Name: Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo z użyciem barwnika FM1-43 do pomiaru kinetyki usuwania toksyn tworzących pory z błony komórkowej. Technika ta pozwala ocenić rolę wapnia i sfingomielinazy w naprawie błony plazmatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH granty R37 AI34867 i R01 GM064625 dla N.W.A. Dziękujemy dr R. Tweten z University of Oklahoma za plazmid ekspresji SLO.

1. Wyciszenie transkrypcji ASM
<ol>
 <li>Wysiewać 1,5 x 105 komórek HeLa w 2 ml pożywki wzrostowej DMEM (DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1% Penn-Strep) na 35-milimetrowych szklanych szalkach z dnem (MatTek) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . </li>
 <li>Następnego dnia odessać pożywkę wzrostową i zastąpić ją 2 ml pożywki DMEM o zmniejszonej surowicy (DMEM z 4% FBS), co najmniej 1 godzinę przed dodaniem mieszaniny transfekcji siRNA. </li>
 <li>Przygotuj 4 probówki do mieszaniny oligo transfekcji siRNA. Do probówek A i C dodać 250 μl zredukowanej surowicy Optimem i 4 μl Lipofectamine RNAiMax na szalkę o średnicy 35 mm, która ma być poddana transfekcji. Do probówki B dodać 250 μl surowicy zredukowanej Optimem i 8 μl (160 pmol) pożywki kontrolnej o zawartości GC oligo (Control siRNA), na 35-milimetrową szalkę, która ma być transfekowana. Do probówki D dodać 250 μl surowicy zredukowanej Optimem i 8 μl (160 pmol) oligo SMPD1 (siASM) na szalkę o średnicy 35 mm, która ma być poddana transfekcji. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut. </li>
 <li>Połącz probówki A i B, aby utworzyć kompleks transfekcyjny dla siRNA kontrolnego oraz probówki C i D dla siRNA ASM. Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 20 minut. </li>
 <li>Powoli, kroplami, dodawać mieszaniny reakcyjne transfekcji siRNA i ASM do odpowiednich naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Po 24 godzinach od transfekcji delikatnie odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką wzrostową DMEM. W celu skutecznego knockdown ASM, szalki powinny być dalej inkubowane w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez około 31 godzin (łącznie 55 godzin) przed obrazowaniem na żywo. </li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników do mikroskopii na żywo
<ol>
 <li>Przygotować roztwór rekombinowanej toksyny porotwórczej Streptolizyny O (SLO) o stężeniu 100 ng / μl w zimnym 1x PBS bez Ca2+ i Mg2+. SLO stosowany w tych testach jest konstytutywnie aktywnym mutantem cysteiny, który nie wymaga środków redukujących do działania, dzięki uprzejmości dostarczonej przez dr Roda Twten z University of Oklahoma. Toksyna została wyrażona w E. coli BL21 DE3 i oczyszczona w warunkach natywnych, jak opisano wcześniej16. </li>
 <li>Przygotuj roztwór podstawowy FM1-43: Ponownie zawiesić liofilizowany proszek FM1-43 w DMSO, aby uzyskać roztwór o stężeniu 25 mM. </li>
 <li>Przygotuj roztwór A: Rozcieńczyć roztwór podstawowy FM1-43 w zimnym DMEM z Ca2+ do końcowego stężenia 4 μM (potrzebne jest 1,5 ml na szalkę MatTek) i przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie potrzebny.</li>
 <li>Przygotuj roztwór B: Rozcieńczyć roztwór podstawowy FM1-43 w zimnym DMEM bez Ca2+ i 10 mM EGTA (Ca2+-free DMEM) do końcowego stężenia 4 μM (1,5 ml potrzebne na szalkę MatTek) i przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie potrzebny.</li>
 <li>Wstępnie podgrzać (37 °C) 1 ml porcji roztworu A i roztworu B w probówkach Eppendorfa. </li>
 <li>Przechowywać na lodowych roztworach DMEM z Ca2+ i DMEM bez Ca2+. </li>
</ol>
3. Obrazowanie żywych komórek napływu FM1-43 do komórek leczonych i nieleczonych SLO
<ol>
 <li>Napełnij średniej wielkości płytki metalowy pojemnik pokruszonym lodem, odwróć go do dużego szklanego pojemnika z lodem i dodaj dodatkowy lód, pozostawiając odsłoniętą tylko dolną powierzchnię metalowego pojemnika. Połóż mokry ręcznik papierowy na odsłoniętym metalowym dnie, aby umożliwić równomierny transfer ciepła. </li>
