Podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

Wiele eksperymentów biomedycznych wymaga manipulacji znaną liczbą komórek w celu uzyskania dokładnych, powtarzalnych i statystycznie istotnych danych. Dlatego nauczenie się, jak liczyć komórki, jest szczególnie istotną techniką dla każdego odnoszącego sukcesy naukowca biomedycznego. Najczęstszym sposobem liczenia komórek jest użycie hemacytometru - przyrządu, który zawiera dwie laserowo wytrawione siatki, które pomagają w wyliczeniu podwielokrotnych komórek pod prostym mikroskopem świetlnym.

Linie komórkowe są często wykorzystywane w eksperymentach biomedycznych, ponieważ umożliwiają szybką hodowlę i ekspansję typów komórek do analizy eksperymentalnej. Linie komórkowe są hodowane w podobnych warunkach w porównaniu do komórek świeżo wyizolowanych lub pierwotnych, ale z pewnymi podstawowymi istotnymi różnicami: (i) linie komórkowe wymagają własnych specyficznych koktajli czynników wzrostu oraz (ii) ich wzrost musi być ściślej monitorowany niż komórki pierwotne, ponieważ mutacje,...

Reakcja łańcuchowa polimerazy lub PCR to technika stosowana do amplifikacji DNA poprzez termocykle – cykle zmian temperatury w ustalonych odstępach czasu. Wykorzystując termostabilną polimerazę DNA, PCR może tworzyć liczne kopie DNA z bloków budulcowych DNA zwanych dNTP. W PCR występują trzy etapy: denaturacja, wyżarzanie i wydłużenie. Denaturacja jest pierwszym krokiem w cyklu i powoduje topnienie DNA poprzez zakłócanie wiązań wodorowych między zasadami, w wyniku czego powstaje jednoniciowe...

Elektroforeza żelowa DNA jest techniką stosowaną do wykrywania i rozdzielania cząsteczek DNA. Pole elektryczne jest przykładane do matrycy żelowej składającej się z agarozy, a wewnątrz żelu cząstki ładunku będą migrować i rozdzielać się w zależności od rozmiaru. Ujemnie naładowane fosforany szkieletu DNA powodują, że fragmenty DNA przemieszczają się w kierunku anody - dodatnio naładowanej elektrody. Film wyjaśnia mechanizm, za pomocą którego fragmenty DNA są rozpuszczane w żelu agarozowym i...

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu lub SDS-PAGE jest szeroko stosowaną techniką rozdzielania mieszanin białek na podstawie ich wielkości i niczego więcej. SDS, anionowy detergent, jest używany do wytwarzania równomiernego ładunku na całej długości białek, które zostały zlinearyzowane. Najpierw ładując je do żelu wykonanego z poliakrylamidu, a następnie przykładając pole elektryczne do żelu, białka pokryte SDS są następnie oddzielane. Pole elektryczne działa jako siła...

Transformacja to proces, który zachodzi, gdy komórka połyka obce DNA z otoczenia. Przemiana może zachodzić w naturze w niektórych typach bakterii. W biologii molekularnej transformacja jest sztucznie odtwarzana w laboratorium poprzez tworzenie porów w błonach komórkowych bakterii. Komórki bakteryjne, które są w stanie pobierać DNA ze środowiska, nazywane są komórkami kompetentnymi. W laboratorium komórki bakteryjne mogą być kompetentne, a następnie wprowadzone DNA za pomocą procedury zwanej...

Termin "transformacja" odnosi się do komórkowego spożycia obcego DNA. W naturze przemiana może zachodzić w niektórych typach bakterii. Jednak w biologii molekularnej transformacja jest sztucznie wywoływana poprzez tworzenie porów w ścianach komórkowych bakterii. Komórki bakteryjne, które są w stanie pobierać DNA ze środowiska, nazywane są komórkami kompetentnymi. Elektrokompetentne komórki mogą być produkowane w laboratorium, a transformacja tych komórek może być osiągnięta poprzez...

Test immunoenzymatyczny (ELISA) jest zwykle wykonywany w celu wykrycia obecności i/lub ilości białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania w próbce eksperymentalnej. Wykrycie białka docelowego jest możliwe dzięki przeciwciałom, które sprawiają, że test ELISA jest testem immunologicznym. Poprzez serię etapów inkubacji i mycia, te przeciwciała, które często są połączone lub sprzężone z enzymem, wykryją białko pokrywające dno studzienki na płytce do mikromiareczkowania. Po wystawieniu na...

