Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest modyfikacja metalowych implantów w wielu skalach długości w celu kontrolowania zachowania komórek in vitro i in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie gradientu wielkości porów w trójwymiarowych implantach rurkowych, metodą ekstrakcji przez biofreeze. Drugim krokiem jest opracowanie nanofibrylarnych naśladowców błony podstawnej opartej na kolagenie i alginianach metodą warstwa po warstwie.

Następnie opracowano pośrednią metodę monitorowania takich implantów po implantacji za pomocą analizy osocza krwi. HPLC i późniejsze sekwencjonowanie peptydów demonstruje się ostatecznie w postaci implantu, w którym różne obszary mogą w razie potrzeby pomieścić różne typy komórek. Dla niektórych tkanek wielokomórkowych można uzyskać Chociaż ten system może zapewnić sposób na modyfikację metalowych implantów.

Może być również stosowany do systemów modeli 3D hodowli komórkowych, takich jak sztuczne tkanki lub modele chorób. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy znaleźć technikę kontrolowania ruchu komórek wokół porowatych implantów tytanowych in vivo. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść implanty oraz zaprojektuj i wyprodukuj formy teflonowe zgodnie z opisem w tekście pisemnym dotyczącym zamrażania i ekstrakcji.

Przygotować syntetyczny roztwór polimerowy PLLA w dwuskładnikowej mieszaninie dioksyn i wody, wprowadzając proszek polimerowy do rozpuszczalnika organicznego. Na magnetycznym Starr podgrzej mieszaninę do 60 stopni Celsjusza w celu uzyskania jednorodnego roztworu. Temperatura ta została wybrana, ponieważ jest to górna granica odporności na temperaturę dla precyzyjnych szklanych strzykawek, które mają być używane do wprowadzania roztworu do implantów.

W międzyczasie należy obliczyć objętość niezbędnego roztworu polimeru w stosunku do porowatości implantu, biorąc pod uwagę zmianę objętości zamrożonego roztworu. Następnie wprowadź roztwór do implantów za pomocą precyzyjnych szklanych strzykawek z dokładnością do 0,1 mikrolitra. Dolna granica stężenia polimeru wynosi 3% dla powtarzalnego tworzenia gradientu PO lub, gdy uzyskanie jednorodnego rozkładu w grubych próbkach powyżej 6% staje się trudne, zamrozić próbki bezpośrednio w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub z wcześniejszym okresem inkubacji wynoszącym 30 minut w temperaturze pokojowej.

Warunki zamarzania częściowo determinują tworzenie się porów. W ten sposób warunki zamrażania można dostosować do docelowej porowatości. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Oddzielenie formy w stanie zamrożonym jest bardzo trudnym krokiem. Należy zachować ostrożność, aby zmniejszyć kontakt zamrożonego roztworu dennego z pleśnią, za pomocą skóry głowy, Zanurz implanty w 80% wstępnie schłodzonym etanolu, aby uzyskać gradienty porowatości. Użyj wstępnie schłodzonego skalpela, aby usunąć wszystkie części formy z wyjątkiem trzpienia, w przypadku implantów rurkowych i wszystkich części z wyjątkiem dolnej części w przypadku implantów w kształcie dysku, przeprowadź ekstrakcję w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc.

Po ekstrakcji usuń pozostałe części formy i wysusz implanty na powietrzu. Do charakteryzowania ogólnej porowatości struktury. Konieczna jest analiza pulsoksymetru rtęciowego.

W tym przykładzie pomiary pulsoksymetru rtęciowego pokazują wyraźne piki, które odpowiadają porom po obu stronach implantu i mniejszym porom rozproszonym. Jednak bardziej istotnymi danymi jest różnica między porowatością powierzchni śródświetlnych i pozaświetlnych, które można analizować za pomocą obrazu J pod kątem rozkładu wielkości porów. Po zamarzaniu próbek poprzez obserwację przekroju czynnego za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.

Ze względu na otwarty porowaty charakter zastosowanych implantów i zdolność odbijania światła przez tytan, możliwe jest wykonanie stosów Z znakowanych komórek w porowatych implantach. Komórki znakowane PKH 26 lub wapniem AM można wykorzystać do wizualizacji implantów za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej w celu nagromadzenia wielu warstw. Najwyższą powtarzalność uzyskuje się za pomocą robotów zanurzających.

Jeśli jednak robot zanurzający nie jest dostępny, czynności te można wykonać ręcznie. Aby przygotować roztwór kolagenu, użyj kolagenu klasy medycznej typu pierwszego i alginianu sodu. Zoptymalizowane stężenia wynoszą 0,5 grama na litr na każde 150 milimolowców.

Bufor cytrynianu chlorku sodu o pH 3,8 rozpuść roztwór kolagenu przez noc, aby zapewnić jednorodność. Kwaśne pH roztworu 3,8 jest niezbędne do stabilnego tworzenia warstw, ponieważ struktura jest niestabilna. Przed sieciowaniem.

W konstrukcji o neutralnym pH specjalny uchwyt do wykorzystania implantów z robotami zanurzeniowymi stosowanymi w produkcji wielowarstwowej polielektrolitu. Warstwy należy osadzić na powierzchni implantów zawierających tylko tytan lub implantów zmodyfikowanych zgodnie z opisem w tekście. Za pomocą systemu robota zanurzającego najpierw zanurz implanty w roztworze alginianu na 15 minut, a następnie przepłucz strukturę 150-milimolowym chlorkiem sodu o pH 3,8 przez pięć minut.

Następnie zanurz w roztworze kolagenu na 15 minut. Aby najpierw ustabilizować błonę podstawną, przygotuj roztwór sieciujący o stężeniu 100 milimolowych genin. W buforze cytrynianu A-D-M-S-O w stosunku objętościowym od jednego do czterech rozpuść geninę w składniku DMSO, a następnie w składniku wodnym, aby uniknąć zbrylania się, sieciuj próbki przez zanurzenie w roztworze sieciującym między 12 a 24 godzinami później.

Przepłukać dużą ilością buforu cytrynianowego o pH 3,8 Po umyciu etapów wysterylizować próbki za pomocą promieniowania UV przez 30 minut lub w kąpieli przeciwgrzybiczej z antybiotykiem. Głównymi parametrami decydującymi o jakości naśladownictwa membrany podstawnej są jej grubość i średnica włókien. Oblicz średnice włókien za pomocą mikroskopii sił atomowych lub obrazów FM uzyskanych w trybie kontaktowym.

Po wysuszeniu próbek przepływem azotu, przed obrazowaniem należy określić ilościowo grubość co najmniej 10 włókien na obraz, aby określić średnią grubość włókien. Dzięki oprogramowaniu Image J po wysuszeniu 24-warstwowych wielowarstwowych folii kolagenowych z alginianu kolagenu, grubość folii można następnie określić za pomocą testów zarysowań. Używając najpierw FM, użyj igły strzykawki, aby zarysować folię po zlokalizowaniu zadrapania za pomocą mikroskopu świetlnego, uzyskaj obrazy z FM na powierzchniach o wymiarach 10 na 10 mikronów kwadratowych na granicy zadrapania.

Oblicz wysokości z profili uzyskanych za pomocą oprogramowania A FM, które zapewnia grubość warstwy folii. Po wszczepieniu urządzenia do tchawicy królików zgodnie z opisem w tekście, należy pobrać próbki krwi z ich żył usznych, odwirować próbki z prędkością 5 000 obr./min przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyć supernatantu otrzymanego do analizy po ekstrakcji osocza królika 0,1% kwasem triorowym octowym.

Przeprowadzić oczyszczanie HPLC z odwróconej fazy zawartości białka osocza poprzez oczyszczanie ekstraktu przy użyciu kolumny 305 C 18 z odwróconą fazą komórki jądra. Zapisać absorbancję przy 214 i 280 nanometrach przy użyciu systemu rozpuszczalnika i natężenia przepływu znajdujących się w protokole tekstowym. Zebrać frakcje pikowe przed ich zagęszczeniem przez odparowanie.

Korzystając z szybkiej aplikacji próżniowej, ważne jest, aby zatrzymać próżnię prędkości przed całkowitym wyschnięciem. Skoreluj piki uzyskane w różnych punktach czasowych w trakcie okresu implantacji. Użyj oczyszczonych peptydów, które wykazują stałe tendencje w trakcie implantacji, do identyfikacji za pomocą automatycznego sekwencjonowania Edmonda.

Załaduj próbkę do filtrów z włókna szklanego poddanych obróbce polimózgu, określ końcową sekwencję końcową oczyszczonych peptydów poprzez automatyczną degradację Edmonda przy użyciu profesjonalnego mikrosekwencera. Następnym krokiem jest identyfikacja fenylu i jednego aminokwasu za pomocą chromatografii na kolumnie C 18. Po uzyskaniu sekwencji można ją zidentyfikować za pomocą oprogramowania do obróbki strumieniowo-ściernej przy użyciu bazy danych Swiss Prote.

Zmieniając stężenie roztworu PLLA, możliwe jest kontrolowanie wielkości porów po dodatkowej stronie świetlnej implantów. Na wielkość i kształt porów istotny wpływ miała obecność implantów tytanowych. Rozmiary porów wahały się od 40 do 100 mikrometrów, przy czym zastosowanie niższych stężeń skutkowało mniejszymi porami, podczas gdy wielkość porów po stronie śródświetlnej była regulowana przez ograniczoną ekstrakcję i wynosiła około dziewięciu mikronów, czyli mniej niż średnia wielkość fibroblastów.

Dodając etap inkubacji w temperaturze pokojowej, można uzyskać podwójnie porowate struktury, w których ścianki porów większych porów mają swoją własną porowatość. Ta cecha jest ważna w przypadku grubych implantów, ponieważ ułatwi ruch gazów i składników odżywczych. Po utworzeniu gradientu porów możliwe jest dodanie warstwy filmu z alginianu kolagenu na wierzch struktury.

Ta warstwa folii jest stabilna na wierzchu pianki PLLA i może być również utrzymywana na powierzchni w przypadku braku nanoskalowych włókien kolagenowych pianki. Wraz ze wzrostem warstwy folii wzrost folii jest wykładniczy. W ten sposób można uzyskać grubą warstwę o grubości kilkuset nanometrów.

Porowate implanty tytanowe integrują się z tkanką gospodarza i są całkowicie wypełniane w ciągu czterech do sześciu tygodni in vivo, jak pokazano w przekrojach eksplantowanych implantów. Tkanka w porach jest dojrzałą tkanką łączną o dobrym poziomie unaczynienia. W tym okresie analiza HPLC wykazała wyraźne wartości szczytowe, które zmieniają się w czasie implantacji.

Interesujące nas frakcje szczytowe zostały zsekwencjonowane i określone jako półłańcuchy hemoglobiny alfa i beta, które wykazały podobny trend z odczytami białka C-reaktywnego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć wieloskalowe gradienty PO 3D do modyfikacji implantów metalowych i eksperymentów z hodowlami komórkowymi.

Ekstrakcja przez wymrażanie i warstwa przez tworzenie filmu to proste metale do opracowania własnych zmodyfikowanych implantów lub mikrośrodowisk dla komórek.