Name: Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodkach Danio rerio przy użyciu fotokonwersji białka kaede i poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie rozwoju struktur twarzoczaszki w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Robertowi Kelshowi za uprzejme podzielenie się odczynnikiem promotora sox10 dla danio pręgowanego.

1. Pobieranie zarodków do fotokonwersji
<ol>
	<li>Ustaw co najmniej dziesięć par transgenicznych danio pręgowanego sox10: kaede między 17 a 18 wieczorem.</li>
	<li>Następnego ranka wyciągnij przegrody i zbierz jajka około południa. Przenieść je na szalki Petriego i umieścić w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Około 24 godziny po zapłodnieniu oczyść szalki Petriego, usuwając martwe zarodki. Sprawdź stadium rozwojowe zarodków 13 za pomocą mikroskopii w polu świetlnym i dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP). Kaede będzie widoczna przez ten filtr.</li>
	<li>Gdy zarodki osiągną 60 hpf, przenieś pięć jaskrawo fluorescencyjnych zarodków na oddzielną szalkę Petriego i w razie potrzeby dokonaj ich dekorionacji.</li>
</ol>
2. Montaż zarodka do fotokonwersji
<ol>
	<li>Zamontuj zarodek za pomocą zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego. Montaż zarodków pod mikroskopem konfokalnym jest niezwykle trudny.</li>
	<li>Użyj standardowej wody E3 lub przygotuj świeżą wodę E3, korzystając z następującego przepisu: 
	Dodaj następujące składniki na jeden litr wody destylowanej dH2O, dodaj następujące elementy, aby uzyskać 1x E3L: 
	0,292 g 5,0 mM NaCl 
	0,013 g 0,17 mM KCl 
	0,044 g 0,33 mM CaCl2 (środek osuszający, 96%, odczynnik ACS) 
	0,081 g .33mM MgSO4 (bezwodniony) 
	Opcjonalnie: dodać 200 μl 0,05% błękitu metylenowego do 1X E3 jako fungicydu i wymieszać. 
	Pożywka utrzymuje się w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień.</li>
	<li>Użyj standardowej tricainy lub przygotuj tricainę, korzystając z następującego przepisu: 
	Na 5 L 0,2% tricainy wymieszaj następujące składniki: 
	45 ml tris-Cl (1M pH 9,5) 
	5 L H2O 
	10 g trykainy</li>
	<li>Przygotować "sok filmowy" (50 ml E3, 0,015% roztwór tricainy), dodając 3,75 ml 0,2% trikainy do 46,25 ml E3.</li>
	<li>Przygotować agarozę, mieszając 46,25 ml wody E3 z 46,35 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w szklanej kolbie o pojemności 50 ml i rozpuścić cząstki stałe w kuchence mikrofalowej. Następnie dodać 3,73 ml 0,2% trikainy do agarozy i umieścić szklaną kolbę z agarozą w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i montaż zarodka
<ol>
	<li>Znieczulić zarodki roztworem trykainy E3/0,015% wykonanym w kroku 1.1.2 i przenieść zarodek do szkiełka komórkowego.</li>
	<li>Nadmiar E3 nasącz chusteczką papierową i połóż agarozę na zarodku.</li>
	<li>Ustaw zarodek idealnie grzbietowo za pomocą końcówek mikroładowacza. Upewnij się, że cały zarodek nie unosi się na agarozie, ale popycha całe ciało w dół. Następnie wlej E3/0,015% roztwór tricainy na zatopiony w agarozie zarodek, aż komora zostanie całkowicie wypełniona płynem.</li>
</ol>
4. Dostosowywanie ustawień oprogramowania w mikroskopie konfokalnym
<ol>
	<li>Użyj obiektywu zanurzonego w powietrzu 20X (apertura numeryczna 0,75; rozmiar otworu 20) do ustawiania ostrości zarodka. Następnie naciśnij przycisk światła L100 na mikroskopie i wybierz kanały w oprogramowaniu. Otwórz widok ikon/kontrolki akwizycji/Ustawienia A1 i kliknij przycisk konfiguracji konfokalnej. Następnie kliknij 'auto' i wybierz następujące kanały przed ponownym zamknięciem okna: 
	Ch1: Kanał DAPI - 403,4 nm (można stosować długości fal od 350 do 410 nm) 
	Kanał 2: 488,0 nm 
	Kanał 3: 561,9 nm</li>
</ol>
5. Konwersja zdjęć
<ol>
	<li>Wyłącz Ch1 i 3 oraz włącz Ch2 przed kliknięciem przycisku usuwania blokady i skanowaniem.</li>
	<li>Skoncentruj się na interesujących komórkach do fotokonwersji, co najlepiej zrobić, zaczynając od 1 klatki / s i wysokiego napięcia (HV) 200, a następnie zwiększając liczbę klatek / s i odpowiednio obniżając HV, aż osiągniesz 1/32 klatki / s i HV około 100-120, w zależności od szumu tła.</li>
