Name: Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj techniki modyfikacji metalowych implantów z gradientami porów i nanowłóknistymi naśladowcami błony podstawnej z kolagenu i alginianu. Metoda umożliwia kontrolę migracji komórek in vitro i in vivo oraz pośrednie monitorowanie integracji implantów poprzez analizę osocza krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Andre Walderowi i Nicolasowi Perrinowi za wykonanie tytanowych implantów, K. Benmlihowi za stworzenie form teflonowych oraz Dr. G. Prevostowi za pomoc w eksperymentach na zwierzętach. Dziękujemy również Regionowi Alzacja i PMNA (Pole Materiaux et Nanosciences d'Alsace) za wkład finansowy.

1. Przygotowanie gradientów mikroporów w makroporowatych implantach metalicznych
<ol>
	<li>Oczyść implanty (takie jak implanty wykonane z kulek tytanowych klasy medycznej o zakresie wielkości 400-500 μm, Neyco SAS, Francja) etanolem, a następnie poddaj sonikacji w acetonie przez 15 minut.</li>
	<li>Projektuj i produkuj formy teflonowe zgodnie z rozmiarem i kształtem implantu (do standardowych eksperymentów stosuje się formy cylindryczne o średnicy 1,5 cm i wysokości 2 cm). Formy powinny być modułowe, aby niektóre części można było usunąć podczas ekstrakcji. Taka konstrukcja formy zapewnia kontrolę nad procesem ekstrakcji poprzez wymuszenie ruchu płynu ekstrakcyjnego w sposób kierunkowy.</li>
	<li>W przypadku implantów rurkowych przeznaczonych do zastąpienia tchawicy, struktura powinna składać się z trzech części: i) dolnej części w celu określenia rozmiaru implantu, ii) trzpienia i iii) zewnętrznego rdzenia, który jest wyjmowany. W ten sposób gradient wielkości porów może być formowany od zewnątrz do wewnątrz.</li>
	<li>Przygotować roztwór polimeru syntetycznego (PLLA): Do zamrażania/ekstrakcji roztwór PLLA należy przygotować w mieszaninie binarnej dioksanu i wody (87:13%, v:v).</li>
	<li>Podgrzać mieszaninę do temperatury 60 °C w celu uzyskania jednorodnego roztworu. Temperaturę 60 °C wybrano, ponieważ jest to górna granica odporności na temperaturę dla precyzyjnych szklanych strzykawek, która musi być użyta do wprowadzenia roztworu do implantów.</li>
	<li>W przypadku stosowania roztworów PLLA o wysokim stężeniu (≥6%) o dużej masie cząsteczkowej, roztwór należy wprowadzić do implantu natychmiast po podgrzaniu. W przeciwnym razie żelowanie roztworu następuje bez pełnego zanurzenia.</li>
	<li>Obliczyć objętość niezbędnego roztworu polimeru w odniesieniu do porowatości implantu, dla dokładności można uwzględnić zmianę objętości zamrożonego roztworu.</li>
	<li>Wprowadzić roztwór do implantów za pomocą precyzyjnych szklanych strzykawek z dokładnością do 0,1 μl. Dolna granica stężenia polimeru wynosi 3% dla powtarzalnego tworzenia gradientu porów, podczas gdy uzyskanie jednorodnego rozkładu w grubych próbkach powyżej 6% staje się trudne. Jednak do konkretnych zastosowań można stosować inne stężenia.</li>
	<li>Próbki należy zamrozić bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub w okresie inkubacji wynoszącym 30 minut w temperaturze pokojowej. Warunki zamarzania częściowo determinują tworzenie się porów, dzięki czemu warunki zamarzania można dostosować do docelowej porowatości. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Ekstrakcja: Zanurz implanty w 80% wstępnie schłodzonym EtOH. Ekstrakcję przeprowadzać w temperaturze -20 °C przez noc. Aby uzyskać gradienty porowatości, należy usunąć wszystkie części formy z wyjątkiem trzpienia w przypadku implantów rurkowych i wszystkich części z wyjątkiem dolnej części w przypadku implantów w kształcie dysku. Użyj wstępnie schłodzonego skalpela, aby ułatwić oddzielenie pleśni.</li>
	<li>Po ekstrakcji w temperaturze -20 °C przez noc 19 usuń pozostałe części formy i wysusz implanty na powietrzu. Do scharakteryzowania ogólnej porowatości konstrukcji konieczna jest analiza porozymetryczna rtęci. Pomiary porozymetrem rtęciowym wykazały wyraźne piki, które odpowiadają porom po obu stronach implantu i mniejszym porom międzyrozproszonym. Jednak bardziej istotnymi danymi jest różnica między porowatością powierzchni śródświetlnych i pozaświetlnych, którą można analizować za pomocą obrazu J pod kątem rozkładu wielkości porów za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) 20. W celu sprawdzenia gradientu porów należy przetworzyć próbki metodą zamrażania i szczelinowania i obserwować przekrój za pomocą SEM.</li>
	<li>Ze względu na otwarty porowaty charakter zastosowanych implantów i zdolność odbijania światła przez tytan, możliwe jest wykonanie z-stosów znakowanych komórek w porowatych implantach. Oznacz komórki za pomocą PKH26 lub Calcein-AM i uwidocznij implanty za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.</li>
</ol>
2. Powlekanie powierzchni porowatych implantów metalicznych wielowarstwami kolagenu/alginianu
<ol>
	<li>W przypadku tworzenia warstw wielowarstwowych najwyższą powtarzalność uzyskuje się za pomocą robotów zanurzających. Jeśli jednak robot zanurzający nie jest dostępny, czynności te można wykonać ręcznie.</li>
	<li>Używaj kolagenu klasy medycznej typu I i alginianu sodu. Zoptymalizowane stężenia wynoszą 0,5 g/l na każde 150 mM NaCl w buforze cytrynianowym o pH 3,8.</li>
	<li>Rozpuść roztwór kolagenu przez noc, aby zapewnić jednorodność roztworu. Kwaśne pH 3,8 jest niezbędne do stabilnego tworzenia warstw, ponieważ struktura jest niestabilna przed usieciowaniem w neutralnym pH.</li>
