Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej
September 30th, 2013
Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie poklatkowego zapisu na żywo migracji komórek grzebienia nerwowego w celu pokazania powstawania rozwijających się struktur czaszki twarzy. Osiąga się to poprzez uprzednie zamontowanie znieczulonego transgenicznego zebrywanego SOX 10 KD w agarozie w celu zminimalizowania ruchu podczas całego eksperymentu. Następnie pod mikroskopem konfokalnym przeprowadzana jest aktywacja foto UV w celu przekształcenia KD z zielonego na czerwony w komórkach grzebienia nerwowego.
Następnie skupienie się na zdjęciu przekształciło komórki grzebienia nerwowego. Z rozwijającej się struktury generowany jest Zack, zanim zostanie nagrany film poklatkowy. Uzyskano wyniki, które wskazują na rozwój komórek grzebienia nerwowego czaszki w podniebieniu pierwotnym danio pręgowanego w transgenicznym zarodku zebry zebry SOX 10 KD.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie statyczne, jest to, że złożone procesy rozwojowe, takie jak migracja komórek, można wizualizować w czasie rzeczywistym. Dzięki temu wyniki są bardziej dostępne dla społeczności naukowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób powstają struktury pochodzące z komórek grzebienia nerwowego i jak geny PTO wpływają na ich rozwój.
Aby przygotować się do montażu zarodków, użyj kolby o pojemności 125 mililitrów, aby wymieszać E trzy wody z kuchenką mikrofalową aeros o niskiej temperaturze topnienia, aby rozpuścić roztwór. Następnie dodaj trica i umieść kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza, aby się rozgrzała i zagnieźdź zawiązki jasnofluorescencyjne transgeniczne zarodki zebry soine KD po 60 godzinach od zapłodnienia. Następnie przenieś je na szkiełko komorowe z bibułą.
Wchłonąć nadmiar wody E 3, a następnie użyć roztworu agarro, aby przykryć zarodek. Użyj końcówki mikroładowarki, aby ustawić zarodek idealnie grzbietowo, upewniając się, że zarodki są całkowicie zanurzone w agarro. Po zestawach agarro użyj E trzy 0,015% trica, aby wypełnić szkiełko komory, aby przeprowadzić konwersję zdjęć.
Zacznij od użycia obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w powietrzu, aby skupić się na zarodku. Następnie naciśnij przycisk światła L 100 na mikroskopie i wybierz kanały w oprogramowaniu. Otwórz ikony.
Wyświetl elementy sterujące akwizycją Jedno ustawienie i kliknij przycisk konfiguracji konfokalnej. Następnie kliknij auto i wybierz DPI 4 88 i 561.9 odpowiednio dla kanałów 1, 2, 3 przed ponownym zamknięciem okna. Następnie wyłącz kanały pierwszy i trzeci przed kliknięciem przycisku usuwania blokady i naciśnięciem przycisku skanowania, zaczynając od jednej klatki na sekundę i HV 200.
Zacznij skupiać się na interesujących Cię komórkach. Stopniowe zwiększanie liczby klatek na sekundę do jednej na 32 i zmniejszanie napięcia do 100 do 120 w zależności od szumu tła. Gdy zarodek jest ostry, chwyć zieloną obwódkę przy prawej krawędzi ekranu i zmniejsz ją, aby dopasować się do obszaru, który ma zostać przekształcony, zanim klikniesz prawym przyciskiem myszy.
Zmień klatki na sekundę na jedną, a HV na 200 i naciśnij skanuj. Powiększony obraz obszaru konwersji zdjęcia będzie teraz widoczny. Następne zdjęcie.
Konwertuj komórki, włączając kanał pierwszy na dowolny czas od pięciu do 60 sekund, aż zielony sygnał KD będzie prawie nieobecny. Następnie wyłącz kanał dappy. Włącz kanały drugi i trzeci, aby powrócić do oryginalnego powiększenia.
Kliknij prawym przyciskiem myszy okno powiększenia i wybierz powrót do oryginalnego rozmiaru, aby sprawdzić, czy żądane komórki zostały odpowiednio przekonwertowane na zdjęcia. Ustaw limity Zacka, wybierając ikonę Capture Z Series na pasku menu. Dostosuj tabele odnośników lub uts, aby skonfigurować upływ czasu.
Wybierz pole A one simple GUI i zaznacz następujące ustawienia. Jedna na 32 klatki na sekundę. Rozmiar 1024 i średnio cztery lub osiem x w zależności od liczby stosów Z, które muszą być pobrane w jednej pętli.
Następnie przejdź do view akwizycja kontroluje akwizycję sekwencji ND i ustaw ramy czasowe. Następnie kliknij ciągłe, a następnie Zack. Ustaw granice, jak pokazano wcześniej.
Rozpocznij film, dodaj E trzy 0,015% roztworu trików do komory, przesuwaj przez cały dzień i całkowicie wypełnij komorę do obrazowania w nocy. Po zakończeniu obrazowania utwórz wysokiej jakości wideo z pliku obrazu, klikając opcję pokaż projekcję maksymalnej intensywności. Następnie kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i utwórz nowy dokument.
