Name: Jednominutowa, sub-jednowatowa fototermiczna ablacja guza przy użyciu porfisomów, wewnętrznych wielofunkcyjnych nanopęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj syntezę porfisomów metodą ekstruzji wysokociśnieniowej oraz ich zastosowanie w fototermalnej terapii guzów. Badanie wykazało 100% przeżywalność zwierząt i całkowitą eliminację nowotworów bez nawrotów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Szpitala Księżniczki Małgorzaty, Narodową Radę Badań Naukowych i Inżynieryjnych Kanady, Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem, Kanadyjską Fundację Innowacji, oraz Joey and Toby Tanenbaum/Brazilian Ball Chair in Prostate Cancer Research, grant od SUNY Research Foundation i wsparcie startupów z University at Buffalo.

1. Synteza pirofioforbidu-lipidu
<ol>
	<li>Połączyć 200 mmol pyropheoforbidu (przygotowanego z alg Spirulina Pacifica zgodnie z wcześniejszym opisem; Zheng et al., Bioconj. Chem., 2002, 13-392)4, 98,7 mg 16:0 lizofosfatydylocholiny (1-palmitylo-2-hydroksy-sn-glycero-3-fosfocholina, Avanti Polar Lipids #855675), 76,3 mg EDC oraz 48,7 mg DMAP (4-(dimetylamino)pirydyny) w 5 ml chloroformu stabilizowanego amylenem, aby uzyskać stosunek 1:1:2:2 Pyro:Lipid:EDC:DMPA.</li>
	<li>Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej pod osłoną argonu przez 24 hr. Odparować chloroform pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą rotacyjnego odparowacza w temperaturze 40 °C. W wyniku reakcji powstaje mieszanina izomerów pyro-lipidów (pyro przyłączony w pozycji sn-1 lub sn-2).</li>
	<li>Resuspendować mieszaninę izomerów pyro-lipidów w 1 mM CaCl2, 50 mM Tris (pH 8), 0,5% Triton X-100 i 10% metanolu do stężenia 5 mg/ml. Dodać fosfolipazę A2 (PLA2) z jadu pszczeli w stężeniu 0,1 mg/ml i inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 24 hr w celu strawienia pyro-lipidu w pozycji sn-1 i otrzymania czystego izomeru pyro-lipidu w pozycji sn-2.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 2 objętości chloroformu i 1,25 objętości metanolu, przeprowadzić ekstrakcję, a następnie usunąć rozpuszczalnik za pomocą odparowania rotacyjnego pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40 °C. Resuspendować produkt rozszczepienia w 1% MeOH w DCM i oczyścić na małej kolumnie krzemionkowej z diolem, aby otrzymać izomerycznie czysty pyro-lipid.</li>
</ol>
2. Przygotowanie porfysomów
<ol>
	<li>Rozpuść oddzielnie pyropheoforbid-lipid, distearoylo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę-N-metoksy (glikol polietylenowy) (PEG-2000-PE) oraz cholesterol w chloroformie i zapisz ich odpowiednie stężenia.</li>
	<li>Przygotuj film lipidowy porfizomów w borokrzemowej probówce 12x75 mm o całkowitej masie lipidów 5 mg/probówkę, łącząc 65% mol porfiryny-lipidowej, 5% mol PEG-2000-PE i 30% mol cholesterolu.</li>
	<li>Osusz filmy lipidowe strumieniem gazu azotowego, a następnie pozostaw do dalszego wysuszenia w próżni przez 1 hr. Filmy lipidowe przechowuj w temperaturze -20 °C w atmosferze argonu do czasu późniejszej hydratacji i ekstruzji.</li>
	<li>Do każdej probówki z filmem lipidowym dodaj 1 ml soli fosforanowej w roztworze buforowanym (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM fosforanu, pH 7.4). Zamroź probówkę w ciekłym azocie aż do całkowitego zamrożenia, a następnie rozmroź ją w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C, aż próbka całkowicie się rozpuści. Wymieszaj probówkę w wstrząsarku typu vortex przez łącznie 30 sec (3x po 10 sec, z 5-sekundowym ponownym podgrzaniem w kąpieli wodnej 65 °C pomiędzy każdym cyklem mieszania).</li>
	<li>Powtórz cykle zamrażania i rozmrażania przez 5 lub więcej cykli, jeśli jest to konieczne, aż w uwodnionym roztworze nie będą widoczne duże agregaty. Po zakończeniu pozostaw zawiesinę porfizomów na lodzie.</li>
	<li>Złóż ekstruder wysokociśnieniowy (10 ml) z zainstalowanymi dwoma ułożonymi jeden na drugim filtrami z poliwęglanu o rozmiarze 100 nm. Podłącz ekstruder z termobarierą do termostatowanego cyrkulatora z kąpielą wodną o temperaturze 65 °C oraz podłącz system ekstruzji do butli z azotem w celu zapewnienia wysokiego ciśnienia.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę porfizomów do komory ekstrudera za pomocą 9-calowej szklanej pipety transferowej. Ustaw ciśnienie, obracając pokrętłem regulatora butli z azotem, aż odczyt początkowego ciśnienia ekstruzji wyniesie od 200 do 300 psig. Stopniowo otwieraj zawór regulatora ciśnienia, aż zostanie osiągnięta wystarczająca szybkość przepływu porfizomów lub maksymalne ciśnienie 800 psig (5,440 kPa).</li>
	<li>Po zakończeniu pierwszej przebiegu ekstruzji zamknij zawór sterujący ciśnieniem i zwolnij ciśnienie z ekstrudera, otwierając zawór upustowy na górnej części urządzenia. Ponownie napełnij ekstruder świeżo ekstrudowanym roztworem porfizomów i powtórz proces ekstruzji co najmniej 10 razy, aby zapewnić jednorodność końcowego roztworu.</li>