	<li>Gdy zarodek jest ostry, spójrz na prawą krawędź ekranu, chwyć zieloną obwódkę i zmniejsz ją, aby pasowała do obszaru zainteresowania do fotokonwersji i kliknij prawym przyciskiem myszy. Im mniej, tym lepiej, ponieważ fotokonwersja jest nieodwracalna.</li>
	<li>Ustaw klatki/s na 1 i HV na 200 i naciśnij skanowanie. Powiększony obraz obszaru fotokonwersji jest teraz widoczny.</li>
	<li>Fotokonwertuj komórki, włączając Ch1 (403,4 nm). Wystaw na działanie lasera fotokonwertującego od 5 do 60 sekund, w zależności od wielkości obszaru, aż zielona kaede widziana przez kanał GFP będzie prawie nieobecna.</li>
	<li>Gdy zielony sygnał kaede jest prawie nieobecny, wyłącz Ch1. Włącz Ch2 i 3. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie w polu obszaru skanowania A1 i naciśnij "przywróć do oryginalnego rozmiaru", aby sprawdzić, czy żądane komórki zostały fotokonwertowane.</li>
</ol>
6. Tworzenie stosu Z
<ol>
	<li>Znajdź ikonę "przechwytywanie serii Z" na pasku menu i ustaw górne i dolne limity stosu Z przed jego rozpoczęciem. Ustaw LUT.</li>
</ol>
7. Oprogramowanie- Ustawienia Time-lapse
<ol>
	<li>Przejdź do pola A1Simple GUI i zaznacz następujące ustawienia: 
	1/32 klatki/sek 
	Rozmiar 1024 
	średnio 4 lub 8X w zależności od liczby stosów Z, które należy wykonać w jednej pętli</li>
	<li>Przejdź do: view/ akwizycja akwizycji/ akwizycja sekwencji ND i ustaw ramy czasowe (8-30min), kliknij ciągły i kliknij Z-stack. Ustaw obramowania zgodnie z wcześniejszymi testami i rozpocznij film.</li>
	<li>Dodawaj E3/0,015% roztwór roztworu trikainy przez cały dzień. W nocy całkowicie napełnij komorę. To potrwa do następnego ranka.</li>
	<li>Następnego ranka uzupełnij roztwór E3/0,015% tricainy i sprawdź, czy zarodek nadal żyje. Utrata fluorescencji oznacza śmierć. Kontynuuj uzupełnianie i kontrole przez cały dzień.</li>
	<li>Kiedy struktura zakończy formowanie się lub zarodek umrze, dokończ film.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie postprodukcyjne
<ol>
	<li>Kliknij "pokaż projekcję maksymalnej intensywności" na pasku narzędzi, a następnie kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i utwórz nowy dokument. Wideo jest teraz widoczne w najlepszej możliwej jakości. Przejdź do usuwania ramek, które nie są potrzebne, i dostosuj LUT. Na koniec zapisz jako .avi. Ten format będzie odpowiedni dla systemu Windows. W przypadku komputerów Mac pobierz oprogramowanie, aby przekonwertować na .mov lub .wmv.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate%3A+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+%28IPDTOC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac.+J%22%5BJournal%5D)">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li>
<li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li>
<li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li>
<li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li>
<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10%3A+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li>
<li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+genes%2C+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li>
<li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li>
<li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li>
<li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li>
<li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li>
<li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li>
<li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you%2Fscube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym artykule przedstawiono nową metodę wizualizacji rozwoju twarzoczaszki w modelu danio pręgowanego. Linia transgenicznego danio pręgowanego sox10: kaede została z powodzeniem wykorzystana do szczegółowego opisania wzorca migracji CNCC i jest wykorzystywana jako organizm modelowy 5.
W poprzednich badaniach wykorzystano ogólne punkty orientacyjne, takie jak oko do komórek docelowych, i opierały się na wstrzyknięciu mRNA kaede, testach fotokonwersji lub dekstranie fluoresceinowym w...