 <li>Weź jedno naczynie MatTek nasączone kontrolnym siRNA (próbka 1) i umieść je na zimnym, mokrym ręczniku papierowym. Delikatnie odessać wszystkie media i przemyć 3x zimnym DMEM wolnym od Ca2+. Po ostatnim umyciu odessaj wszystkie media z naczynia. </li>
 <li>Aby zobrazować FM1-43 związany z komórkami w komórkach bez zranień SLO (próbka 1) w obecności Ca2+, dodaj 180 μl zimnego roztworu B do środkowego szklanego szkiełka nakrywkowego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm i inkubuj przez 5 minut na lodzie (Tabela 1). </li>
 <li>Umieść naczynie MatTek na stoliku mikroskopu konfokalnego podgrzanego do 37 °C i wyposażonego w komorę środowiskową (która utrzymuje temperaturę, wilgotność i poziomCO2). Znajdź pole komórek, które zostaną zobrazowane patrząc przez obiektyw 40X NA 1.3 (Nikon). Jeśli to możliwe, włącz PerfectFocus lub podobne urządzenie, aby skorygować dryft termiczny. </li>
 <li>Delikatnie dodać 1 ml podgrzanego roztworu A na bok naczynia o średnicy 35 mm i założyć pokrywę komory środowiskowej (Tabela 1). </li>
 <li>Rejestruj obrazy przez 4 minuty w 1 klatce co 3 sekundy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania (Volocity w systemie mikroskopii konfokalnej UltraView Vox Perkin Elmer z wirującym dyskiem). Wzbudzenie FM1-43 odbywa się za pomocą linii laserowej 488 nm przy użyciu filtra dichroicznego z pasmem 488 nm, a dyskryminacja emisji odbywa się za pomocą filtra emisyjnego 527(W55). Poziomy mocy lasera i czułość kamery są ustawione tak, aby osiągnąć ekspozycję obrazu 100 ms. </li>
 <li>Powtórz kroki od 3.2 do 3.6, aby wykryć FM1-43 w komórkach kontrolnych traktowanych siRNA bez zranienia SLO (próbka 2) pod nieobecność Ca2+, z wyjątkiem tego, że w kroku 3.5 należy dodać roztwór B (Tabela 1). </li>
 <li>Aby zmierzyć napływ FM1-43 do kontrolnych komórek traktowanych siRNA zranionych SLO w obecności (próbka 3) lub bez Ca2+ (próbka 4), dodaj 180 μl zimnego roztworu B zawierającego SLO do środkowego szklanego szkiełka nakrywkowego naczynia o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i inkubuj przez 5 minut na lodzie, jak w kroku 3.3. Powtórz kroki od 3.2 do 3.6; dostosuj, dodając roztwór A lub roztwór B w kroku 3.5 (Tabela 1). </li>
 <li>Aby określić rolę ASM w naprawie błony plazmatycznej, powtórz kroki 3.2-3.6 przy użyciu komórek traktowanych siRNA ASM we wszystkich warunkach (próbki 5-8) (Tabela 1).</li>
 <li>Aby określić rolę zewnątrzkomórkowej rekombinowanej sfingomielinazy (SM) na kinetykę naprawy błony plazmatycznej (odzwierciedlonej przez hamowanie napływu FM1-43) (próbki 9-10), SM dodaje się (0-50 μU) do roztworu A lub roztworu B w kroku 3.5, a następnie dodaje do komórek podczas obrazowania żywych komórek w całkowitej objętości 1 ml (Tabela 1). </li>
</ol>
4. Kwantyfikacja napływu FM1-43 do komórek
<ol>
 <li>Po pozyskaniu filmów zmierz intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowej FM1-43 za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (Volocity Suite, PerkinElmer). Narysuj obszar zainteresowania w obszarze cytozolowym każdej komórki w polu i zastosuj narzędzia programowe, aby określić średnią intensywność fluorescencji FM1-43 we wszystkich klatkach wideo. </li>
 <li>Aby dostosować się do zmian w początkowym barwieniu FM1-43, dane dla każdego filmu są wyrażane jako krotny wzrost intensywności fluorescencji w czasie i wykreślane dla każdego innego warunku. Krotny wzrost fluorescencji każdego pojedynczego punktu czasowego na komórkę oblicza się jako FT/F0, gdzie FT jest średnią fluorescencją w określonym punkcie czasowym, a F0 jest średnią fluorescencją w t = 0 (rysunki 1-2). </li>
</ol>

