Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej
30 września 2013
Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie poklatkowego zapisu na żywo migracji komórek grzebienia nerwowego w celu pokazania powstawania rozwijających się struktur czaszki twarzy. Osiąga się to poprzez uprzednie zamontowanie znieczulonego transgenicznego zebrywanego SOX 10 KD w agarozie w celu zminimalizowania ruchu podczas całego eksperymentu. Następnie pod mikroskopem konfokalnym przeprowadzana jest aktywacja foto UV w celu przekształcenia KD z zielonego na czerwony w komórkach grzebienia nerwowego.
Następnie skupienie się na zdjęciu przekształciło komórki grzebienia nerwowego. Z rozwijającej się struktury generowany jest Zack, zanim zostanie nagrany film poklatkowy. Uzyskano wyniki, które wskazują na rozwój komórek grzebienia nerwowego czaszki w podniebieniu pierwotnym danio pręgowanego w transgenicznym zarodku zebry zebry SOX 10 KD.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie statyczne, jest to, że złożone procesy rozwojowe, takie jak migracja komórek, można wizualizować w czasie rzeczywistym. Dzięki temu wyniki są bardziej dostępne dla społeczności naukowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób powstają struktury pochodzące z komórek grzebienia nerwowego i jak geny PTO wpływają na ich rozwój.
Aby przygotować się do montażu zarodków, użyj kolby o pojemności 125 mililitrów, aby wymieszać E trzy wody z kuchenką mikrofalową aeros o niskiej temperaturze topnienia, aby rozpuścić roztwór. Następnie dodaj trica i umieść kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza, aby się rozgrzała i zagnieźdź zawiązki jasnofluorescencyjne transgeniczne zarodki zebry soine KD po 60 godzinach od zapłodnienia. Następnie przenieś je na szkiełko komorowe z bibułą.
Wchłonąć nadmiar wody E 3, a następnie użyć roztworu agarro, aby przykryć zarodek. Użyj końcówki mikroładowarki, aby ustawić zarodek idealnie grzbietowo, upewniając się, że zarodki są całkowicie zanurzone w agarro. Po zestawach agarro użyj E trzy 0,015% trica, aby wypełnić szkiełko komory, aby przeprowadzić konwersję zdjęć.
Zacznij od użycia obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w powietrzu, aby skupić się na zarodku. Następnie naciśnij przycisk światła L 100 na mikroskopie i wybierz kanały w oprogramowaniu. Otwórz ikony.
Wyświetl elementy sterujące akwizycją Jedno ustawienie i kliknij przycisk konfiguracji konfokalnej. Następnie kliknij auto i wybierz DPI 4 88 i 561.9 odpowiednio dla kanałów 1, 2, 3 przed ponownym zamknięciem okna. Następnie wyłącz kanały pierwszy i trzeci przed kliknięciem przycisku usuwania blokady i naciśnięciem przycisku skanowania, zaczynając od jednej klatki na sekundę i HV 200.
Zacznij skupiać się na interesujących Cię komórkach. Stopniowe zwiększanie liczby klatek na sekundę do jednej na 32 i zmniejszanie napięcia do 100 do 120 w zależności od szumu tła. Gdy zarodek jest ostry, chwyć zieloną obwódkę przy prawej krawędzi ekranu i zmniejsz ją, aby dopasować się do obszaru, który ma zostać przekształcony, zanim klikniesz prawym przyciskiem myszy.
Zmień klatki na sekundę na jedną, a HV na 200 i naciśnij skanuj. Powiększony obraz obszaru konwersji zdjęcia będzie teraz widoczny. Następne zdjęcie.
Konwertuj komórki, włączając kanał pierwszy na dowolny czas od pięciu do 60 sekund, aż zielony sygnał KD będzie prawie nieobecny. Następnie wyłącz kanał dappy. Włącz kanały drugi i trzeci, aby powrócić do oryginalnego powiększenia.
Kliknij prawym przyciskiem myszy okno powiększenia i wybierz powrót do oryginalnego rozmiaru, aby sprawdzić, czy żądane komórki zostały odpowiednio przekonwertowane na zdjęcia. Ustaw limity Zacka, wybierając ikonę Capture Z Series na pasku menu. Dostosuj tabele odnośników lub uts, aby skonfigurować upływ czasu.
