Name: Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę znakowania metabolicznego kinaz LRRK1 i LRRK2 radioaktywnym fosforem-32 w komórkach HEK293T. Technika umożliwia ilościowe określenie całkowitego poziomu fosforylacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy również wdzięczni Fundacji Michaela J. Foxa, która wspiera to badanie. Dziękujemy Fundacji Badawczej - Flandria FWO (projekt FWO G.0666.09, stypendium dla starszych badaczy w JMT), projektowi IWT SBO/80020 Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A i IOF-KP/07/001) za ich wsparcie. Badania te były również częściowo wspierane przez Fundusz Druwé-Eerdekens zarządzany przez Fundację Króla Baudouina na rzecz JMT.

<ol><li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158(2011).</li>
<li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).</li>
<li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dominant+parkinsonism%3B+the+toxic+triangle+of+LRRK2%2C+alpha-synuclein+and+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li>
<li>Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Roco+protein+family%3A+a+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Roco protein family: a functional perspective.</a> FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson+disease+gene+LRRK2%3A+evolutionary+and+structural+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Evol%22%5BJournal%5D)">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li>
<li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2%3A+from+kinase+to+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li>
<li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson%27s+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li>
<li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2%2Fdardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li>
<li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li>
<li>Daniëls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li>
<li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472(2012).</li>
<li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono podstawowy protokół oznaczania ogólnego poziomu fosforylacji LRRK1 i LRRK2 w liniach komórkowych za pomocą znakowania metabolicznego za pomocą 32P-ortofosforanu. Ogólna strategia jest prosta. Białka LRRK znakowane powinowactwem ulegają ekspresji w HEK293T komórkach, które są wystawione na działanie pożywki zawierającej 32P-ortofosforany. 32P-ortofosforan jest asymilowany przez komórki już po kilku godzinach inkubacji, a wszystkie cząsteczki w komórce zawierające f...

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi paralogami, które mają podobną organizację domenową. Oba białka kodują sekwencję GTPazy podobną do rodziny Ras GTPaz (Ras of Complex Proteins lub ROC), a także C-koniec domeny ROC (COR), skutecznie klasyfikując oba białka do rodziny białek ROCO5,6. N-koniec tandemu domeny ROC-COR, oba białka kodują bogatą w leucynę domenę powtórzeniową, a także domenę podobną do ankyryny, podczas gdy tylko LRRK2 koduje dodatkową kopułę pancernika6-8. C-koniec ROC-COR, oba białka mają wspólną domenę kinazy serynowo-treoninowej podczas gdy tylko LRRK2 koduje domenę WD40 w regionie C-końcowym8. Dokładne role komórkowe LRRK1 i LRRK2 nie zostały jeszcze wyjaśnione, jednak LRRK1 jest zaangażowany w sygnalizację receptora kinazy tyrozynowej1,2 , podczas gdy dowody genetyczne wskazują na rolę LRRK2 w patogenezie choroby Parkinsona3,4 .
Fosforylacja białek jest powszechnym mechanizmem regulacyjnym w komórkach. Na przykład fosforylacja może być niezbędna do aktywacji enzymów lub rekrutacji białek do kompleksu sygnalizacyjnego. Fosforylacja komórkowa LRRK2 została szeroko scharakteryzowana, a mapowanie fosfozytów wykazało, że większość miejsc fosforylacji komórkowej występuje w klastrze między powtórzeniami ankyryny i domenami powtórzeń bogatych w leucynę9-11. Chociaż miejsca fosforylacji komórkowej LRRK1 nie zostały jeszcze zmapowane, dowody z badań wykorzystujących barwienie fosfoproteinami blotów immunoprecypitowanego białka LRRK1 z komórek COS7 sugerują, że białko LRRK1 jest fosforylowane w komórkach12.
Ten artykuł zawiera podstawowy protokół do oznaczania ogólnego poziomu fosforylacji LRRK1 i LRRK2 w liniach komórkowych za pomocą znakowania metabolicznego za pomocą 32P-ortofosforanu. Ogólna strategia jest prosta. Białka LRRK znakowane powinowactwem ulegają ekspresji w HEK293T komórkach, które są wystawione na działanie pożywki zawierającej 32P-ortofosforany. 32P-ortofosforan jest asymilowany przez komórki już po kilku godzinach inkubacji, a wszystkie cząsteczki w komórce zawierające fosforany są w ten sposób znakowane radioaktywnie. Znacznik powinowactwa (3xflag) jest następnie używany do izolowania białek LRRK od innych składników komórkowych za pomocą immunoprecypitacji. Immunoprecytaty są następnie rozdzielane za pomocą SDS-PAGE, osuszane do membran PVDF, a analiza włączonych fosforanów jest przeprowadzana za pomocą autoradiografii (sygnał 32P) i zachodniej detekcji (sygnał białkowy) białek na plamach.