<ol><li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeilbrunn%2C+L+%22The+dynamics+of+living+protoplasm%22">The dynamics of living protoplasm</a>. , Academic Press. (1956).</li>
<li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChambers%2C+R+%22Explorations+into+the+nature+of+the+living+cell%22">Explorations into the nature of the living cell</a>. , Harvard University Press. (1961).</li>
<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+formation%3A+an+ancient+yet+complex+form+of+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li>
<li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li>
<li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li>
<li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2%2B-dependent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717(2011).</li>
<li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-dependent+cytolysins%2C+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li>
<li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li>
<li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 Forthcoming.</li>
<li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin%2C+lysenin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wcześniejsze badania nad urazami mechanicznymi i naprawą błony komórkowej opierały się na różnych mechanizmach uszkadzania komórek, począwszy od upuszczania szklanych kulek, mikropipetowania, ścinania, drapania lub skrobania. Odczyt wszystkich tych testów był raczej jakościowy niż ilościowy i nie dawał precyzyjnych informacji na temat kinetyki mechanizmu naprawczego. Zdolność komórek do ponownego uszczelnienia błony plazmatycznej po tych formach uszkodzenia mierzono obecnością lub brakiem znaczników dodanych do płynu z...

Od kilkudziesięciu lat wiadomo, że naprawa błony plazmatycznej po urazie mechanicznym jest procesem zależnym od Ca2+ 1,2. Późniejsze badania wykazały, że napływ Ca2+ przez ranę uruchamia energiczny proces egzocytozy pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w miejscu urazu, który jest wymagany do ponownego uszczelnienia3,4. Szybkość utraty barwnika fluorescencyjnego załadowanego do cytoplazmy komórek wykorzystano do oceny szybkości naprawy i stwierdzono, że ponowne uszczelnienie zostało zakończone w ciągu <30 sekundy po urazie5. Początkowo zaproponowano dwa modele, aby wyjaśnić wymóg egzocytozy w naprawie błony komórkowej: 1) model "łaty", który sugerował, że napływ Ca2+ przez zmianę wyzwala początkowo homotypową fuzję pęcherzyków wewnątrzkomórkowych, tworząc dużą "plamę", która następnie zostałaby nałożona na błonę plazmatyczną w celu ponownego uszczelnienia rany6 oraz 2) model redukcji napięcia, w którym zaproponowano, że błona dodana przez egzocytozę zależną od Ca2+ w pobliżu rany zmniejszy napięcie błony plazmatycznej, ułatwiając ponowne uszczelnienie dwuwarstwy7. Rola egzocytozy wyzwalanej przezCa2+ w naprawie błony plazmatycznej została dodatkowo wzmocniona przez badania wykazujące, że lizosomy zawierają cząsteczkę czujnika Ca2+, synaptotagminę VII, która ułatwia ich egzocytozę i naprawę błony plazmatycznej w uszkodzonych komórkach8,9,10,11.
Jednak dodatkowe dowody wskazują, że sama egzocytoza nie była wystarczająca do wspomagania naprawy błony komórkowej. Oprócz mechanicznych rozdarć błony komórkowej, częstą formą uszkodzenia komórek jest przenikanie przez toksyny tworzące pory wytwarzane przez bakterie12,13 lub komórki odpornościowe14,15. W przeciwieństwie do rozdarć mechanicznych, białka tworzące pory wprowadzają się do błony plazmatycznej, tworząc stabilny, wyłożony białkiem por, którego nie można ponownie uszczelnić po prostu przez nałożenie "łaty" błony lub zmniejszenie napięcia błony. Co ciekawe, badania wykazały, że komórki ssaków mają skuteczny mechanizm naprawy błony plazmatycznej po przepuszczalności z białkami tworzącymi pory, a proces ten wymaga również obecności zewnątrzkomórkowego Ca2 + 12. Odkrycie to zrodziło pytanie, czy transbłonowe usuwanie porów z powierzchni komórki było również szybkim