	<li>Wyznacz stężenie końcowego roztworu porfizomów, mierząc absorbancję rozcieńczonej próbki w metanolu za pomocą spektrometru UV-Vis. Oblicz stężenie, korzystając z następującego równania, przyjmując współczynnik ekstynkcji 97,000 M-1cm-1 przy 410 nm dla pyropheoforbidu-lipidowego.</li>
</ol>
<img alt="Wzór spektroskopowy: Obliczanie stężenia na podstawie absorbancji i współczynnika ekstynkcji." src="/files/ftp_upload/50536/50536eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
<ol start="10">
	<li>Zmierz końcowy rozkład wielkości porfizomów za pomocą urządzenia Malvern Zetasizer ZS90, wykorzystując dynamiczne rozpraszanie światła. Rozcieńcz roztwór porfizomów w PBS i przeprowadź trzy pomiary, po 15 cykli każdy, aby uzyskać wyniki uśrednione.</li>
	<li>Wyznacz wygaszanie fluorescencji porfizomów, porównując emisję fluorescencyjną wygaszonych porfizomów (1 mM w PBS) i niewygaszonych porfizomów (1 mM w 1% Triton X-100) za pomocą spektrofluorometru. Zbierz widma przed i po dodaniu detergentu (Triton X-100), a następnie znormalizuj odczyt sygnału do maksymalnej fluorescencji. Ustaw długość fali wzbudzenia na 410 nm, a zakres długości fali emisji na 600-800 nm.</li>
	<li>Przechowuj roztwór porfizomów pod argonem w temperaturze 4 °C do czasu kolejnego użycia, chroniąc go przed światłem za pomocą folii aluminiowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie modelu ksenoprzeszczepu zwierzęcego
<ol>
	<li>Hodować komórki KB w pośrodku RPMI-1640 (z 10% FBS), utrzymując komórki w atmosferze 5% CO2 i wysokiej wilgotności w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać komórki KB, stosując standardową technikę hodowli komórkowych. Zawiesinę komórkową (20 000 cells/ml) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) przechowywać w lodzie do momentu wstrzyknięcia.</li>
	<li>Przygotować ksenoprzeszczepy KB u myszy nago. Myszy nago nabyto z Charles River Laboratories w momencie osiągnięcia masy 20 g (Category# Crl:NU(NCr)-Foxn1nu, wiek 6-7 tygodni), stosując standardową dietę i ściółkę (Harlan Laboratories; Diet: Irradiated LM-485, #7912; Bedding: Corncob bedding, ¼”, #7097). Przed eksperymentami wysterylizować wszystkie narzędzia do obsługi zwierząt (strzykawki, pęsety i podkładki dla zwierząt). Myszy znieczulić 2% izofluranem v/v w nośniku w postaci 100% tlenu. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt (w tym przypadku University Health Network).</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie komórki nowotworowe zawieszone w PBS w prawy bok myszy. Myszy są gotowe do użycia po 10 dniach, gdy guz osiągnie średnicę 4-5 mm i grubość 2-3 mm.</li>
</ol>
4. Terapia fototermiczna in vivo
<ol>
	<li>Wstrzyknąć porfyzomy (zawierające 750 nmol pyro w objętości 200 µl) dożylnie przez żyłę ogonową. Naświetlanie laserem przeprowadzić 24 h po wstrzyknięciu porfyzomów.</li>
	<li>W tej sekcji wszystkie procedury należy przeprowadzać w zamkniętym pomieszczeniu bezpiecznym dla pracy z laserem. Podczas naświetlania laserowego należy nosić okulary ochronne do laserów.</li>
	<li>Przygotować sprzęt do naświetlania laserowego. Włókno laserowe oraz dyfuzor zamocować za pomocą zacisku na statywie. Ustawić niską moc lasera i włączyć urządzenie. Dostosować wysokość włókna laserowego, aby uzyskać obszar naświetlania o średnicy 9 mm (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canada), skalibrować moc lasera do 750 mW (1.18 W/cm2) za pomocą miernika mocy, a następnie wyłączyć laser w celu przygotowania zwierząt.</li>
	<li>Zanestetyzować zwierzęta, podając 2% izofluranu v/v w 100% tlenie jako gazie nośnym przez stożek nosowy (bez systemu odsysania oparów izofluranu, który stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzi). Potwierdzić dostateczną głębokość anestezji, wykonując uciśnięcie palców tylnych łap pęsetą lub palcami. Zwierzęta są gotowe do naświetlania laserem, gdy nie wykazują reakcji na tę procedurę.</li>
	<li>Monitorować temperaturę guza za pomocą podczerwiennej kamery termowizyjnej (Mikroshot, LUMASENSE Technologies). Umieścić kamerę blisko guza, odpowiednio ją ustawić i wykonać obraz przed PTT, a także zwykły obraz w świetle białym przed rozpoczęciem naświetlania PTT.</li>
	<li>Ponownie włączyć laser i zwiększyć moc światła do 750 mW. Upozycjonować guz w centrum wiązki lasera tak, aby był w pełni pokryty, a następnie rozpocząć odliczanie czasu naświetlania. Wykonywać obrazy temperatury guza co 5 s podczas jednominutowej terapii laserowej. Wyłączyć laser po 1 min. Przerwać podawanie 2% izofluranu, odczekać do wybudzenia się zwierzęcia z anestezji i umieścić je z powrotem w klatce.</li>