Rozszczepy twarzoczaszki reprezentują najbardziej rozpowszechnioną deformację twarzoczaszki, z 1/700-1,000 dotkniętymi porodami 1. Zaburzenie wczesnego rozwoju embriologicznego twarzoczaszki może prowadzić do powstania rozszczepu wargi i podniebienia (CL/P). Podczas gdy przyczyny rozszczepu syndromicznego zostały w dużej mierze pokazane, genetyczne i epigenetyczne podstawy niesyndromicznych form rozszczepu ustno-twarzowego nadal muszą zostać odkryte 2-4. Aby zrozumieć etiologię i patogenezę tych wad rozwojowych, konieczne jest wyjaśnienie rozwoju struktur twarzoczaszki na bazie komórkowej.
U wszystkich gatunków kręgowców komórki grzebienia nerwowego czaszki (CNCC) migrują z grzbietowej cewy nerwowej, aby wypełnić łuki gardłowe, co przyczyni się do tworzenia struktur ustno-twarzowych. Zaburzenie wczesnego rozwoju zarodkowego grzebienia nerwowego może prowadzić do powstawania wad rozwojowych twarzoczaszki, w tym CL/P 5-7.
Oprócz strukturalnych podobieństw między danio pręgowanym a rozwojem twarzoczaszki u ssaków (CNCC znajdują się w regionach homologicznych), sieć regulacji genów jest wysoce konserwatywna. Wykazano również, że CNCC rozwijają się w ten sam sposób u gatunków owodniowców i danio pręgowanego 8, co czyni danio pręgowanego potężnym organizmem do badania rozwojowych i genetycznych podstaw CL/P. Ma wiele zalet, w tym niewielkie rozmiary, szybki rozwój embrionalny i ex-utero oraz wysokie wskaźniki rozmnażania. Ponadto zarodek jest optycznie przezroczysty, dzięki czemu jest podatny na obserwację złożonych zdarzeń rozwojowych pod mikroskopem 9. Jest to idealny model zwierzęcy do badania migracji i różnicowania komórek grzebienia nerwowego czaszki.
Rozszerzając poprzednio opublikowane prace 8, 10, 11, wzorzec migracji CNCC został szczegółowo opisany za pomocą sox10: transgeniczny model kaede 5. Kaede jest białkiem fotokonwertowalnym, które zmienia kolor z zielonego na czerwony po aktywacji zdjęcia i umożliwia precyzyjne śledzenie CNCC. Podczas tej przemiany szkielet peptydowy jest rozszczepiany, co sugeruje, że konwersja jest stabilna, co oznacza, że komórki można śledzić do ich ostatecznego miejsca przeznaczenia 12. Linie transgeniczne znakowane kaede pod kontrolą transkrypcyjną sox10 wykazały, że podniebienie owodniowe i płytka sitowa danio pręgowanego są tworzone homologicznie przez fuzję obustronnych protuberancji szczęki (MXP) z protuberancją czołowo-nosową (FNP) i że szew fuzyjny w kształcie litery Y jest analogiczny między gatunkami.
Wśród innych zastosowań, model transgenicznego danio pręgowanego sox10: kaede został wykorzystany do generowania filmów z zarodkami danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju, aby pokazać tworzenie się normalnych i nieprawidłowych struktur twarzoczaszki. Fotokonwersja określonych grup komórek umożliwia śledzenie ich rozwoju. Dzięki tej metodzie wprowadzono podejście polegające na tworzeniu obrazowania na żywo rozwijających się struktur twarzoczaszki u danio pręgowanego, co ułatwia wizualne zademonstrowanie tego złożonego procesu rozwojowego.
