Podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

Wiele eksperymentów biomedycznych wymaga manipulacji znaną ilością komórek, aby uzyskać dokładne, powtarzalne i istotne statystycznie dane. Dlatego nauka liczenia komórek jest szczególnie istotną techniką dla każdego naukowca zajmującego się biomedycyną. Najczęstszym sposobem liczenia komórek jest użycie hemacytometru – instrumentu posiadającego dwie grawerowane laserowo siatki, które ułatwiają enumerację alikwoty komórek pod zwykłym mikroskopem świetlnym. Dane te mogą być następnie...

Linie komórkowe są często wykorzystywane w eksperymentach biomedycznych, ponieważ umożliwiają szybką hodowlę i namnażanie typów komórek do analiz eksperymentalnych. Linie komórkowe hoduje się w warunkach podobnych do tych stosowanych dla komórek świeżo wyizolowanych, czyli pierwotnych, jednak z kilkoma istotnymi różnicami: (i) linie komórkowe wymagają specyficznych dla nich koktajli czynników wzrostu oraz (ii) ich wzrost musi być monitorowany dokładniej niż w przypadku komórek pierwotnych,...

Reakcja łańcuchowa polimerazy, czyli PCR, jest techniką służącą do amplifikacji DNA poprzez termocykling – cykle zmian temperatury w stałych odstępach czasu. Wykorzystując termostabilną polimerazę DNA, PCR pozwala na stworzenie licznych kopii DNA z bloków budulcowych DNA nazywanych dNTPs. W PCR wyróżnia się  trzy etapy: denaturację, przyłączanie (annealing) oraz elongację. Denaturacja jest pierwszym etapem cyklu i powoduje rozplecenie DNA poprzez zerwanie wiązań wodorowych między zasadami, co...

Elektroforeza żelu DNA jest techniką stosowaną do detekcji i rozdziału cząsteczek DNA. Do macierzy żelowej składającej się z agarozy przykłada się pole elektryczne, w którym naładowane cząstki migrują i rozdzielają się w zależności od wielkości. Ujemnie naładowane grupy fosforanowe szkieletu DNA powodują przemieszczanie się fragmentów DNA w stronę anody – dodatnio naładowanej elektrody. Film wyjaśnia mechanizm rozdziału fragmentów DNA w żelu agarozowym oraz przedstawia ogólną procedurę krok po...

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, czyli SDS-PAGE, jest powszechnie stosowaną techniką rozdzielania mieszanin białek wyłącznie na podstawie ich wielkości. SDS, będący detergentem anionowym, służy do nadania jednorodnego ładunku wzdłuż cząsteczek białek po ich linearyzacji. Białka pokryte SDS są rozdzielane poprzez ich naniesienie na żel poliakrylamidowy, a następnie przyłożenie do żelu pola elektrycznego. Pole elektryczne stanowi siłę napędową, przyciągając białka...

Transformacja to proces, który zachodzi, gdy komórka pobiera obcy DNA z otoczenia. Transformacja może występować w naturze u niektórych rodzajów bakterii. W biologii molekularnej transformację odtwarza się sztucznie w laboratorium poprzez tworzenie porów w błonach komórkowych bakterii. Komórki bakteryjne zdolne do pobierania DNA ze środowiska nazywa się komórkami kompetentnymi. W warunkach laboratoryjnych komórki bakteryjne można uczynić kompetentnymi, a następnie wprowadzić do nich DNA za...

Termin „transformacja” odnosi się do wchłaniania obcego DNA przez komórkę. W naturze transformacja może zachodzić w określonych typach bakterii. W biologii molekularnej transformacja jest jednak indukowana sztucznie poprzez tworzenie porów w ścianach komórkowych bakterii. Komórki bakteryjne zdolne do pobierania DNA ze środowiska nazywa się komórkami kompetentnymi. Komórki elektrokompetentne mogą być wytwarzane w laboratorium, a transformację tych komórek można osiągnąć poprzez zastosowanie pola...

Test immunoenzymatyczny (ELISA) jest zazwyczaj przeprowadzany w celu wykrycia obecności i/lub ilości docelowego białka w próbce doświadczalnej. Wykrycie białka docelowego jest możliwe dzięki przeciwciałom, co czyni ELISA testem immunoenzymatycznym. Poprzez serię etapów inkubacji i przemywania przeciwciała te, które są często połączone, czyli sprzężone z enzymem, wykrywają białko pokrywające dno dołka na płytce mikrotitracyjnej. Po dodaniu substratu enzym związany z przeciwciałem spowoduje...