Wybierz pole A one simple GUI i zaznacz następujące ustawienia. Jedna na 32 klatki na sekundę. Rozmiar 1024 i średnio cztery lub osiem x w zależności od liczby stosów Z, które muszą być pobrane w jednej pętli.
Następnie przejdź do view akwizycja kontroluje akwizycję sekwencji ND i ustaw ramy czasowe. Następnie kliknij ciągłe, a następnie Zack. Ustaw granice, jak pokazano wcześniej.
Rozpocznij film, dodaj E trzy 0,015% roztworu trików do komory, przesuwaj przez cały dzień i całkowicie wypełnij komorę do obrazowania w nocy. Po zakończeniu obrazowania utwórz wysokiej jakości wideo z pliku obrazu, klikając opcję pokaż projekcję maksymalnej intensywności. Następnie kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i utwórz nowy dokument.
Usuń niepotrzebne klatki i dostosuj pliki. W tym filmie pokazującym Palato Genesis u danio pręgowanego, transgeniczna linia SOX 10 K jest używana do śledzenia komórek grzebienia nerwowego czaszki, gdy rozwijają się, tworząc podniebienie pierwotne. Najbardziej przednie komórki tworzącego się podniebienia są przekształcane ze zdjęcia z zielonego na czerwony po 60 godzinach od zapłodnienia.
Kiedy sparowane bełeczki spotkają się, tworząc podniebienie pierwotne, komórki te są następnie śledzone, aż dotrą do miejsca docelowego. Ten film pokazuje zaburzony rozwój podniebienia prowadzący do powstania szczeliny ustno-twarzowej, za pośrednictwem morino powalenia plamki. Jako przykład podaje się gen o wadze jednego funta zaangażowany w skośne rozszczepienie twarzy.
Przy 60 HPF jednostronna fotokonwersja najbardziej przednich komórek płytki sitowej wykazuje niepowodzenie wysięku między środkowymi i bocznymi komórkami płytki sitowej. Wada ta przypomina patogenezę rozwoju skośnego rozszczepu twarzoczaszki u ludzi, w którym dochodzi do niewydolności wysięku między bocznym wyrostkiem nosowym a wypukłością szczęki. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową do zbadania rozwoju komórek grzebienia nerwowego u danio pręgowanego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tej metody, aby uchwycić interesujący Cię proces rozwojowy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji migracji komórek grzebienia neuronalnego w embrionach danio pręgowanego za pomocą rejestracji time-lapse na żywo. Dzięki zastosowaniu fotokonwersji białka kaede badacze mogą lepiej zrozumieć rozwój struktur czaszkowo-twarzowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia rozwoju
- Embriologia
Wstęp
- Wizualizacja danych eksperymentalnych jest kluczowa dla komunikacji naukowej.
- Nagrania time-lapse zwiększają zrozumienie złożonych procesów rozwojowych.
- Transgeniczne modele zebrafish są cenne w badaniu dynamiki komórek grzebienia neuronalnego.
- Techniki fotokonwersji umożliwiają precyzyjne śledzenie zmian komórkowych.
Cel badania
- W celu wykonania nagrań time-lapse na żywo z migracji komórek grzebienia nerwowego.
- W celu zilustrowania formowania się struktur twarzoczaszki u danio pręgowanego.
- W celu wykorzystania fotokonwersji do lepszej wizualizacji procesów komórkowych.
Zastosowane metody
- Mocowanie znieczulonych transgenicznych rybek zebrafish z wyciszonym genem SOX 10 (KD) w agarozie.
- Przeprowadzenie fotoaktywacji UV w celu konwersji białka kaede z koloru zielonego na czerwony.
- Ostrość na fotokonwertowane komórki grzebienia neuralnego pod mikroskopem konfokalnym.
- Nagrywanie filmów time-lapse w celu utrwalenia rozwoju struktur czaszkowych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja migracji komórek grzebienia neuralnego u danio pręgowanego.
- Wykazanie rozwoju komórek czaszkowego grzebienia neuralnego w pierwotne podniebienie.