Ten protokół ma na celu dzielenie się doświadczeniem w generowaniu tych filmów przy użyciu normalnego rozwoju płytki sitowej w sox10: na przykład transgeniczny danio pręgowany kaede. Protokół ten można następnie zastosować do tworzenia filmów poklatkowych dowolnej struktury pochodzącej z komórek grzebienia nerwowego czaszki u danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede </td><td>MGH</td><td></td><td>Dostępna w laboratorium Liao</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100x15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 35 mmx10 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure o niskiej temperaturze topnienia (LMP) Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>15517022</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem </td><td>LabTek</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Mikroładowarki 200/pk</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td><td>Nikon</td><td>Brak numeru katalogowego</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td><td>Nikon</td><td>Brak numeru katalogowego</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Paletogeneza kręgowców to wysoce choreograficzny i złożony proces rozwojowy, który obejmuje migrację komórek grzebienia nerwowego czaszki (CNC), konwergencję i rozszerzenie wypukłości twarzy oraz dojrzewanie szkieletu twarzoczaszki. Aby zbadać wpływ grzebienia nerwowego czaszki w określone regiony podniebienia danio pręgowanego, stworzono linię transgenicznego danio pręgowanego sox10: kaede. Sox10 zapewnia ograniczenie linii białka reporterowego kaede do grzebienia nerwowego, dzięki czemu znakowanie komórek jest bardziej precyzyjnym procesem niż tradycyjne wstrzyknięcie barwnika lub reporterowego mRNA. Kaede jest białkiem fotokonwertowalnym, które zmienia kolor z zielonego na czerwony po fotoaktywacji i umożliwia precyzyjne śledzenie komórek. Linia transgeniczna sox10: kaede została wykorzystana do przeprowadzenia analizy linii w celu wyznaczenia populacji komórek CNC, które dają początek elementom szczęki i żuchwy oraz zilustrowania homologii protuberancji twarzy do owodniowców. Ten protokół opisuje kroki, które należy wykonać, aby wygenerować film poklatkowy na żywo zarodka zebry sox10: kaede. Rozwój płytki sitowej posłuży jako praktyczny przykład. Protokół ten można zastosować do wykonania poklatkowego zapisu konfokalnego dowolnego kaede lub podobnego fotokonwertowalnego białka reporterowego u transgenicznego danio pręgowanego. Co więcej, może być używany do uchwycenia nie tylko normalnego, ale także nieprawidłowego rozwoju struktur twarzoczaszki u mutantów danio pręgowanego.

W linii transgenicznej sox10: kaede, migrujące i pomigracyjne CNCC są znakowane fluorescencyjną zielenią. Komórki CNCC znakowane zieloną fluorescencyjną białkiem kaede odzwierciedlają endogenną ekspresję mRNA sox10 5.
Wśród innych zastosowań, model zwierzęcy ten został wykorzystany do lepszej wizualizacji rozwoju struktur kraniofacialnych zależnych od CNCC. Utrakowano prawidłowy rozwój specyficznych struktur, a także patologiczny rozwój malformacji kraniofacialnych, w szczególności ...

Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie obrazu poklatkowego na żywo z migracji komórek grzebienia neuronalnego, aby wykazać formowanie się rozwijających się struktur czaszkowo-twarzowych. Osiąga się to poprzez zamocowanie znieczulonego transgenicznego danio pręgowanego SOX 10 KD w agarozie w celu zminimalizowania ruchów podczas całego eksperymentu. Następnie, pod mikroskopem konfokalnym, przeprowadza się fotoaktywację UV, aby przekształcić KD z koloru zielonego na czerwony w komórkach grzebienia neuronalnego.Następnie skupiono się na przekształconych w fotokomórki komórkach grzebienia neuronalnego. Przed nagraniem filmu poklatkowego wykonano obraz Z-stack rozwijającej się struktury. Uzyskano wyniki wykazujące rozwój czaszkowych komórek grzebienia neuronalnego w pierwotne podniebienie danio pręgowanego w embrionie transgenicznego danio pręgowanego z knockdownem SOX 10.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie statyczne, jest możliwość wizualizacji w czasie rzeczywistym złożonych procesów rozwojowych, np. migracji komórek. Dzięki temu wyniki są bardziej przystępne dla środowiska naukowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak sposób formowania się struktur pochodzących z komórek grzebienia neuronalnego oraz wpływ genów PTO na ich rozwój.Aby przygotować embriony do montażu, należy użyć kolby o pojemności 125 ml do zmieszania wody E3 z niskotopliwym agarosem i rozpuścić roztwór w kuchence mikrofalowej. Następnie należy dodać TRICA i umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 50°C w celu utrzymania ciepła, a następnie wyłowić silnie fluorescencyjne transgeniczne embriony zebrafish soine KD w 60 godzinach po zapłodnieniu. Następnie należy przenieść każdy z nich za pomocą