Oczyszczanie plazmidów to technika stosowana do izolacji i oczyszczania plazmidowego DNA z DNA genomowego, białek, rybosomów oraz bakteryjnej ściany komórkowej. Plazmid to niewielka, kolista, dwuniciowa cząsteczka DNA, która służy jako nośnik specyficznych cząsteczek DNA. Po wprowadzeniu do organizmu gospodarza poprzez transformację, plazmid ulega replikacji, tworząc liczne kopie badanego fragmentu DNA. W tym filmie opisano krok po kroku uogólnioną procedurę oczyszczania plazmidów. Oczyszczanie...

Oczyszczanie z żelu stosuje się w celu odzyskania fragmentów DNA po rozdziałie elektroforetycznym. Odzyskiwanie DNA z żelu agarozowego obejmuje trzy podstawowe etapy: wiązanie, przemywanie oraz elucję z kolumny krzemionkowej. Przyjmuje się, że DNA wiąże się z krzemionką w obecności wysokiego stężenia soli za pomocą mostka solnego. Po związaniu DNA jest przemywane z zanieczyszczeń i eluowane w warunkach niskiego stężenia soli, co prowadzi do przerwania tej oddziaływania. W tym filmie...

Western blotting jest wykorzystywany do identyfikacji obecności specyficznych białek w próbkach rozdzielonych elektroforetycznie. Po rozdziale za pomocą techniki znanej jako elektroforeza w żelach poliakrylamidowych z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), przeprowadza się transfer białek z żelu poliakrylamidowego na membranę, która zatrzymuje białka w ich odpowiednich pozycjach. Następnie membrany poddaje się inkubacji z przeciwciałami w procesie zwanym immunoblottingiem. Immunoblotting...

Transfekcja jest procesem wprowadzania materiału genetycznego, takiego jak DNA i dwuniciowy RNA, do komórek ssaków. Wprowadzenie DNA do komórki umożliwia ekspresję, czyli produkcję białek przy użyciu własnego aparatu komórkowego, natomiast wprowadzanie RNA do komórki służy do wyciszenia produkcji konkretnego białka poprzez zatrzymanie translacji. Podczas gdy miejscem działania transfekowanego RNA jest cytoplazma, DNA musi zostać przetransportowane do jądra komórkowego, aby transfekcja była...

W biologii molekularnej ligacja odnosi się do łączenia dwóch fragmentów DNA poprzez tworzenie wiązania fosfodiestrowego. Reakcję ligacji katalizuje enzym znany jako ligaza. W komórce ligazy naprawiają pęknięcia pojedynczej i podwójnej nici, które powstają podczas replikacji DNA. W laboratorium ligaza DNA jest wykorzystywana podczas klonowania molekularnego do łączenia fragmentów DNA insertów z wektorami – cząsteczkami DNA nośnikami, które będą replikować fragmenty docelowe w organizmach...

Enzymy restrykcyjne lub endonukleazy rozpoznają i przecinają DNA w specyficznej sekwencji. Enzymy te występują naturalnie w bakteriach jako mechanizm obrony przed bakteriofagami – wirusami infekującymi bakterie. Bakteryjne enzymy restrykcyjne przecinają wnikające DNA bakteriofagów, pozostawiając nienaruszone genomowe DNA bakterii dzięki dodaniu grup metylowych. W tym filmie wyjaśniono podstawowe zasady działania enzymów restrykcyjnych, w tym: sposób nazywania enzymów restrykcyjnych oraz rodzaje...

Klonowanie molekularne to zespół metod służących do wprowadzenia rekombinowanego DNA do wektora – nośnika cząsteczek DNA, który będzie replikował fragmenty rekombinowanego DNA w organizmach gospodarzach. Fragment DNA, którym może być gen, można wyizolować z próbki prokarjotycznej lub eukarjotycznej. Po wyizolowaniu interesującego fragmentu, czyli insertu, zarówno wektor, jak i insert muszą zostać przecięte enzymami restrykcyjnymi i oczyszczone. Oczyszczone fragmenty są łączone za pomocą...