- Przygotowanie filmu time-lapse przedstawiającego dynamikę komórkową.
- Wgląd w rolę SOX 10 w rozwoju kraniofacjalnym.
Wnioski
- Protokół skutecznie demonstruje zachowanie komórek grzebienia neuronalnego in vivo.
- Fotokonwersja jest potężnym narzędziem do badania procesów rozwojowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia rozwoju kraniofacjalnego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja dynamiki komórek grzebienia neuronalnego czaszki u danio pręgowanego dostarcza modelu predykcyjnego służącego do mechanistycznego ograniczania ryzyka w procesie walidacji celów kraniofacjalnych. Transgeniczny system sox10:kaede umożliwia wysokorozdzielcze śledzenie w czasie zdarzeń migracji i różnicowania, istotnych dla ludzkiej morfogenezy twarzy. Podejście to wspiera wczesną fazę odkryć, łącząc perturbacje genetyczne z efektami fenotypowymi w systemie istotnym dla analizy chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez śledzenie wkładu grzebieni neuronalnych czaszki w elementy szczęki górnej i dolnej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia precyzyjne ograniczenie linii komórkowych dzięki zastosowaniu fotokonwertowalnego reportera kaede, co zmniejsza niejednoznaczność znakowania w porównaniu z wstrzykiwaniem barwników.
- Wartość prognostyczna: Wspiera przesiew fenotypowy mutantów kraniofacialnych w celu oceny stopnia oddziaływania na cel oraz modulacji szlaków sygnałowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane czasowo-przestrzenne dotyczące migracji komórek i konwergencji tkanek w celu standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalne wyniki obrazowania time-lapse, kompatybilne z potokami obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging).
- Skalowalność: Możliwość adaptacji do dowolnego markera kaede lub fotokonwertowalnego reportera w transgenicznych danio przebrzmiałych w celu ponownego wykorzystania platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ilustruje homologię wyniosłości twarzy u danio-pręgowanego względem amnionów, zwiększając znaczenie translacyjne.
- Wartość operacyjna: Pozwala na uchwycenie prawidłowego i nieprawidłowego rozwoju kraniofacjalnego u mutantów w celu walidacji fenotypowej.
- Minimalizacja ryzyka: Umożliwia obserwację wad wylewu modelujących patogenezę ludzkich rozszczepów jamy ustno-twarzowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając obrazowanie na żywo struktur pochodzących z grzebienia neuronalnego przed rozpoczęciem screeningu związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji genów w migracji czaszkowych komórek grzebienia neuralnego i tworzeniu podniebienia.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe wyniki z mikroskopii konfokalnej do oceny wpływu związków na dynamikę komórek.
- Analityka: Umożliwia pomiar prędkości migracji, czasu konwergencji oraz tworzenia się granic tkanek.
- Badania translacyjne: Łączy rozwój podniebienia u ryb zebrafish z ludzkimi homologami kraniofacialnymi w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania obrazowania do oceny fenotypów rozwojowych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu poprzez bezpośrednią wizualizację decyzji dotyczących losów komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły fotoaktywacji i time-lapse dla powtarzalnego śledzenia grzebieni neuronalnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez powiązanie celów genetycznych z obserwowalnymi fenotypami kraniofacjalnymi.
- Wpływ na portfolio: Dostarcza podstaw do priorytetyzacji celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie nasilenia fenotypu rozwojowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w embriologii rybek danio-ostrzeżnych, mikroskopii konfokalnej oraz pracy z białkami fotokonwertowalnymi.
- Zależność od systemów konfokalnych z możliwością wzbudzania UV oraz infrastruktury do zatapiania w agarozie w celu unieruchomienia embrionów.
- Konieczność standaryzacji czasu fotoaktywacji oraz akwizycji stosu z-stack pomiędzy użytkownikami.
- Kwestie adaptacyjne obejmują zastosowanie różnych reporterów sterowanych przez promotory oraz stadium rozwoju w zależności od szczepów rybek danio-ostrzeżnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują fototoksyczność wynikającą z przedłużonej ekspozycji na UV oraz żywotność embrionów podczas długotrwałego obrazowania.