papieru tkankowego na szkiełko komorowe.Odssać nadmiar roztworu E3, a następnie przykryć embrion roztworem agarro. Za pomocą końcówki mikro-loadera ustawić embrion idealnie grzbietowo, upewniając się, że jest on całkowicie zanurzony w agarro. Po zastygnięciu agarro wypełnić szkiełko komorowe roztworem E3 z 0,015% tricainy, aby przeprowadzić fotokonwersję.Rozpocznij od użycia obiektywu z immersją powietrzną 20 x w celu ustawienia ostrości na embrion. Następnie naciśnij przycisk światła L 100 na mikroskopie i wybierz kanały w oprogramowaniu. Otwórz ikony.Przejdź do ustawień elementów sterujących akwizycją A one i kliknij przycisk konfiguracji konfokalnej. Następnie kliknij auto i wybierz DPI 4 88 oraz 561.9 dla kanałów 1, 2, 3 odpowiednio, a następnie ponownie zamknij okno. Następnie wyłącz kanały pierwszy i trzeci, po czym kliknij przycisk usuwania blokady i naciśnij przycisk skanowania, zaczynając od jednej klatki na sekundę i HV 200.Należy rozpocząć ustawianie ostrości na interesujących nas komórkach. Stopniowo zwiększaj liczbę klatek na sekundę do jednej na 32 oraz zmniejszaj napięcie do 100–120, w zależności od poziomu szumu w tle. Gdy embrion będzie ostry, chwyć zieloną obwódkę przy prawej krawędzi ekranu i zmniejsz ją tak, aby dopasowała do obszaru przeznaczonego do fotokonwersji, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy.Zmień liczbę klatek na sekundę na jedną, a wysokie napięcie (HV) na 200 i naciśnij przycisk skanowania. Teraz widoczny będzie powiększony obraz obszaru konwersji zdjęć. Następne zdjęcie.Przeprowadź konwersję komórek, włączając kanał pierwszy na okres od pięciu do 60 sekund, aż sygnał KD w kolorze zielonym niemal całkowicie zaniknie. Następnie wyłącz kanał dappy. Włącz kanały drugi i trzeci, aby powrócić do pierwotnego powiększenia.Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie powiększenia i wybierz opcję powrotu do oryginalnego rozmiaru, aby sprawdzić, czy wybrane komórki zostały odpowiednio przekonwertowane na zdjęcia. Ustaw zakresy osi Z, wybierając ikonę Capture Z Series na pasku menu. Dostosuj tabele wyszukiwania (LUT), aby skonfigurować sekwencję time-lapse.Wybierz prosty okno GUI „A” i zaznacz następujące ustawienia. Jeden na 32 klatki na sekundę. Rozmiar 1024 oraz średnia z czterech lub ośmiu x, w zależności od liczby stosów Z, które muszą zostać wykonane w jednej pętli.Następnie przejdź do sterowania akwizycją obrazu w sekwencji ND, aby ustawić ramę czasową. Kliknij opcję continuous, a następnie Zack. Ustaw granice zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Uruchom film, dodaj do komory roztwór E three 0.015%trica, przesuń go w ciągu dnia i całkowicie wypełnij komorę przed obrazowaniem nocnym. Po zakończeniu obrazowania utwórz wysokiej jakości wideo z pliku obrazowania, klikając opcję pokaż maksymalną projekcję intensywności. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i utwórz nowy dokument.Usuń zbędne klatki i dostosuj LUT. W tym filmie prezentującym palatogenezę u danio pręgowanego wykorzystano linię transgeniczną SOX 10 K, aby śledzić komórki grzebienia neuronalnego czaszki podczas ich rozwoju w podniebienie pierwotne. Najbardziej przednie komórki formującego się podniebienia zostają poddane fotokonwersji z koloru zielonego na czerwony w 60 godzinach po zapłodnieniu.Gdy sparowane beleczki kostne łączą się, tworząc podniebienie pierwotne, komórki te są następnie śledzone aż do momentu dotarcia do miejsca docelowego. Ten film przedstawia zaburzony rozwój podniebienia prowadzący do powstania rozszczepu w obrębie twarzy i jamy ustnej, wywołany knockdownem genu speck za pomocą morino. Jako przykład wykorzystano gen lb, zaangażowany w powstawanie skośnych rozszczepów twarzy.W 60. godzinie po zapłodnieniu (HPF) jednostronna fotokonwersja najbardziej przednich komórek płyt sitowych wykazuje brak zlania się komórek przyśrodkowej i bocznej płyty sitowej. Wada ta przypomina patogenezę powstawania skośnych rozszczepów twarzy u ludzi, gdzie dochodzi do braku zlania się bocznego wyrostka nosowego i wyrostka szczękowego. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii rozwoju do eksploracji rozwoju komórek grzebienia neuronalnego u danio pręgowanego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać tę metodę do utrwalenia interesującego Państwa procesu rozwojowego.

visualization-craniofacial-development-sox10-kaede-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizowanie rozwoju czaszkowo-twarzowego w linii transgennych Danio pręgowanych sox10: kaede za pomocą mikroskopii konfokalnej time-lapse

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Poznaj metodę wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodkach Danio rerio przy użyciu fotokonwersji białka kaede i poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie rozwoju struktur twarzoczaszki w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów