżywcze w pożywce, w hodowli komórkowej zaczynają gromadzić się produkty przemiany materii i kwasy, co obniża pH. Z tego powodu wiele pożywek do hodowli tkanek zawiera czerwień fenolową, która zmienia kolor pożywki z pomarańczowego na żółty, gdy komórki zakwaszają hodowlę. Należy wymienić pożywkę, zanim zmieni ona kolor!

Gdy czerwień fenolowa zabarwi pożywkę na kolor różowawy, co wskazuje, że pH stało się zbyt zasadowe dla zdrowego wzrostu komórek, może to być sygnał do wymiany butli z CO2, a także pożywki.

Większość adherentnych linii komórkowych przytwierdza się naturalnie do niepowlekanego plastiku. Dlatego do subkultury komórek często stosuje się plastikowe płytki do hodowli komórkowych, takie jak szalki Petriego lub płytki 6-dołkowe.

Stosowane są również plastikowe kolby do hodowli komórkowych. Na przykład kolba T25 jest często używana do ekspansji małych populacji linii komórkowych lub do rozpoczęcia wzrostu wolno namnażającej się linii komórkowej. Kolby T75 są powszechnie stosowane w przypadku linii komórkowych, które proliferują szybciej, lub w celu wygenerowania większej liczby komórek, niż mogłoby pomieścić naczynie T25.

Przy usuwaniu komórek adherentnych białka wiążące komórki z plastikiem muszą zostać najpierw rozszczepione. W tym celu często stosuje się enzym trawienny trypsynę. Ważne jest, aby precyzyjnie kontrolować czas ekspozycji na trypsynę, ponieważ zbyt długa inkubacja może doprowadzić do uszkodzenia innych białek powierzchniowych komórek.

Pożywki do hodowli komórkowych mogą zawierać neutralizatory trypsyny. Dlatego do przemywania komórek przed trypsynizacją często stosuje się roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo, czyli PBS.

Czasami stosuje się również EDTA, chelator wapnia, aby wzmocnić funkcję proteolityczną trypsyny.

W celu ekspansji kolonii komórkowej świeżo pasażowane komórki są następnie hodowane w inkubatorze do hodowli komórkowych w warunkach odpowiednich dla danej linii komórkowej, zazwyczaj w temperaturze około 37 C, przy 5% CO2 i 95% wilgotności.

Przed rozpoczęciem pracy należy określić, z jaką częstotliwością powinny być monitorowane komórki, co zależy od szybkości ich proliferacji.

Gdy pożywka uzyska właściwy pomarańczowy kolor, należy ocenić pozostałe warunki hodowli, takie jak mętność kultury – która może wskazywać na kontaminację – wielkość i gęstość kolonii komórkowych oraz ogólną kondycję komórek.

Jeśli komórki osiągnęły około 90% konfluencji, należy usunąć pożywkę do hodowli tkankowych i przemyć komórki roztworem PBS pozbawionym wapnia i magnezu.

Następnie do komórek należy dodać trypsynę i inkubować je w temperaturze 37 C. Po około 5 minutach należy potwierdzić, że komórki odkleiły się od podłoża, a następnie zatrzymać proteolizę poprzez dodanie świeżej pożywki do hodowli tkankowych.

Zawiesinę komórkową należy przenieść do probówki stożkowej w celu wirowania. Po odwirowaniu komórek należy ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie resuspendować komórki w świeżej pożywce. Należy policzyć zebrane komórki, a następnie wysiać je z gęstością odpowiednią do natychmiastowej lub późniejszej ekspansji.

Skoro już wiesz, jak pasażować komórki, przyjrzyjmy się różnym zastosowaniom tej metody.

Jak wspomniano wcześniej, ludzkie embrionalne komórki macierzyste są rodzajem komórek, które muszą być pasażowane. Zazwyczaj hoduje się je w kokulturze z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs), które dostarczają czynników pomagających komórkom macierzystym zachować stan pluripotencji.

Kolonie komórek macierzystych hodowane na komórkach karmiących muszą zostać „wybrane” po osiągnięciu odpowiedniego etapu rozwoju. Można je wyselekcjonować za pomocą mikropipety lub delikatnie zeskrobać szklanym narzędziem do pickowania, a następnie wysiać do nowej kultury w celu ekspansji.

Niektóre linie komórkowe są wrażliwe na trawienie enzymatyczne lub przylegają tak silnie, że nie można ich resuspendować przy użyciu samej trypsyny. Do delikatnego usuwania komórek z dna płytki hodowlanej można użyć skrobaka do komórek. Jeśli komórki wykazują szczególnie silną adhezję, należy spróbować poruszać pipetą serologiczną w zdecydowanym ruchu skrobiącym, jednocześnie płucząc dno naczynia z komórkami pożywką lub innym odpowiednim roztworem. Należy zachować ostrożność przy tej metodzie, ponieważ delikatne komórki mogą zostać uszkodzone podczas tak mechanicznego sposobu dysocjacji.

Aby szybciej i w sposób bardziej powtarzalny zwiększyć skalę ekspansji komórek niż jest to możliwe w kolbach jednowarstwowych, można zastosować kolby wielowarstwowe, które pozwalają na 3-5 krotny wzrost kultur komórkowych w porównaniu z kolbami jednowarstwowymi.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do pasażowania komórek. W tym filmie omówiliśmy, czym jest linia komórkowa, jak ją subkulturować oraz przedstawiliśmy różne zastosowania pasażowania komórek. Dziękujemy za oglądanie i pamiętajcie o zachowaniu świeżości mediów!