	<li>Przechowywać myszy w pomieszczeniu z normotermią, w cyklu 12:12 h ciemności i światła, zgodnie z protokołami dotyczącymi zwierząt zatwierdzonymi przez University Health Network. Wstrzyknąć buprenorfinię (0.05 mg/kg, podskórnie dwa razy dziennie przez tydzień po naświetlaniu laserowym), aby zmniejszyć ból spowodowany blizną. Co dwa dni mierzyć średnicę guza za pomocą suwmiarki i wykonać zdjęcie. Obliczyć objętość guza, stosując następujący wzór: V=π/6 · a · b2, gdzie a to średnica długa, a b to średnica krótka.</li>
	<li>Uśmiercić zwierzęta, umieszczając je w komorze z CO2, gdy długa średnica guza osiągnie 10 mm, co stanowi zdefiniowany punkt końcowy w naszym laboratorium. Po zastosowaniu CO2 wykonać zwichnięcie karku. Wykreślić krzywą przeżywalności.</li>
</ol>

<ol><li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+regioselection+for+the+synthesis+and+biodegradation+of+porphysome+nanovesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic regioselection for the synthesis and biodegradation of porphysome nanovesicles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 51, 2429-2433 (2012).</li>
<li>Liu, T. W., MacDonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Copper-64-Labeled+Organic+Nanoparticles+as+Radiotracers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Copper-64-Labeled Organic Nanoparticles as Radiotracers.</a> Angewandte Chemie. , (2012).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+reconstituted+by+pyropheophorbide+cholesteryl+oleate+as+target-specific+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer.</a> Bioconjug Chem. 13, 392-396 (2002).</li>
<li>Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+delivery+of+photosensitising+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomal delivery of photosensitising agents.</a> Expert Opin Drug Deliv. 2, 477-487 (2005).</li>
<li>Jin, C. S., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+nanostructures+for+photosensitizer+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Liposomal nanostructures for photosensitizer delivery.</a> Lasers Surg Med. 43, 734-748 (2011).</li>
<li>Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+liposomes+of+defined+size+distribution+by+extrusion+through+polycarbonate+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 557, 9-23 (1979).</li>
<li>Berger, N., Sachse, A., Bender, J., Schubert, R., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter+extrusion+of+liposomes+using+different+devices%3A+comparison+of+liposome+size%2C+encapsulation+efficiency%2C+and+process+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Filter extrusion of liposomes using different devices: comparison of liposome size, encapsulation efficiency, and process characteristics.</a> Int J Pharm. 223, 55-68 (2001).</li>
<li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+technologies+and+analytical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem+%28Palo+Alto+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Liposomes: technologies and analytical applications.</a> Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 1, 801-832 (2008).</li>
<li>Lapinski, M. M., Castro-Forero, A., Greiner, A. J., Ofoli, R. Y., Blanchard, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+liposomes+formed+by+sonication+and+extrusion%3A+rotational+and+translational+diffusion+of+an+embedded+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore.</a> Langmuir. 23, 11677-11683 (2007).</li>
<li>Liu, D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+Homogeneity+of+a+Liposome+Preparation+is+Crucial+for+Liposome+Biodistribution+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liposome+Research%22%5BJournal%5D)">Size Homogeneity of a Liposome Preparation is Crucial for Liposome Biodistribution In Vivo.</a> Journal of Liposome Research. 2, 57-66 (1992).</li>
<li>Zhang, Y., Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrins+as+Theranostic+Agents+from+Prehistoric+to+Modern+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Porphyrins as Theranostic Agents from Prehistoric to Modern Times.</a> Theranostics. 2, 905-915 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W ramach rozwoju technologii dostarczania leków, wielofunkcyjne nanocząstki są obecnie przedmiotem szeroko zakrojonych badań w celu dokładnego śledzenia pojazdu dostarczającego lek przy jednoczesnym utrzymaniu dużej ładowności leku. Liposomy obciążone porfiryną zostały opracowane w celu uzyskania lepszych właściwości farmakokinetycznych i bardziej wydajnego dostarczania niż bezpośrednie podawanie porfiryny, ale istnieją przeszkody, w tym ograniczona ilość porfiryny i szybka redystrybucja porfiryny z liposomów do białek o...