<table><tbody><tr><td>Radionuklid fosforu-32, 1 mCi, bufor fosforanu disodu w 1 ml wody</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Zmodyfikowane podłoże Eagle (D-MEM) (1X), płynne (o wysokiej zawartości glukozy)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>To podłoże nie zawiera fosforanów</td></tr><tr><td>Żel powinowactwa Anti Flag M2</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Aby uzyskać równoważny produkt z żelem w kolorze czerwonym (przydatny do łatwiejszej wizualizacji koralików), użyj cat. Nr F2426.</td></tr><tr><td>Ekstra gruby filtr bibułkowy</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S roztwór</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są paralogami, które mają podobną organizację domenową, w tym domenę kinazy serynowo-treoninowej Ras (ROC), C-koniec domeny ROC (COR) oraz bogate w leucynę i ankyrynowe powtórzenia na N-końcu. Dokładne role komórkowe LRRK1 i LRRK2 nie zostały jeszcze wyjaśnione, jednak LRRK1 jest zaangażowany w sygnalizację receptora kinazy tyrozynowej1,2, podczas gdy LRRK2 jest zaangażowany w patogenezę choroby Parkinsona3,4. W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół znakowania białek LRRK1 i LRRK2 w komórkach ortofosforanem 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób pomiar ogólnych poziomów fosforylacji tych 2 białek w komórkach. Krótko mówiąc, białka LRRK znakowane powinowactwem ulegają ekspresji w HEK293T komórkach, które są wystawione na działanie pożywki zawierającej 32P-ortofosforany. 32P-ortofosforan jest asymilowany przez komórki już po kilku godzinach inkubacji, a wszystkie cząsteczki w komórce zawierające fosforany są w ten sposób znakowane radioaktywnie. Za pomocą znacznika powinowactwa (3xflag) białka LRRK są izolowane od innych składników komórkowych przez immunoprecypitację. Immunoprecytaty są następnie rozdzielane za pomocą SDS-PAGE, osuszane do membran PVDF, a analiza włączonych fosforanów jest przeprowadzana za pomocą autoradiografii (sygnał 32P) i zachodniej detekcji (sygnał białkowy) białek na plamach. Protokół można łatwo dostosować do monitorowania fosforylacji dowolnego innego białka, które może ulegać ekspresji w komórkach i izolować przez immunoprecypitację.

Aby porównać ogólne poziomy fosforylacji LRRK1 i LRRK2 w komórkach, 3xflag oznaczone jako LRRK1 i LRRK2 zostały wyrażone w HEK293T komórkach15. Komórki hodowano na płytkach 6-dołkowych i znakowano 32P i analizowano zgodnie z powyższym opisem w tekście protokołu. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki znakowania metabolicznego LRRK1 i LRRK2 w komórkach HEK293T. Włączenie radioaktywnych fosforanów obserwuje się zarówno dla LRRK1, jak i LRRK2. Po ilościowym określeniu poziomów <s...

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest znakowanie interesujących białek radioaktywnymi fosforanami w celu ilościowego określenia białek, poziomów fosforylacji komórkowej. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek w obecności fosforu 32 w celu radioaktywnego znakowania modyfikacji fosforanów białek ulegających ekspresji w komórkach. W drugim etapie znakowane komórki są poddawane lizie, a lizaty są inkubowane z kulkami powinowactwa w celu oczyszczenia immunologicznego białek, które mają być analizowane.Następnie próbki znakowanych i oczyszczonych białek są poddawane elektroforezie w żelu sodowym i odsalowym siarczanowi poliakrylamidowym, a następnie osuszane do membran z fluorku poliolainy. W celu wykrycia inkorporacji radioaktywnych fosforanów i poziomów białek uzyskuje się wyniki, które pokazują, że bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe jeden i dwa, w skrócie L rrk jeden i L rrk 2 są fosforylowane w komórkach do porównywalnych poziomów w oparciu o autoradiografię i detekcję immunologiczną. Główną zaletą techniki znakowania metabolicznego w porównaniu z innymi technikami, takimi jak fosfo, immunoblotting, jest to, że technika ta pozwala na określenie całkowitego poziomu fosforylacji

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metaboliczne nakrapiananie kinaz z powtórzeniami bogatą w leucynę 1 i 2 za pomocą radioaktywnego fosforanu

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Poznaj metodę znakowania metabolicznego kinaz LRRK1 i LRRK2 radioaktywnym fosforem-32 w komórkach HEK293T. Technika umożliwia ilościowe określenie całkowitego poziomu fosforylacji białek.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Przeglądaj więcej filmów