Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest znakowanie interesujących białek radioaktywnymi fosforanami w celu ilościowego określenia białek, poziomów fosforylacji komórkowej. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek w obecności fosforu 32 w celu radioaktywnego znakowania modyfikacji fosforanów białek ulegających ekspresji w komórkach. W drugim etapie znakowane komórki są poddawane lizie, a lizaty są inkubowane z kulkami powinowactwa w celu oczyszczenia immunologicznego białek, które mają być analizowane.

Następnie próbki znakowanych i oczyszczonych białek są poddawane elektroforezie w żelu sodowym i odsalowym siarczanowi poliakrylamidowym, a następnie osuszane do membran z fluorku poliolainy. W celu wykrycia inkorporacji radioaktywnych fosforanów i poziomów białek uzyskuje się wyniki, które pokazują, że bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe jeden i dwa, w skrócie L rrk jeden i L rrk 2 są fosforylowane w komórkach do porównywalnych poziomów w oparciu o autoradiografię i detekcję immunologiczną. Główną zaletą techniki znakowania metabolicznego w porównaniu z innymi technikami, takimi jak fosfo, immunoblotting, jest to, że technika ta pozwala na określenie całkowitego poziomu fosforylacji komórkowej białek, w tym białek, dla których nie są dostępne przeciwciała fosfo.

Drugą ważną zaletą tej techniki jest to, że można przeprowadzać porównania ilościowe między różnymi białkami pod względem ich całkowitego poziomu fosforylacji komórkowej. Demonstracją procedury będzie F gao, technik z naszego laboratorium Aby rozpocząć hodowlę linii komórek T HEC 2 93 zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli w zmodyfikowanym dcos orzeł, pożywce lub DMM z 8% płodu cielęcia, surowicy i gentamycyny. Rozwiń płytkę i wyraź potrójną flagę oznaczoną L rrk dwa białko poprzez transfekcję lub transdukcję za pośrednictwem wektora lentiwirusowego, jak omówiono w protokole tekstowym.

Gdy komórki są w 80 do 100% zlewne, przepłucz je wstępnie ciepłym dmm bez fosforanów. Pod przepływem laminarnym przygotuj probówkę sokoła z 2,1 mililitra bezfosforanowej masy na m na sześciodołkową płytkę komórek, która ma być oznaczona fosforem. 32 ortofosforan.

Przygotuj stanowisko, na którym będą wykonywane eksperymenty z promieniowaniem jonizującym. Przestrzeń robocza pokryta jest matą rozlewną, na której umieszczona jest ochronna wyściółka z materiału chłonnego. Zapewnij również słoik z pleksiglasu na miejscu pracy i umieść w nim probówkę z podłożem bezfosforanowym.

Wyjąć z lodówki wyłożony ołowiem pojemnik z fiolką ortofosforanu oznaczoną fosforem 32 i przenieść go na stół radioaktywny. Monitorować pojemnik pod kątem zewnętrznego skażenia radioaktywnego za pomocą licznika Geigera, rozcieńczyć ortofosforan oznaczony fosforem 32 do probówki z dmem wolnym od fosforanów. Dodaj stężenie 24 mikrokiurów na mililitr.

Trzymaj probówkę w słoiku z pleksiglasu. Zamknij pojemnik z pozostałą częścią ortofosforanu oznaczonego fosforem 32 przed włożeniem go z powrotem do lodówki. Następnie wyjąć z inkubatora sześć płytek dołkowych z komórkami, które mają być oznaczone, i umieścić na stole radioaktywnym.

Usunąć sklarowany osad i wyrzucić. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki bezfosforanowej zawierającej fosfor. 32 znakowane ortofosforany na studzienkę.

Umieść płytki hodowlane w pudełku z pleksiglasu, a następnie monitoruj pojemnik pod kątem zewnętrznego skażenia radioaktywnego za pomocą licznika Geigera. Następnie przenieś pudełko z pleksiglasu z komórkami do inkubatora komórek eukariotycznych dedykowanego do izotopowego znakowania metabolicznego i inkubuj komórki przez jedną do 20 godzin. Na tym etapie protokołu komórki można w razie potrzeby potraktować związkiem, zgodnie z instrukcjami w protokole tekstowym Po leczeniu komórek i inkubacji usuń pożywkę z komórek i wrzuć do probówki do zbierania odpadów, którą umieszcza się w słoiku z pleksiglasu.

Przepłucz komórki dwa razy dwoma mililitrami lodowatej soli fizjologicznej. Wylanie roztworu płuczącego do rurki do zbierania odpadów. Następnie dodaj 0,5 mililitra lodowatego buforu do lizy immunoprecypitacji do każdej studzienki i zbierz lizat, pipetując w górę iw dół.