procesem, jak zaobserwowano w przypadku ran mechanicznych5. Co zaskakujące, nasze ostatnie badania wykazały, że ponowne uszczelnianie komórek przesiąkniętych toksynami tworzącymi pory ma bardzo podobne właściwości do naprawy ran mechanicznych: proces ten wymaga zewnątrzkomórkowego Ca2+ i jest zakończony w ciągu ~30 sekund. Badając ten proces bardziej szczegółowo, dowiedzieliśmy się niedawno, że oprócz regulowanej przez Ca2+ egzocytozy lizosomów, naprawa błony plazmatycznej obejmuje szybką formę endocytozy, która jest wywoływana przez uwalnianie lizosomalnej enzymu kwasu sfingomielinazy (ASM) i jest niezbędna nie tylko do usuwania porów transbłonowych, ale także do naprawy ran mechanicznych16.
Aby określić kinetykę ponownego uszczelniania komórek po przesiąknięciu białkami tworzącymi pory, w naszym laboratorium dostosowaliśmy metodologię obrazowania na żywo, która była wcześniej używana do oceny ponownego uszczelnienia uszkodzonych laserowo izolowanych włókien mięśniowych17. Test ten opiera się na właściwościach lipofilowego barwnika FM1-43, który stabilnie interkaluje się w zewnętrzny płatek dwuwarstw lipidowych o zwiększonej intensywności fluorescencji. Kiedy dwuwarstwa błony plazmatycznej zostaje przerwana, barwnik zewnątrzkomórkowy uzyskuje dostęp do błon wewnątrzkomórkowych, zapewniając czuły test do wykrywania uszkodzenia błony plazmatycznej i naprawy18,16,19,20. Aby dostosować ten test do oceny ponownego uszczelniania komórek po przepuszczalności z białkami tworzącymi pory, wstępnie inkubowaliśmy komórki w temperaturze 4 °C z toksyną bakteryjną streptolizyną O (SLO), która wiąże się z cholesterolem błonowym21. Synchroniczną przepuszczalność komórek można następnie łatwo osiągnąć, przenosząc komórki z lodu do ciepłego podłoża w podgrzewanym mikroskopie, co aktywuje oligomeryzację i zmianę konformacji, która prowadzi do tworzenia się porów transbłonowych. Przewagą tego podejścia, w porównaniu z wcześniej publikowanymi testami wykorzystującymi ranienie laserowe, jest to, że większa liczba komórek może być analizowana jednocześnie w mikroskopijnym polu, co zapewnia lepsze pobieranie próbek populacji komórek. Biorąc pod uwagę mechanistyczne podobieństwa między procesem ponownego uszczelniania komórek obserwowanym po urazie mechanicznym a przenikaniem toksyn tworzących pory, opisywany przez nas test zapewnia bardzo wszechstronną i potężną metodę analizy czynników zaangażowanych w podstawowy proces naprawy błony komórkowej. Jako przykład pokazujemy, że możliwe jest użycie tego testu do identyfikacji zależnych i niezależnych etapów procesu naprawyCa2+.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>HeLa 229 linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CCL2-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoka zawartość glukozy </td><td></td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoka zawartość glukozy bez wapnia</td><td>Invitrogen</td><td>20168</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Optimem Obniżona surowica</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka kontrolna Zawartość GC Zawartość RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td></td></tr><tr><td>SMPD1 RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>HSS143988</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Inaktywowane termicznie</td><td>Gemini-Bioproducts</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Sfingomielinaza z Bacillus cereus</td><td>Sigma</td><td>S7651</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia dolne ze szkła 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Materiał</mocny></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C9100-50</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraViewVoX</td><td></td></tr><tr><td>Analiza oprogramowania oprogramowanie</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity Suite</td><td></td></tr><tr><td>Komora środowiskowa</td><td>Urządzenia patologiczne</td><td>Komora</td><td></td> systemu LiveCell</tr></tbody></table>