	<li>Nakładaj warstwy za pomocą systemu robota zanurzającego, zanurzając implanty naprzemiennie w roztworach kolagenu i alginianu. Czas osadzania wynosi 15 min dla każdej kolejnej warstwy. Przepłukać strukturę pomiędzy etapami osadzania za pomocą 150 mM NaCl o pH 3,8 przez 5 minut.</li>
	<li>Zaprojektuj specjalny uchwyt do wykorzystania implantów z robotami zanurzeniowymi stosowanymi w produkcji wielowarstwowej polielektrolitu. Warstwy należy osadzić na powierzchni implantów zawierających tylko tytan lub implantów zmodyfikowanych zgodnie z opisem w punkcie 1.</li>
	<li>Stabilizacja błony podstawnej za pomocą genipiny: Przygotować roztwór sieciujący w buforze dimetylosulfotlenku (DMSO)/cytrynianu (150 mM NaCl, pH 3,8) w stosunku 1:4 v:v. Można stosować szeroki zakres stężeń, a 100 mM jest wystarczające do sieciowania. Najpierw rozpuść genipinę w składniku DMSO, a później dodaj składnik wodny, aby uniknąć zbrylania.</li>
	<li>Sieciować próbki przez zanurzenie w roztworze sieciującym między 12 a 24 godzinami. Następnie spłukać dużą ilością buforu cytrynianowego (pH 3,8).</li>
	<li>Po umyciu próbki należy wysterylizować za pomocą promieniowania UV (30 min) lub kąpieli antybiotykowej/przeciwgrzybiczej (penicylina/streptomycyna, fungizone).</li>
	<li>Głównymi parametrami decydującymi o jakości naśladownictwa membrany podstawnej są jej grubość i średnica włókien. Oblicz średnice włókien za pomocą obrazów mikroskopii sił atomowych (AFM) uzyskanych w trybie kontaktowym. Przed obrazowaniem wysuszyć próbki strumieniem azotu. Określ ilościowo grubość co najmniej 10 włókien na obraz, aby określić średnią grubość włókien za pomocą oprogramowania Image J.</li>
	<li>Grubość folii można określić za pomocą testów zarysowania za pomocą AFM. Suche (COL/ALG)24 / COL folie wielowarstwowe. Użyj igły strzykawki, aby zarysować folię. Po zlokalizowaniu rysy za pomocą mikroskopu świetlnego należy uzyskać obrazy za pomocą AFM na powierzchniach 10 x 10μm2 na granicy rysy. Oblicz wysokości z profili uzyskanych za pomocą oprogramowania AFM, które zapewnia grubość warstwy folii.</li>
</ol>
3. Pośrednie monitorowanie integracji implantów in vivo poprzez analizę osocza krwi
<ol>
	<li>W przypadku doświadczeń na zwierzętach należy uzyskać wszystkie niezbędne zgody komitetu, zgodnie z zasadami obowiązującymi w każdym kraju 21. W naszym przypadku postępuje się zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania (Krajowa Rada ds. Badań Naukowych, 2010) i uzyskuje się zgodę komisji etycznej Uniwersytetu w Strasburgu.</li>
	<li>Przeprowadzić implantację w miejscu docelowym. Podany tutaj protokół monitorowania krwi został wykorzystany do wymiany tchawicy u białych królików nowozelandzkich po resekcji tchawicy 15 mm.</li>
	<li>Po implantacji konieczna jest codzienna obserwacja, taka jak monitorowanie ogólnego samopoczucia zwierząt (gojenie się wokół miejsc operowanych, tempo oddychania) i rejestrowanie ich wagi.</li>
	<li>Aby zweryfikować badanie krwi, należy użyć dobrze ugruntowanej metody, takiej jak testy ELISA na poziom CRP we krwi. Dostępne są testy CRP dla wielu zwierząt, a konkretny test stosowany u królików jest wymieniony w tabeli 1. Podobnie, użyj western blot do określenia poziomów CGA. W protokole tym zastosowano przeciwciała monoklonalne anty-CGA (anty-CGA47-68).</li>
	<li>W celu scharakteryzowania osocza należy pobrać próbki krwi z żył usznych królików. Wirować przy 5 000 obr./min przez 20 min w temperaturze 4 °C. Użyć otrzymanego supernatantu do analizy. W naszej procedurze badania te są wykonywane co tydzień, ale możliwe są również częstsze testy.</li>
	<li>Oczyszczanie HPLC z odwróconej fazy zawartości białka w osoczu: Ekstrahować osocze królika 0,1% kwasem trifluorooctowym (1:1; v:v). Oczyszczać ekstrakt za pomocą systemu Dionex HPLC (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA, USA) na kolumnie jąderka 300-5C18 z odwróconymi fazami (4 x 250 mm; wielkość cząstek 5 μm; porowatość, 300 A).</li>
	<li>Zanotować absorbancję przy 214 i 280 nm. Zastosowany system rozpuszczalników to i) Rozpuszczalnik A: 0,1% (v/v) kwas trifluorooctowy (TFA) w wodzie i ii) Rozpuszczalnik B: 0,09% (v/v) TFA w 70% (v/v) acetonitrylu w wodzie.</li>
	<li>Stosować natężenie przepływu 700 μl/min przy użyciu gradientów dla elucji. Zbierz frakcje szczytowe. Zagęścić frakcje przez odparowanie przez aplikację szybko-próżniową. Ważne jest, aby zatrzymać próżnię przed całkowitym wyschnięciem.</li>
	<li>Skoreluj piki uzyskane w różnych punktach czasowych w trakcie okresu implantacji. Użyj oczyszczonych peptydów, które wykazują stałe tendencje w trakcie implantacji, do identyfikacji za pomocą automatycznego sekwencjonowania Edmana.</li>
	<li>Automatyczne sekwencjonowanie peptydów metodą Edmana: Określ N-końcową sekwencję oczyszczonych peptydów poprzez automatyczną degradację Edmana przy użyciu mikrosekwenatora Procise. Załadować próbkę do filtrów z włókna szklanego nasączonych polibrenem. Kolejnym krokiem jest identyfikacja aminokwasów fenylotiohydantoiny (Pth-Xaa) za pomocą chromatografii na kolumnie C18 (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Po uzyskaniu sekwencji można ją zidentyfikować za pomocą oprogramowania Blast za pomocą bazy danych SWISS-Prot .</li>
</ol>