Oczyszczanie plazmidu to technika stosowana do izolowania i oczyszczania plazmidowego DNA z genomowego DNA, białek, rybosomów i ściany komórkowej bakterii. Plazmid to mały, okrągły, dwuniciowy DNA, który jest używany jako nośnik określonych cząsteczek DNA. Po wprowadzeniu do organizmu gospodarza w drodze transformacji, plazmid zostanie zreplikowany, tworząc liczne kopie badanego fragmentu DNA. W tym filmie opisano krok po kroku uogólnioną procedurę oczyszczania plazmidu. Oczyszczanie...

Oczyszczanie żelu służy do odzyskiwania fragmentów DNA po separacji elektroforetycznej. Odzyskiwanie DNA z żelu agarozowego obejmuje trzy podstawowe etapy: wiązanie, płukanie i elucję z kolumny krzemionkowej. Uważa się, że DNA wiąże się z krzemionką w obecności wysokiej zawartości soli poprzez mostek solny. Po związaniu DNA jest oczyszczane z zanieczyszczeń i eluowane w warunkach niskiej zawartości soli, zakłócając tę interakcję. Ten film omawia krok po kroku, uogólnioną procedurę wycinania...

Western Blotting służy do identyfikacji obecności określonych białek w próbkach oddzielonych elektroforetycznie. Po rozdzieleniu techniką znaną jako elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu lub SDS-PAGE, transfer zachodni jest stosowany do przenoszenia białek z żelu poliakrylamidowego na kawałek błony, który zatrzymuje białka w ich odpowiednich miejscach. Następnie błony są badane przeciwciałami w procesie zwanym immunboblottingiem. Immunoblotting wykorzystuje wiązanie...

Transfekcja to proces wprowadzania materiału genetycznego, takiego jak DNA i dwuniciowe RNA, do komórek ssaków. Wprowadzenie DNA do komórki umożliwia ekspresję lub produkcję białek przy użyciu własnej maszynerii komórki, podczas gdy wprowadzenie RNA do komórki służy do obniżenia produkcji określonego białka poprzez zatrzymanie translacji. Podczas gdy miejscem działania transfekowanego RNA jest cytoplazma, DNA musi zostać przetransportowane do jądra, aby zapewnić skuteczną transfekcję. Tam DNA...

W biologii molekularnej ligacja odnosi się do łączenia dwóch fragmentów DNA poprzez tworzenie wiązania fosfodiestrowego. Enzym znany jako ligaza katalizuje reakcję ligacji. W komórce ligazy naprawiają pęknięcia pojedynczej i podwójnej nici, które zachodzą podczas replikacji DNA. W laboratorium ligaza DNA jest wykorzystywana podczas klonowania molekularnego do łączenia fragmentów DNA insercji z wektorami – nośnikowymi cząsteczkami DNA, które będą replikować docelowe fragmenty w organizmach...

Enzymy restrykcyjne lub endonukleazy rozpoznają i przecinają DNA w określonej sekwencji. Enzymy te występują naturalnie w bakteriach jako obrona przed bakteriofagami - wirusami, które infekują bakterie. Bakteryjne enzymy restrykcyjne przecinają inwazyjne DNA bakteriofagów, pozostawiając DNA genomowe bakterii nieuszkodzone w wyniku dodania grup metylowych. Ten film wyjaśnia podstawowe zasady enzymów restrykcyjnych, w tym: jak nazywane są enzymy restrykcyjne oraz rodzaje istniejących miejsc...

Klonowanie molekularne to zestaw metod, które służą do wprowadzania rekombinowanego DNA do wektora - nośnika cząsteczek DNA, które będą replikować rekombinowane fragmenty DNA w organizmach gospodarza. Fragment DNA, który może być genem, można wyizolować z próbki prokariotycznej lub eukariotycznej. Po wyizolowaniu fragmentu będącego przedmiotem zainteresowania lub wstawki, zarówno wektor, jak i wstawka muszą zostać przecięte enzymami restrykcyjnymi i oczyszczone. Oczyszczone kawałki są...