Usuń niepotrzebne klatki i dostosuj pliki. W tym filmie pokazującym Palato Genesis u danio pręgowanego, transgeniczna linia SOX 10 K jest używana do śledzenia komórek grzebienia nerwowego czaszki, gdy rozwijają się, tworząc podniebienie pierwotne. Najbardziej przednie komórki tworzącego się podniebienia są przekształcane ze zdjęcia z zielonego na czerwony po 60 godzinach od zapłodnienia.
Kiedy sparowane bełeczki spotkają się, tworząc podniebienie pierwotne, komórki te są następnie śledzone, aż dotrą do miejsca docelowego. Ten film pokazuje zaburzony rozwój podniebienia prowadzący do powstania szczeliny ustno-twarzowej, za pośrednictwem morino powalenia plamki. Jako przykład podaje się gen o wadze jednego funta zaangażowany w skośne rozszczepienie twarzy.
Przy 60 HPF jednostronna fotokonwersja najbardziej przednich komórek płytki sitowej wykazuje niepowodzenie wysięku między środkowymi i bocznymi komórkami płytki sitowej. Wada ta przypomina patogenezę rozwoju skośnego rozszczepu twarzoczaszki u ludzi, w którym dochodzi do niewydolności wysięku między bocznym wyrostkiem nosowym a wypukłością szczęki. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową do zbadania rozwoju komórek grzebienia nerwowego u danio pręgowanego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tej metody, aby uchwycić interesujący Cię proces rozwojowy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wizualizowania migracji komórek grzbietowych nerwowych w zarodkach danio pręgowanego poprzez nagrywanie czasu rzeczywistego w sekwencji. Dzięki wykorzystaniu fotokonwersji białka kaede, naukowcy mogą lepiej zrozumieć rozwój struktur twarzoczaszki.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwoju
- Embriologia
Tło
- Wizualizacja danych eksperymentalnych jest kluczowa dla komunikacji naukowej.
- Nagrania sekwencyjne zwiększają zrozumienie złożonych procesów rozwojowych.
- Transgeniczne modele danio pręgowanego są cenne dla badania dynamiki komórek grzbietowych nerwowych.
- Techniki fotokonwersji pozwalają na precyzyjne śledzenie zmian komórkowych.
Cel badania
- Wygenerowanie nagrań czasu rzeczywistego w sekwencji migracji komórek grzbietowych nerwowych.
- Ilustracja formowania struktur twarzoczaszki u danio pręgowanego.
- Wykorzystanie fotokonwersji dla ulepszonej wizualzacji procesów komórkowych.
Stosowane metody
- Umieszczenie znieczulonych transgenicznych danio pręgowanego SOX 10 KD w agarozi.
- Przeprowadzenie aktywacji foto UV w celu przekonwertowania białka kaede z zielonego na czerwone.
- Skupienie się na fotokonwertowanych komórkach grzbietowych nerwowych pod mikroskopem konfokalnym.
- Nagrywanie filmów sekwencyjnych w celu uchwycenia rozwoju struktur twarzoczaszki.
Główne wyniki
- Sukces w wizualizowanie migracji komórek grzbietowych nerwowych u danio pręgowanego.
- Demonstracja komórek grzbietowych nerwowych twarzoczaszki rozwijających się w pierwotne podniebienie.
- Generowanie filmu sekwencyjnego przedstawiającego dynamikę komórkową.
- Wgląd w rolę SOX 10 w rozwoju twarzoczaszki.
Wnioski
- Protokół skutecznie demonstruje zachowanie komórek grzbietowych nerwowych in vivo.
- Fotokonwersja jest potężnym narzędziem do badania procesów rozwojowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia rozwoju twarzoczaszki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracing cranial neural crest contributions to maxillary and mandibular elements.
- Operational Value: Enables precise lineage restriction via photoconvertible kaede reporter, reducing labeling ambiguity compared to dye injection.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of craniofacial mutants to assess target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spatiotemporal data on cell migration and tissue convergence for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible time-lapse outputs compatible with high-content imaging pipelines.
- Scalability: Adaptable to any kaede or photoconvertible reporter in transgenic zebrafish for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Illustrates homology of zebrafish facial prominences to amniotes, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Captures both normal and abnormal craniofacial development in mutants for phenotypic validation.
- Risk Mitigation: Enables observation of effusion defects modeling human orofacial cleft pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in cranial neural crest migration and palate formation.
- Screening: Delivers quantitative confocal readouts for assessing compound effects on cell dynamics.
- Analytics: Enables measurement of migration velocity, convergence timing, and tissue boundary formation.
- Translational Research: Connects zebrafish palate development to human craniofacial homologs for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for developmental phenotype assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of cell fate decisions.
- Operational Value: Standardizes photoactivation and time-lapse protocols for reproducible neural crest tracking.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to observable craniofacial phenotypes.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on developmental phenotype severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, confocal microscopy, and photoconvertible protein handling.
- Dependent on UV-capable confocal systems and agarose embedding infrastructure for embryo immobilization.
- Necessitates standardization of photoactivation duration and z-stack acquisition across users.
- Adaptation considerations include varying promoter-driven reporters and developmental staging across zebrafish strains.
- Practical limitations include phototoxicity from prolonged UV exposure and embryo viability during extended imaging.