test obrazowania na żywo do oceny rolica2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Uszkodzenie błony plazmatycznej jest częstym zjawiskiem, a rany muszą być szybko naprawiane, aby zapewnić przetrwanie komórki. Napływ Ca2+ jest kluczowym zdarzeniem sygnalizacyjnym, które uruchamia naprawę ran mechanicznych na błonie plazmatycznej w ciągu ~30 sekund. Ostatnie badania wykazały, że komórki ssaków również ponownie uszczelniają swoją błonę plazmatyczną po przesiąknięciu toksynami tworzącymi pory w procesie zależnym od Ca2 +, który obejmuje egzocytozę enzymu lizosomalnego sfingomielinazy kwasowej, po której następuje endocytoza porów. W tym miejscu opisujemy metodologię zastosowaną do wykazania, że ponowne uszczelnienie komórek przepuszczalnych przez toksynę streptolizynę O jest również szybkie i zależne od napływu Ca2+. Konstrukcja testu umożliwia synchronizację zdarzenia urazu i precyzyjny pomiar kinetyczny zdolności komórek do przywrócenia integralności błony plazmatycznej poprzez obrazowanie i ilościowe określenie zakresu, w jakim lifofilowy barwnik FM1-43 dociera do błon wewnątrzkomórkowych. Ten żywy test pozwala również na czułą ocenę zdolności egzogennie dodanych czynników rozpuszczalnych, takich jak sfingomielinaza, do hamowania napływu FM1-43, odzwierciedlając zdolność komórek do naprawy błony komórkowej. Ten test pozwolił nam po raz pierwszy wykazać, że sfingomielinaza działa poniżej egzocytozy zależnej od Ca2 +, ponieważ zewnątrzkomórkowe dodanie enzymu sprzyja ponownemu uszczelnianiu komórek przepuszczalnych pod nieobecność Ca2+.

Niskie stężenia bakteryjnej sfingomielinazy (SM) przywracają naprawę błony plazmatycznej w komórkach pozbawionych lizosomalnej kwasowej sfingomielinazy.
Wykorzystując test obrazowania z użyciem FM1-43, wykazaliśmy wcześniej, że defekt błony komórkowej w komórkach z niedoborem lizosomalnego enzymu ASM, poddanych uszkodzeniu SLO w obecności Ca2+, zostaje cofnięty poprzez pozakomórkowe dodanie rekombinowanego ludzkiego enzymu19. Ponieważ ludzka lizosomalna ASM ma niskie pH opty...