<ol><li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).</li>
<li>Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+methods+of+porous+metals+for+use+in+orthopaedic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications.</a> Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).</li>
<li>Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+tracheal+prostheses+made+of+porous+titanium%3A+a+study+on+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22European+Archives+of+Oto-Rhino-Laryngology%22%5BJournal%5D)">Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).</li>
<li>Janssen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laryngotracheal+reconstruction+with+porous+titanium+in+rabbits%3A+are+vascular+carriers+and+mucosal+grafts+really+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).</li>
<li>Li, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+ingrowth+in+porous+titanium+implants+produced+by+3D+fiber+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition.</a> Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).</li>
<li>Schultz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+multilayers+functionalized+by+a+synthetic+analogue+of+an+anti-inflammatory+peptide%2C+alpha-MSH%2C+for+coating+a+tracheal+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis.</a> Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).</li>
<li>Müller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Functionalized+Polyelectrolyte+Multilayers+as+Proangiogenic+Prosthetic+Coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings.</a> Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).</li>
<li>Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Geometric+Challenges+on+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Effect of Geometric Challenges on Cell Migration.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).</li>
<li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26, 433-441 (2005).</li>
<li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).</li>
<li>Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+porous+poly%28L-lactide%29+%28PLLA%29+scaffolds+for+tissue+engineering+using+liquid+-+liquid+phase+separation+and+freeze+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li>
<li>Chaubaroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-Based+Fibrillar+Multilayer+Films+Cross-Linked+by+a+Natural+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent.</a> Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+spatial+architecture+on+cellular+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effect of spatial architecture on cellular colonization.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).</li>
<li>Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+for+vascularization+-+Learning+from+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems for vascularization - Learning from nature.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).</li>
<li>Lavalle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Aspects+of+Films+Prepared+by+a+Sequential+Deposition+of+Species%3A+Perspectives+for+Smart+and+Responsive+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials.</a> Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentration+of+chromogranin+A+at+admission%3A+An+early+biomarker+of+severity+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients.</a> Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).</li>
<li>Goh, Y., Ooi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+characterization+of+porous+poly%28l+-lactide%29+scaffolds+using+solid+-+liquid+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).</li>
<li>Vrana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+macroporous+titanium+tracheal+implants+with+biodegradable+structures%3A+Tracking+in+vivo+integration+for+determination+of+optimal+in+situ+epithelialization+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).</li>
<li>Dupret-Bories, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+surgical+protocol+for+implantation+of+tracheal+prostheses+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rehabil.+Res.+Dev%22%5BJournal%5D)">Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).</li>
<li>Gasnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+location+of+post-translational+modifications+on+chromogranin+B+from+bovine+adrenal+medullary+chromaffin+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules.</a> Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).</li>
<li>Vrana, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+Titanium%2FBiodegradable+Polymer+Implants+with+an+Hierarchical+Pore+Structure+as+a+Means+to+Control+Selective+Cell+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement.</a> PLoS ONE. 6, e20480(2011).</li>
<li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Fibrin+Gel+Bead+Assay+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (3), e186(2007).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cells+and+Their+Use+in+the+Study+of+Neutrophil+Transmigration+Under+Flow+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), e4032(2012).</li>
<li>Dong, C. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomediated+crosslinking+of+C6-cinnamate+derivatized+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen.</a> Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).</li>
</ol>

NE Vrana jest pracownikiem firmy Protip SAS.

Gradienty porów są ważnymi narzędziami w inżynierii tkankowej interfejsu, a opisany tutaj system może być używany samodzielnie lub w połączeniu z metalowymi implantami w celu utworzenia gradientu porów w celu badania migracji komórek. System nie wymaga żadnych dodatkowych ustawień ani dodatkowego wyposażenia, z wyjątkiem dygestorium chemicznego do obsługi rozpuszczalników organicznych, dzięki czemu może być stosowany w laboratoriach biologicznych. Podobne polimery, takie jak kwas poli(glikolowy) (PGA), kwas poli(mlekowo-...