W celu rozluźnienia wszystkich zlizowanych komórek, należy przenieść lizat do probówki z mikrowirówką i inkubować na lodzie co najmniej 10 minut przed wirowaniem, zgodnie z zaleceniami w protokole tekstowym, w celu wyizolowania interesującego białka przez oczyszczanie immunologiczne. Najpierw przenieś mikroprobówki wirówkowe z lizatami wirówkowymi z powrotem do lodu. Następnie pipetować supernatant do mikroprobówek wirówkowych zawierających 10 mikrolitrów złoża Objętość flagi M dwie prędkości.

Równowagę, jak omówiono w protokole tekstowym, przenieś mikroprobówki wirówkowe do probówki o pojemności 50 mililitrów. Po przeniesieniu probówek do mikrowirówek do oznakowanych 50-mililitrowych probówek na lodzie, umieścić próbki na urządzeniu obrotowym za osłoną z pleksiglasu w wyznaczonym obszarze chłodni do mieszania koniec po końcu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do 20 godzin po inkubacji, odwirować związaną z białkiem flagę M dwa kulki aro w mikroprobówkach wirówkowych po wyrzuceniu supernatantu do probówki do zbierania odpadów. Przystąp do mycia koralików zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie ponownie zawieś umyte kulki w 40 mikrolitrach bufora ładującego SDS próbki IP: Podgrzej próbki w buforze ładującym do 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie odwiruj przez jedną minutę z prędkością większą niż 1000 razy g, aby zagnieździć kulki, przygotować moduł elektroforezy żelu białkowego na stole radioaktywnym za ekranem perspec. Załaduj próbki do trzech do 8% T octanu trisu SDS żele stronicowe, w tym marker masy cząsteczkowej, który jest odpowiedni do rozróżnienia rozmiarów białek o dużej masie cząsteczkowej przed wykonaniem elektroforezy. Po elektroforezie wyjmij żel z plastikowej osłonki i przenieś do pojemnika z buforem transferowym western blotting.

Po przygotowaniu żelu i membrany PVDF. Przygotuj kanapkę z bibułą na powierzchni modułu do bibuły półsuchej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenoś białka pod napięciem 15 woltów przez jedną do dwóch godzin po przeniesieniu.

Usuń membranę PVDF z osuszonymi białkami z modułu bibuły i wysusz membranę, aby wykonać automatyczną radiografię. Najpierw wystaw membranę na działanie płytki fosforescencyjnej na jeden do pięciu dni. Odczytaj fosfor 32 z naświetlonej płytki fosforescencyjnej za pomocą skanera fosforescencji i zapisz obraz jako tiff o wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia poziomów białka za pomocą detekcji immunologicznej.

Ponownie uwodnić błony, zanurzając je na krótko w metanolu, a następnie przenosząc do płytkiego naczynia inkubacyjnego z PBS. Zablokować błony w PBST zawierającym 5% mleka. Inkubować bloty z przeciwciałem anty LR K two lub przeciwciałem Anti-Flag i przetwarzać dalej za pomocą odpowiednich etapów przemywania i inkubacji przeciwciał wtórnych.

Po zastosowaniu przeciwciał wykonaj detekcję chemiluminescencyjną, aby potwierdzić względny poziom białka LRRK dwa. Wreszcie, ilościowe określenie korporacji fosforu 32 w LRK dwa za pomocą analizy diametrycznej, jak opisano w protokole tekstowym Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki znakowania metabolicznego L Rrk jeden i L Rrk dwa w limfocytach T HEC 2 93. Na zdjęciu przedstawiono reprezentatywny radiogram samochodowy inkorporacji fosforu 32, a także reprezentatywny western blot wykrywania L Rrk jeden i L Rrk dwa za pomocą ich potrójnych znaczników flagowych.

Włączenie fosforanu promieniotwórczego obserwuje się zarówno dla L rrk jeden, jak i L rrk dwa. Po ilościowym określeniu fosforu poziomy 32 znormalizowały się do poziomów białka mierzonych za pomocą analizy metrycznej gęstości detekcji immunologicznej z przeciwciałem Anti-Flag. Stwierdzono, że L rrk jeden miał średni poziom fosforylacji, który jest niższy niż L rrk dwa w badanych warunkach, chociaż istotność statystyczna nie została osiągnięta, Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak bardzo osobiste środki ochrony i praca zgodnie z procedurami zapewnionymi przez dział bezpieczeństwa Twojej instytucji, powinny być zawsze podejmowane poprzez wykonanie tego protokołu.