2.2: Komórki pasażujące

Pasażowanie lub subkulturacja komórek jest powszechną procedurą, w której komórki z danej kultury są dzielone lub "dzielone" na nowe kultury i karmione świeżymi pożywkami, aby ułatwić dalszą ekspansję. Chociaż sama koncepcja jest stosunkowo prosta, w tym filmie omówimy niektóre z ważniejszych kroków dla pomyślnego utrzymania i rozbudowy linii komórkowych.

Toksyczne metabolity z czasem gromadzą się w pożywkach do hodowli komórkowych. Podczas rozszerzania komórek szczególnie ważna jest regularna zmiana pożywki w celu utrzymania zdrowia komórek i monitorowania ekspansji komórek, aby uniknąć przerostu komórek.

Ogólnie rzecz biorąc, subhodowla obejmuje dwa główne typy komórek: unieśmiertelnione linie komórkowe i linie komórek macierzystych

Unieśmiertelnione linie komórkowe to komórki pochodzące z organizmów wielokomórkowych, które doświadczyły pewnego rodzaju mutacji wpływającej na regulację ich cyklu komórkowego, umożliwiając im rozmnażanie się w nieskończoność. Być może najbardziej znaną unieśmiertelnioną linią komórkową jest linia komórkowa HeLa, która wywodzi się ze zmiany raka szyjki macicy znalezionej podczas biopsji pobranej od pani Henrietty Lacks w 1951 roku.

W przeciwieństwie do linii komórkowych unieśmiertelnionych przez raka, linie komórek macierzystych są generowane przez izolację samoodnawiających się i multipotencjalnych komórek z różnych tkanek, zarówno z tkanek dorosłych, jak i embrionalnych. W odpowiednich warunkach komórki te, podobnie jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste, które tu widzisz, mogą być utrzymywane w hodowli w nieskończoność.

Komórki są albo optymalnie hodowane w zawiesinie, jak unieśmiertelnione komórki wyizolowane z krwi, albo rosną najlepiej, gdy przylegają do powierzchni, jak ma to miejsce w przypadku wielu komórek pochodzących z tkanki.

Wzrost tych przylegających komórek musi być ściśle monitorowany, aby zapewnić zdrowie komórek. W zależności od typu komórki, większość przylegających komórek musi zostać pasażowana, gdy zlewają się w 70-90%, to znaczy, gdy pokrywają 70-90% powierzchni pojemnika hodowlanego.

Należy pamiętać, że linie komórkowe zachowują wiele cech oryginalnej hodowli komórkowej, ale z każdym kolejnym pasażem mogą również zacząć nabierać cech unikalnych dla rozszerzonej hodowli. Dlatego rozważ ograniczenie liczby kontynuacji pasażu pojedynczej kultury komórkowej.

Podczas pasażowania komórek ważne jest, aby stosować sterylną technikę oraz odpowiednie odczynniki i sprzęt.

Niezbędne jest użycie odpowiednich pożywek dla optymalnego wzrostu i ekspansji linii komórkowej. Każda linia komórkowa będzie wymagała określonego koktajlu suplementów wzrostu, jednak większość linii komórkowych wymaga co najmniej suplementacji następującymi składnikami: surowica, taka jak płodowa surowica bydlęca, która musi być poddana obróbce cieplnej w celu dezaktywacji bydlęcego dopełniacza i która dostarcza niezbędnych czynników wzrostu dla komórek, antybiotyki, takie jak penicylina i streptomycyna, które pomagają ograniczyć zanieczyszczający wzrost w kulturze, i inne czynniki wzrostu, takie jak czynnik wzrostu fibroblastów, które pomagają przedłużyć wzrost i ekspansję linii komórkowych. Uzupełnioną lub "kompletną" pożywkę do hodowli komórkowych należy przechowywać w temperaturze 4 °C, gdy jej nie używasz.

Po pierwsze, zwróć uwagę na kolor pożywki do hodowli tkankowych. Świeża pożywka do hodowli komórkowych jest bogata w składniki odżywcze i ma wyraźny, pomarańczowy kolor, częściowo dzięki dodatkowi wskaźnika pH, czerwieni fenolowej.

Gdy komórki zaczynają zużywać składniki odżywcze w pożywce, odpady i kwas zaczynają gromadzić się w hodowli komórkowej, obniżając pH. Z tego powodu wiele pożywek do hodowli tkankowych zawiera czerwień fenolową, która zmienia kolor pożywki z pomarańczowego na żółty, gdy komórki zmieniają kolor kultury na kwaśny. Zmień nośnik, zanim zmieni kolor na ten kolor!

Kiedy czerwień fenolowa zmienia pożywkę na różowawy kolor, co wskazuje, że pH stało się zbyt podstawowe dla zdrowego wzrostu komórek, być może nadszedł czas, aby zmienić zbiornik CO2, a także pożywkę.

Większość przylegających linii komórkowych przyczepia się naturalnie do niepowlekanego tworzywa sztucznego. Dlatego plastikowe płytki do hodowli komórkowych, takie jak szalki Petriego lub płytki 6-dołkowe, są często używane do subhodowli komórek.

Stosuje się również plastikowe kolby do hodowli komórkowych. Na przykład kolba do hodowli komórkowych T25 jest często używana do rozszerzania populacji małych linii komórkowych lub do rozpoczęcia wzrostu powoli rozszerzającej się linii komórkowej. Kolby hodowlane T75 są powszechnie stosowane w liniach komórkowych, które proliferują szybciej lub do generowania większej liczby komórek, niż można zmieścić w kolbie T25.

Podczas usuwania przylegających komórek należy najpierw rozszczepić białka, które wiążą komórki z tworzywem sztucznym. W tym celu często stosuje się enzym trawienny trypsynę. Ważne jest, aby dokładnie określić czas ekspozycji na trypsynę, ponieważ zbyt długie leczenie może spowodować uszkodzenie innych białek powierzchniowych komórek.

Pożywki do hodowli komórkowych mogą zawierać neutralizatory trypsyny. Dlatego sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub PBS jest często używana do mycia komórek przed trypsynizacją.

EDTA, chelator wapnia, jest czasami stosowany w celu wzmocnienia funkcji proteolitycznej trypsyny.

W celu ekspansji kolonii komórkowej świeżo pasażowane komórki są następnie hodowane w inkubatorze do hodowli komórkowych w warunkach odpowiednich dla tej linii komórkowej, zwykle w temperaturze około 37 ° C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

Zanim zaczniesz, ważne jest, aby zrozumieć, jak często twoje komórki powinny być monitorowane, co będzie zależeć od tego, jak szybko twoje komórki się rozmnażają.

Teraz, gdy twoje podłoże ma szczęśliwy pomarańczowy kolor, obserwuj inne warunki hodowli, takie jak to, czy kultura jest mętna – co może wskazywać na zanieczyszczenie – rozmiar i gęstość kolonii komórkowych oraz ogólną jakość komórek.

Jeśli komórki osiągnęły około 90% zbieżności, usuń pożywkę do hodowli tkankowej i umyj komórki PBS bez wapnia i magnezu.

Teraz dodaj trypsynę do komórek, a następnie inkubuj je w temperaturze 37 C. Po około 5 minutach upewnij się, że komórki się odłączyły, a następnie zatrzymaj proteolizę, dodając świeże podłoże do hodowli tkankowych.

Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki w celu odwirowania. Następnie, po odwirowaniu komórek, ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce. Policz, ile komórek zebrałeś, a następnie zasiej komórki zgodnie z gęstością odpowiednią do natychmiastowej lub późniejszej ekspansji.

Teraz, gdy wiesz już, jak przechodzić przez komórki, przyjrzyjmy się kilku różnym zastosowaniom tej metody.

Jak wspomniano wcześniej, ludzkie embrionalne komórki macierzyste są rodzajem komórek, które muszą zostać pasażowane. Są one zazwyczaj hodowane wspólnie z mysimi fibroblastami embrionalnymi lub MEF, które dostarczają czynników pomagających komórkom macierzystym zachować stan pluripotencjalny.

Kolonie komórek macierzystych hodowane na komórkach zasilających muszą zostać "pobrane", gdy osiągną odpowiedni etap rozwoju. Można je wybrać za pomocą mikropipety lub delikatnie zeskrobywać za pomocą narzędzia do zbierania szkła, a następnie posiać w nowej kulturze w celu ekspansji.

Niektóre linie komórkowe są wrażliwe na trawienie enzymatyczne lub są tak ściśle przylegające, że nie można ich ponownie zawiesić za pomocą samego leczenia trypsyną. Skrobak do komórek może być użyty do delikatnego usunięcia komórek z dna płytki hodowlanej. Jeśli komórki są szczególnie przylegające, spróbuj przesunąć pipetę serologiczną zdecydowanym ruchem skrobania, jednocześnie spłukując dno pojemnika na komórki pożywką lub innym odpowiednim roztworem. Zachowaj ostrożność przy tej metodzie, ponieważ delikatne komórki mogą zostać uszkodzone przez tę mechaniczną metodę dysocjacji.

Aby szybciej i bardziej powtarzalnie zwiększyć ekspansję komórek niż można to osiągnąć w kolbach jednowarstwowych, można zastosować kolby wielowarstwowe, które mogą zwiększyć hodowle komórkowe 3-5 razy w porównaniu z kolbami jednowarstwowymi.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do komórek pasażujących. W tym filmie omówiliśmy, czym jest linia komórkowa, jak ją subkulturować i jakie są różne zastosowania komórek pasażujących. Dziękujemy za oglądanie i pamiętaj, aby Twoje multimedia były świeże!