Obecnie dostępne metalowe implanty nadają się do zastosowań nośnych, ale ich niedegradowalność wymaga konstrukcji, które zapewniają silne połączenie z otaczającą je tkanką 1. Zapewniając struktury, które ułatwiają rozwój komórkowy i kolonizację in vivo, można przedłużyć żywotność implantów metalowych 2. Otwarcie porowate implanty metalowe są obiecującymi materiałami do inżynierii granicy faz tkankowych, a także do zapewnienia dobrej kolonizacji implantów. Są one aktywnie stosowane jako implanty ortopedyczne, a także jako implanty tchawicy 3-5. Jednak nadal istnieją problemy, które należy rozwiązać, takie jak precyzyjna kontrola ruchu komórek w obszarach porów. Brak kontroli nad tym procesem może prowadzić do niepełnej kolonizacji w jednym końcu i restenozy w drugim. Dalsza funkcjonalizacja tych implantów jest również niezbędna do osiągnięcia wyższych funkcji, takich jak dostarczanie czynników wzrostu, ukierunkowane unaczynienie i jednoczesny ruch różnych typów komórek 6-8. W przypadku implantów tchawicy ma to kluczowe znaczenie, ponieważ pożądana jest kolonizacja implantu przez unaczynioną tkankę. Jednak niekontrolowane wrastanie tkanek do światła tchawicy jest niepożądane, ponieważ zmniejsza drożność implantu.
Jedną z możliwości kontrolowania ruchu komórek jest wykluczenie rozmiaru. Znając wielkość komórek docelowych i ich zdolność do interakcji z danym polimerem syntetycznym, możliwe jest opracowanie gradientów porów, które mogą skutecznie określić głębokość ruchu komórki. Na przykład poprzez stworzenie architektury porów, która jest wystarczająco duża, aby komórki tkanki łącznej, takie jak fibroblasty, mogły dostać się zewnątrz, ale wystarczająco mała (mniej niż 10 μm), aby zapobiec ich ruchowi w obrębie światła, można osiągnąć skuteczną kontrolę nad kolonizacją implantu rurkowego.
Spośród dostępnych metod tworzenia porów, takich jak liofilizacja, ługowanie cząstek, spienianie gazowe 9,10; najłatwiejszą do zaadaptowania metodą szybkiego tworzenia gradientów porów przy minimalnej ilości niezbędnych urządzeń jest zamrażanie 11. W tej metodzie roztwór polimeru zamraża się w dwuskładnikowej mieszaninie rozpuszczalnika organicznego i wody. Następnie rozpuszczalnik jest wymieniany poprzez ekstrakcję przez mieszalną, wstępnie schłodzoną ciecz, taką jak etanol. Warunki zamrażania i ekstrakcji określają kształt i wielkość porów, a jeśli ekstrakcja odbywa się w sposób, w którym ruch roztworu ekstrakcyjnego może być kontrolowany, wielkość i kształt porów można modulować kierunkowo.
Drugim krokiem dla tkanek wielokomórkowych jest tworzenie porowatych barier między różnymi typami komórek w celu kontrolowania ich interakcji. Jest to również konieczne ze względu na dostępność różnych mikrośrodowisk dla różnych typów komórek w zależności od ich wymagań 12,13. Tchawica to narząd rurkowy, który łączy krtań z oskrzeliami. Ma wewnętrzną pseudostratyfikowaną wyściółkę nabłonka rzęsek z rozproszonymi komórkami kubkowymi, które wytwarzają śluz. Struktura 3D i stabilność tchawicy jest utrzymywana przez chrząstkę w kształcie pierścieni C. Tak więc w sztucznej tchawicy powinno być określone połączenie między tkanką łączną a warstwą nabłonka rzęskowego. Podczas gdy struktura 3D jest niezbędna dla części tkanki łącznej, migracja komórek nabłonkowych wymaga powierzchni przypominającej błonę podstawną, aby uzyskać ruch kierunkowy i zamknięcie rany. Wielowarstwowe folie polielektrolitowe (PEM) są jedną z możliwych opcji uzyskania immiki membrany podstawnej. Metoda warstwa po warstwie (LbL) to wszechstronny proces uzyskiwania cienkich i funkcjonalnych powłok powierzchniowych. Opiera się na oddziaływaniach elektrostatycznych dwóch przeciwnie naładowanych polielektrolitów i ich sekwencyjnym gromadzeniu w celu uzyskania powłok powierzchniowych w nanoskali, których właściwości można zmieniać poprzez prostą zmianę zmiennych, takich jak gatunki polielektrolitu, pH, liczba warstw, dodanie warstwy zakrywającej, sieciowanie itp. Jedną z głównych zalet metody LbL jest jej zdolność do dostosowania się do topografii podłoża leżącego pod spodem. Dzięki temu w kontrolowanych warunkach metoda ta może być również stosowana do uzyskiwania pokrycia powierzchniowego porowatych struktur. Jeśli kolagen zostanie użyty jako jeden z polielektrolitów, możliwe jest uzyskanie struktur nanofibrylarnych, które mogą naśladować powierzchnię błony podstawnej. Hydrofobowość tytanu umożliwia rozwój takich struktur, a fibrylarność może być zachowana w grubych powłokach 14. W ten sposób można również kontrolować przyczepianie i ruch komórki na powierzchni. Dzięki zastosowaniu ekstrakcji przez wymrażanie i sekwencyjnego powlekania folią LbL można uzyskać strukturę, w której ruch komórek może być kontrolowany poprzecznie, wzdłużnie i obwodowo 15.
Tutaj opisujemy dwie nowatorskie metody modyfikacji implantów tytanowych poprzez wykorzystanie ich hydrofobowego zachowania, które można rozszerzyć na modyfikację różnych porowatych implantów: i) tworzenie gradientów mikroporów w makroporowatych implantach tytanowych za pomocą hydrofobowych, syntetycznych polimerów, ii) tworzenie grubej warstwy polimerowej warstwy na powierzchni implantu, która wspomaga wzrost komórek i tworzenie wyściółki przez wielowarstwowe polielektrolity. Metody te mogą być stosowane sekwencyjnie lub osobno. Zapewniają one struktury, które zapewniają kontrolowaną migrację i organizację przestrzenną różnych typów komórek w tkankach wielokomórkowych 16,17. W konkretnym przypadku tchawicy pożądanym rezultatem implantu byłaby kolonizacja przez tkankę włóknisto-naczyniową w gradientach mikroporów bez restenozy i tworzenie wewnętrznej wyściółki komórek nabłonka rzęskowego na wielowarstwach polielektrolitu.
Jednym ze sposobów kontrolowania integracji implantów jest wykonywanie małych interwencji chirurgicznych w okresie ich integracji z gospodarzem in situ. Aby móc zdecydować o czasie interwencji, ważne jest, aby mieć informacje na temat ogólnoustrojowych skutków implantu. Białko C-reaktywne (CRP) jest stosowane do monitorowania infekcji i odpowiedzi zapalnej w warunkach klinicznych. Chromogranina A (CGA) może być również stosowana w podobny sposób i może zapewnić dokładniejsze wyniki w celu obserwacji poziomu stanu zapalnego 18. Jako możliwy sposób obserwacji integracji implantów metalicznych in vivo, przedstawiamy procedurę ciągłego monitorowania efektów ogólnoustrojowych implantów poprzez charakteryzację próbek krwi zwierzęcej za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie sekwencjonowanie białek. Opracowanie tej metody może być wykorzystane do uniknięcia regularnej analizy histologicznej punktu końcowego. Histological cutting metalowych implantów jest długim, kłopotliwym i kosztownym procesem i może być wykonywany tylko w określonych punktach czasowych. Z tego powodu dobrze zaprojektowane badania krwi dostarczające rzetelnych informacji na temat stanu implantów mogą być możliwymi sposobami na zmniejszenie liczby doświadczeń na zwierzętach, zgodnie z niedawnymi przepisami UE dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach.
Przedstawione tutaj metody mogą być wykorzystane do poprawy wydajności metalowych implantów poprzez funkcjonalizację lub do stworzenia alternatywnego sposobu monitorowania istniejących implantów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik</td></tr><tr><td>Dioxane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360481</td><td>Materiał toksyczny, Ściśle pod kapturem chemicznym</td></tr><tr><td>PLLA i. Lepkość własna poli(L-laktydu) ~0,5 dl/g ii. Lepkość własna poli(L-laktydu) ~ 2,0 dl / g </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94829, 81273</td><td>Wybór masy cząsteczkowej i lepkości naturalnej zależy od zastosowania.</td></tr><tr><td>PRONOVA UP LVG (alginian sodu)</td><td>Novamatrix</td><td>4200006</td><td>Niska lepkość (20-200 mPa.s)</td></tr><tr><td>Kolagen typu I (bydlęcy)</td><td>Symaty</td><td>CBPE2US100</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep, Fungizone </td><td>Promocell</td><td>C42020</td><td></td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako</td><td>0703021</td><td></td></tr><tr><td>Sondy z azotku krzemu o stałej sprężystości 0,03 Nm -1. </td><td>Bruker</td><td>MSCT</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy do HPLC ,&ge; 99,0% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td>Materiał niebezpieczny, należy uważnie przestrzegać MSDS</td></tr><tr><td>Acetonitryl, do HPLC ,&ge; 99,9% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego znakowania błony komórkowej </td><td>Zestaw ELISA Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit C-Reactive Protein (CRP)</td><td>Genway Bio</td><td>GWB-9BF960</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Bioodczynnik, &ge; 99,7% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Multimode Nanoscope IV Mikroskop sił atomowych</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Procise Microsekwencer </td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultima 3000 System HPLC </td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy Hitachi TM 100</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy Zeiss LSM 510 </td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Lista materiałów i odczynników.</td></tr></tbody></table>

wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Implanty metalowe, szczególnie implanty tytanowe, są szeroko stosowane w zastosowaniach klinicznych. Wrastanie tkanek i integracja z tymi implantami w tkankach są ważnymi parametrami dla pomyślnych wyników klinicznych. W celu poprawy integracji tkanek opracowywane są porowate implanty metalowe. Otwarta porowatość pianek metalicznych jest bardzo korzystna, ponieważ obszary porów można funkcjonalizować bez uszczerbku dla właściwości mechanicznych całej konstrukcji. Tutaj opisujemy takie modyfikacje z wykorzystaniem porowatych implantów tytanowych opartych na mikrogranulkach tytanu. Dzięki wykorzystaniu nieodłącznych właściwości fizycznych, takich jak hydrofobowość tytanu, możliwe jest uzyskanie hydrofobowych gradientów porów w implantach metalowych na bazie mikrokulek, a jednocześnie uzyskanie immiki membrany podstawnej opartej na hydrofilowych, naturalnych polimerach. Gradienty porów 3D są tworzone przez syntetyczne polimery, takie jak kwas poli-L-mlekowy (PLLA), metodą ekstrakcji przez zamrażanie. Powierzchnie nanofibrylarne 2D są formowane przy użyciu kolagenu/alginianu, a następnie etapu sieciowania za pomocą naturalnego środka sieciującego (genipiny). Ten film nanofibrylarny został zbudowany metodą osadzania warstwa po warstwie (LbL) dwóch przeciwnie naładowanych cząsteczek, kolagenu i alginianu. Wreszcie, można uzyskać implant, w którym różne obszary mogą pomieścić różne typy komórek, ponieważ jest to konieczne dla wielu tkanek wielokomórkowych. W ten sposób można kontrolować ruch komórek w różnych kierunkach przez różne typy komórek. Taki system jest opisany dla konkretnego przypadku regeneracji tchawicy, ale może być zmodyfikowany dla innych narządów docelowych. Omówiono analizę migracji komórek i możliwe metody tworzenia różnych gradientów porów. Kolejnym krokiem w analizie takich implantów jest ich charakterystyka po implantacji. Jednak analiza histologiczna implantów metalowych jest długim i kłopotliwym procesem, dlatego do monitorowania reakcji gospodarza na implanty metalowe in vivo opisano również alternatywną metodę opartą na monitorowaniu CGA i różnych białek krwi. Metody te mogą być wykorzystywane do opracowywania niestandardowych testów migracji i kolonizacji in vitro, a także do analizy funkcjonalizowanych implantów metalowych in vivo bez histologii.

Tworzenie gradientów porów
Poprzez zmianę stężenia roztworu PLLA możliwe jest kontrolowanie wielkości porów po stronie pozaszyjnej implantów. Na wielkość i kształt porów znaczący wpływ miała obecność implantów tytanowych (Rysunki 1a i 1b). Rozmiary porów mieściły się w zakresie 40-100 μm, a zastosowanie niższych stężeń prowadziło do powstania mniejszych porów. Natomiast po stronie wewnątrzaszyjnej wielkość porów była determinowana przez ograniczoną ekstrakcję i w...

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Ogólnym celem tej procedury jest modyfikacja metalowych implantów w wielu skalach długości w celu kontrolowania zachowania komórek in vitro i in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie gradientu wielkości porów w trójwymiarowych implantach rurkowych, metodą ekstrakcji przez biofreeze. Drugim krokiem jest opracowanie nanofibrylarnych naśladowców błony podstawnej opartej na kolagenie i alginianach metodą warstwa po warstwie.Następnie opracowano pośrednią metodę monitorowania takich implantów po implantacji za pomocą analizy osocza krwi. HPLC i późniejsze sekwencjonowanie peptydów demonstruje się ostatecznie w postaci implantu, w którym różne obszary mogą w razie potrzeby pomieścić różne typy komórek. Dla niektórych tkanek wielokomórkowych można uzyskać Chociaż ten system może zapewnić sposób na modyfikację metalowych implantów.Może być również stosowany do systemów modeli 3D hodowli komórkowych, takich jak sztuczne tkanki lub modele chorób. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy znaleźć technikę kontrolowania ruchu komórek wokół porowatych implantów tytanowych in vivo. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść implanty oraz zaprojektuj i wyprodukuj formy teflonowe zgodnie z opisem w tekście pisemnym dotyczącym zamrażania i ekstrakcji.Przygotować syntetyczny roztwór polimerowy PLLA w dwuskładnikowej mieszaninie dioksyn i wody, wprowadzając proszek polimerowy do rozpuszczalnika organicznego. Na magnetycznym Starr podgrzej mieszaninę do 60 stopni Celsjusza w celu uzyskania jednorodnego roztworu. Temperatura ta została wybrana, ponieważ jest to górna granica odporności na temperaturę dla precyzyjnych szklanych strzykawek, które mają być używane do wprowadzania roztworu do implantów.W międzyczasie należy obliczyć objętość niezbędnego roztworu polimeru w stosunku do porowatości implantu, biorąc pod uwagę zmianę objętości zamrożonego roztworu. Następnie wprowadź roztwór do implantów za pomocą precyzyjnych szklanych strzykawek z dokładnością do 0,1 mikrolitra. Dolna granica stężenia polimeru wynosi 3% dla powtarzalnego tworzenia gradientu PO lub, gdy uzyskanie jednorodnego rozkładu w grubych próbkach powyżej 6% staje się trudne, zamrozić próbki bezpośrednio w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub z wcześniejszym okresem inkubacji wynoszącym 30 minut w temperaturze pokojowej.Warunki zamarzania częściowo determinują tworzenie się porów. W ten sposób warunki zamrażania można dostosować do docelowej porowatości. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Oddzielenie formy w stanie zamrożonym jest bardzo trudnym krokiem. Należy zachować ostrożność, aby zmniejszyć kontakt zamrożonego roztworu dennego z pleśnią, za pomocą skóry głowy, Zanurz implanty w 80% wstępnie schłodzonym etanolu, aby uzyskać gradienty porowatości. Użyj wstępnie schłodzonego skalpela, aby usunąć wszystkie części formy z wyjątkiem trzpienia, w przypadku implantów rurkowych i wszystkich części z wyjątkiem dolnej części w przypadku implantów w kształcie dysku, przeprowadź ekstrakcję w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc.Po ekstrakcji usuń pozostałe części formy i wysusz implanty na powietrzu. Do charakteryzowania ogólnej porowatości struktury. Konieczna jest analiza pulsoksymetru rtęciowego.W tym przykładzie pomiary pulsoksymetru rtęciowego pokazują wyraźne piki, które odpowiadają porom po obu stronach implantu i mniejszym porom rozproszonym. Jednak bardziej istotnymi danymi jest różnica między porowatością powierzchni śródświetlnych i pozaświetlnych, które można analizować za pomocą obrazu J pod kątem rozkładu wielkości porów. Po zamarzaniu próbek poprzez obserwację przekroju czynnego za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.Ze względu na otwarty porowaty charakter zastosowanych implantów i zdolność odbijania światła przez tytan, możliwe jest wykonanie stosów Z znakowanych komórek w porowatych implantach. Komórki znakowane PKH 26 lub wapniem AM można wykorzystać do wizualizacji implantów za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej w celu nagromadzenia wielu warstw. Najwyższą powtarzalność uzyskuje się za pomocą robotów zanurzających.Jeśli jednak robot zanurzający nie jest dostępny, czynności te można wykonać ręcznie. Aby przygotować roztwór kolagenu, użyj kolagenu klasy medycznej typu pierwszego i alginianu sodu. Zoptymalizowane stężenia wynoszą 0,5 grama na litr na każde 150 milimolowców.Bufor cytrynianu chlorku sodu o pH 3,8 rozpuść roztwór kolagenu przez noc, aby zapewnić jednorodność. Kwaśne pH roztworu 3,8 jest niezbędne do stabilnego tworzenia warstw, ponieważ struktura jest niestabilna. Przed sieciowaniem.W konstrukcji o neutralnym pH specjalny uchwyt do wykorzystania implantów z robotami zanurzeniowymi stosowanymi w produkcji wielowarstwowej polielektrolitu. Warstwy należy osadzić na powierzchni implantów zawierających tylko tytan lub implantów zmodyfikowanych zgodnie z opisem w tekście. Za pomocą systemu robota zanurzającego najpierw zanurz implanty w roztworze alginianu na 15 minut, a następnie przepłucz strukturę 150-milimolowym chlorkiem sodu o pH 3,8 przez pięć minut.Następnie zanurz w roztworze kolagenu na 15 minut. Aby najpierw ustabilizować błonę podstawną, przygotuj roztwór sieciujący o stężeniu 100 milimolowych genin. W buforze cytrynianu A-D-M-S-O w stosunku objętościowym od jednego do czterech rozpuść geninę w składniku DMSO, a następnie w składniku wodnym, aby uniknąć zbrylania się, sieciuj próbki przez zanurzenie w roztworze sieciującym między 12 a 24 godzinami później.Przepłukać dużą ilością buforu cytrynianowego o pH 3,8 Po umyciu etapów wysterylizować próbki za pomocą promieniowania UV przez 30 minut lub w kąpieli przeciwgrzybiczej z antybiotykiem. Głównymi parametrami decydującymi o jakości naśladownictwa membrany podstawnej są jej grubość i średnica włókien. Oblicz średnice włókien za pomocą mikroskopii sił atomowych lub obrazów FM uzyskanych w trybie kontaktowym.Po wysuszeniu próbek przepływem azotu, przed obrazowaniem należy określić ilościowo grubość co najmniej 10 włókien na obraz, aby określić średnią grubość włókien. Dzięki oprogramowaniu Image J po wysuszeniu 24-warstwowych wielowarstwowych folii kolagenowych z alginianu kolagenu, grubość folii można następnie określić za pomocą testów zarysowań. Używając najpierw FM, użyj igły strzykawki, aby zarysować folię po zlokalizowaniu zadrapania za pomocą mikroskopu świetlnego, uzyskaj obrazy z FM na powierzchniach o wymiarach 10 na 10 mikronów kwadratowych na granicy zadrapania.Oblicz wysokości z profili uzyskanych za pomocą oprogramowania A FM, które zapewnia grubość warstwy folii. Po wszczepieniu urządzenia do tchawicy królików zgodnie z opisem w tekście, należy pobrać próbki krwi z ich żył usznych, odwirować próbki z prędkością 5 000 obr./min przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyć supernatantu otrzymanego do analizy po ekstrakcji osocza królika 0,1% kwasem triorowym octowym.Przeprowadzić oczyszczanie HPLC z odwróconej fazy zawartości białka osocza poprzez oczyszczanie ekstraktu przy użyciu kolumny 305 C 18 z odwróconą fazą komórki jądra. Zapisać absorbancję przy 214 i 280 nanometrach przy użyciu systemu rozpuszczalnika i natężenia przepływu znajdujących się w protokole tekstowym. Zebrać frakcje pikowe przed ich zagęszczeniem przez odparowanie.Korzystając z szybkiej aplikacji próżniowej, ważne jest, aby zatrzymać próżnię prędkości przed całkowitym wyschnięciem. Skoreluj piki uzyskane w różnych punktach czasowych w trakcie okresu implantacji. Użyj oczyszczonych peptydów, które wykazują stałe tendencje w trakcie implantacji, do identyfikacji za pomocą automatycznego sekwencjonowania Edmonda.Załaduj próbkę do filtrów z włókna szklanego poddanych obróbce polimózgu, określ końcową sekwencję końcową oczyszczonych peptydów poprzez automatyczną degradację Edmonda przy użyciu profesjonalnego mikrosekwencera. Następnym krokiem jest identyfikacja fenylu i jednego aminokwasu za pomocą chromatografii na kolumnie C 18. Po uzyskaniu sekwencji można ją zidentyfikować za pomocą oprogramowania do obróbki strumieniowo-ściernej przy użyciu bazy danych Swiss Prote.Zmieniając stężenie roztworu PLLA, możliwe jest kontrolowanie wielkości porów po dodatkowej stronie świetlnej implantów. Na wielkość i kształt porów istotny wpływ miała obecność implantów tytanowych. Rozmiary porów wahały się od 40 do 100 mikrometrów, przy czym zastosowanie niższych stężeń skutkowało mniejszymi porami, podczas gdy wielkość porów po stronie śródświetlnej była regulowana przez ograniczoną ekstrakcję i wynosiła około dziewięciu mikronów, czyli mniej niż średnia wielkość fibroblastów.Dodając etap inkubacji w temperaturze pokojowej, można uzyskać podwójnie porowate struktury, w których ścianki porów większych porów mają swoją własną porowatość. Ta cecha jest ważna w przypadku grubych implantów, ponieważ ułatwi ruch gazów i składników odżywczych. Po utworzeniu gradientu porów możliwe jest dodanie warstwy filmu z alginianu kolagenu na wierzch struktury.Ta warstwa folii jest stabilna na wierzchu pianki PLLA i może być również utrzymywana na powierzchni w przypadku braku nanoskalowych włókien kolagenowych pianki. Wraz ze wzrostem warstwy folii wzrost folii jest wykładniczy. W ten sposób można uzyskać grubą warstwę o grubości kilkuset nanometrów.Porowate implanty tytanowe integrują się z tkanką gospodarza i są całkowicie wypełniane w ciągu czterech do sześciu tygodni in vivo, jak pokazano w przekrojach eksplantowanych implantów. Tkanka w porach jest dojrzałą tkanką łączną o dobrym poziomie unaczynienia. W tym okresie analiza HPLC wykazała wyraźne wartości szczytowe, które zmieniają się w czasie implantacji.Interesujące nas frakcje szczytowe zostały zsekwencjonowane i określone jako półłańcuchy hemoglobiny alfa i beta, które wykazały podobny trend z odczytami białka C-reaktywnego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć wieloskalowe gradienty PO 3D do modyfikacji implantów metalowych i eksperymentów z hodowlami komórkowymi.Ekstrakcja przez wymrażanie i warstwa przez tworzenie filmu to proste metale do opracowania własnych zmodyfikowanych implantów lub mikrośrodowisk dla komórek.

multi-scale-modification-metallic-implants-with-pore-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalicznych z gradientami porów, polielektrolitów i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje konstrukcję multipleksowego czujnika opartego na mikroiigłach. Urządzenie to jest opracowywane w celu prowadzenia pobierania próbek in situ oraz analizy elektrochemicznej wielu analitów w sposób szybki i selektywny. Przewidujemy zastosowanie tych czujników opartych na mikroigłach w medycynie klinicznej oraz badaniach biomedycznych.

Czujnik oparty na pustych mikroiğłach do multipleksowego transdermalanego detekcji elektrochemicznej

Tutaj opisujemy unikalną strategię tworzenia biokompatybilnych, warstwowych matryc z ciągłymi interfejsami między różnymi warstwami dla inżynierii tkankowej. Takie rusztowanie może zapewnić idealne, konfigurowalne środowisko do modulowania zachowania komórek za pomocą różnych sygnałów biologicznych, chemicznych lub...

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

Omówiono metodę, za pomocą której mechaniczne zachowanie in vivo materiałów reagujących na bodźce jest monitorowane w funkcji czasu. Próbki są badane ex vivo przy użyciu testera mikrorozciągania z kontrolą środowiska w celu symulacji środowiska fizjologicznego. Praca ta dodatkowo przyczynia się do zrozumienia zachowania naszego materiału in vivo.

Kontrolowane środowiskowo badania mikrorozciągalności mechanicznie adaptacyjnych nanokompozytów polimerowych do charakterystyki ex vivo

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Przedstawiono ulepszoną metodę mechanicznego testowania zakotwiczenia kości na powierzchniach potencjalnych implantów. Metoda ta pozwala na wyrównanie siły rozrywającej dokładnie prostopadle lub równolegle do płaszczyzny powierzchni implantu i zapewnia dokładny sposób kierowania sił zakłócających na dokładny obszar wokół implantu.

Ulepszona metoda badań mechanicznych do oceny zakotwiczenia implantu kostnego

Bioaktywne i mechanicznie niezawodne rusztowania metalowe zostały wyprodukowane metodą składającą się z dwóch procesów, dynamicznego odlewania zamrażalnego w celu wytworzenia porowatego Ti oraz powlekania i zagęszczenia rusztowań Ti. Proces zagęszczania jest prosty, skuteczny i ma zastosowanie do wytwarzania rusztowań o stopniu funkcjonalnym.

Produkcja mechanicznie przestrajalnych i bioaktywnych rusztowań metalowych do zastosowań biomedycznych

W tej pracy, rusztowania z poli(kwasu mlekowego)/glikolu polietylenowego (PLA/PEG) zostały przygotowane przy użyciu kombinacji mieszania stopionego i selektywnego ługowania. Omawiana tu metoda pozwoliła na opracowanie rusztowań trójwarstwowych poprzez ścisłą kontrolę zarówno porowatości, jak i wielkości porów. Właściwości mechaniczne oceniano również w środowisku fizjologicznym.

Łatwa i przyjazna dla środowiska metoda wytwarzania rusztowań z poli(kwasu mlekowego) o stopniowanej wielkości porów

Ten protokół opisuje strategię produkcji opartą na rozwiązaniach dla wysokowydajnych, elastycznych, przezroczystych elektrod z w pełni wbudowaną, grubą metalową siatką. Elastyczne przezroczyste elektrody wytwarzane w tym procesie wykazują jedne z najwyższych zgłoszonych parametrów, w tym bardzo niską rezystancję arkusza, wysoką przepuszczalność optyczną, stabilność mechaniczną przy zginaniu, silną przyczepność podłoża, gładkość powierzchni i stabilność środowiskową.

Skalowalna strategia produkcji oparta na roztworze dla wysokowydajnych, elastycznych i przezroczystych elektrod z wbudowaną metalową siatką

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Obecny protokół opisuje narzędzia do obsługi mikroelektrod wewnętrznych z krzemu podczas zabiegów modyfikacji powierzchni poprzez osadzanie gazu i reakcje roztworu wodnego. Szczegółowo wyjaśniono montaż komponentów używanych do obsługi urządzeń podczas całej procedury.

Narzędzia do obróbki powierzchniowej krzemowych płaskich mikroelektrod wewnątrzkorowych

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Poznaj techniki modyfikacji metalowych implantów z gradientami porów i nanowłóknistymi naśladowcami błony podstawnej z kolagenu i alginianu. Metoda umożliwia kontrolę migracji komórek in vitro i in vivo oraz pośrednie monitorowanie integracji implantów poprzez analizę osocza krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Przeglądaj więcej filmów