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie lipofilowego barwnika FM 1 43 w obrazowaniu żywych komórek do pomiaru dokładnej kinetyki usuwania słabo działającej toksyny z błony plazmatycznej. Jest to realizowane poprzez wstępne wiązanie toksyny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Drugim krokiem jest przeniesienie szalki na podgrzewany stolik mikroskopu i znalezienie płaszczyzny ogniskowania, w której można wizualizować komórki.Następnie dodaj odpowiednie, uprzednio podgrzane medium i natychmiast rozpocznij obrazowanie. Ostatnim krokiem jest analiza i ilościowe oznaczenie wewnątrzkomórkowej fluorescencji FM 1 43. W rezultacie ten czuły test może być wykorzystany do oceny zapotrzebowania na wapń, fingal, mielinę oraz inne czynniki niezbędne do naprawy błony komórkowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak uszkadzanie laserowe, jest to, że ten test przenikania SLL umożliwia zsynchronizowane tworzenie ubytków w błonie plazmatycznej, które są bardzo jednorodne pod względem wielkości po zainicjowaniu procesu. Obrazowanie time-lapse w czasie rzeczywistym napływu barwnika lipofilowego pozwala na precyzyjne określenie kinetyki zasklepiania błony

live-imaging-assay-for-assessing-roles-ca2-sphingomyelinase-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test obrazowania na żywo do oceny ról Ca2+ i sfingomielinazy w naprawie ran powstałych w wyniku działania toksyn porotwórczych

Opisano tutaj protokoły służące do wizualizacji dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej zapośredniczonej przez MG53 w całych organizmach oraz na poziomie komórkowym. Metody te mogą być stosowane do badania biologii komórkowej uszczelniania błony plazmatycznej oraz w medycynie regeneracyjnej.

Wizualizacja naprawy błony komórkowej pośredniczonej przez MG53 z wykorzystaniem systemów in vivo i in vitro

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Proces leczenia uszkodzonych komórek polega na transporcie określonych białek i subkomórkowych przedziałów do miejsca uszkodzenia błony komórkowej. W tym protokole opisano testy do monitorowania tych procesów.

Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Skóra dorosłego C. elegans jest łatwym modelem do badań nad reakcjami na rany nabłonkowe, w tym zamykaniem ran, tworzeniem blizn i odpornością wrodzoną.

Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans

Tutaj opisana jest metoda wykorzystująca system infekcji oparty na wkładce membranowej do badania wpływu Streptolizyny S, wydzielanej toksyny wytwarzanej przez Streptococcus grupy A, na keratynocyty. System ten może być z łatwością zastosowany do badania innych wydzielanych białek bakteryjnych na różnych typach komórek gospodarza podczas infekcji.

Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Inaktywacja laserowa wspomagana chromeforem za pośrednictwemAlPcS 2a jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennych uszkodzeń pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV) w żywych komórkach.

Fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystujący główne promastigoty Leishmania do określenia wiązania, cytotoksyczności i sygnalizacji indukowanej przez toksyny tworzące pory. Dostarczony jest dowód słuszności koncepcji ze streptolizyną O. Inne toksyny mogą być również wykorzystane do wykorzystania mutantów genetycznych dostępnych w L. major do zdefiniowania nowych mechanizmów oporności na toksyny.

Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Metoda nakłuwania termoplazmonicznego łączy mikroskopię konfokalną, pęsetę optyczną i nanocząstki złota do badania reakcji białek podczas naprawy błony plazmatycznej w komórkach i gigantycznych pęcherzykach jednopłytkowych. Technika ta umożliwia szybkie i miejscowe nakłucie błony, co pozwala na identyfikację kluczowych białek i ich ról funkcjonalnych w skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej.

Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

Poznaj metodę obrazowania na żywo z użyciem barwnika FM1-43 do pomiaru kinetyki usuwania toksyn tworzących pory z błony komórkowej. Technika ta pozwala ocenić rolę wapnia i sfingomielinazy w naprawie błony plazmatycznej.

Test obrazowania na żywo do oceny roli^Ca2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Przeglądaj więcej filmów