Porfisomy to nowe, wielofunkcyjne nanopęcherzyki, które niedawno opracowaliśmy, zdolne do multimodalnego obrazowania i terapii1. Są one zbudowane z samoorganizujących się dwuwarstw porfiryny i zawierają niezwykle wysoką gęstość porfiryny (ponad 83 000 cząstek porfizonu), co generuje duży współczynnik ekstynkcji i skutkuje unikalnym, zależnym od struktury samowygaszaniem fluorescencji. Porfisomy mają dobre właściwości farmakokinetyczne i biodystrybucyjne in vivo: wykazują okres półtrwania krwi wynoszący 12 godzin po systematycznym podawaniu i biernie kumulują się w guzach ksenoprzeszczepu z 7,5% ID/g po 24 godzinach po wstrzyknięciu2.
Ich unikalna struktura i właściwości fizykochemiczne sprawiają, że porfiom jest dobrym kandydatem do obrazowania multimodalnego i terapii sterowanej obrazem. Przede wszystkim, zawierające porfirynę, porfisomy są wewnętrznie odpowiednie do obrazowania fluorescencyjnego guzów po akumulacji guza1. Ponadto każda porfiryna ma stabilne miejsce chelatacji izotopów promieniotwórczych, dlatego porfisomy można łatwo znakować radioizotopami, takimi jak 64Cu do obrazowania PET3. Co więcej, pochłonięta energia świetlna jest rozpraszana termicznie pod wpływem naświetlania laserowego, gdy struktura porfisomu jest nienaruszona, dzięki czemu porfisomy wykazują również unikalne możliwości obrazowania fotoakustycznego i PTT. Wykazano, że po 24 godzinach od dożylnego wstrzyknięcia porfisomów, naświetlanie laserowe guza nagromadzonego przez porfisom wywołało gwałtowny wzrost temperatury i silną fototermiczną ablację guza. Wykazano w ten sposób, że porfisomy są skutecznymi wzmacniaczami fototermicznymi o współczynniku ekstynkcji tak wysokim, jak nanocząstki złota (AuNPs)1. Z drugiej strony, w porównaniu z innymi nieorganicznymi środkami fototermicznymi, w tym AuNPs, porfisomy wykazują wyjątkową przewagę w zakresie bezpieczeństwa biologicznego ze względu na swój organiczny charakter. Porfisomy ulegają biodegradacji enzymatycznej i wywołują minimalną ostrą toksyczność u myszy po podaniu dożylnym w dawkach sięgających 1000 mg/kg1. Ponadto, podobnie jak w przypadku liposomów, duży wodny rdzeń porfisomów może być biernie lub aktywnie obciążony środkami terapeutycznymi lub obrazującymi. Właściwości optyczne i biokompatybilność porfisomów wskazują na multimodalny potencjał nanocząstek organicznych w obrazowaniu i terapii biofotonicznej.
W tym artykule przedstawiamy metodę syntezy koniugatów pirofeoforbidowo-lipidowych, wytwarzanie i charakteryzację porfisomów za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem. In vivo (in vivo) Przeprowadza się również PTT na myszach w celu wykazania skuteczności PTT z wykorzystaniem porfisomu w leczeniu nowotworów przy użyciu podskórnego modelu guza ksenoprzeszczepu.

<table><tbody><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Thermo-Savant</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Votex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Numer modelu: G560</td></tr><tr><td>Wytłaczarka wysokociśnieniowa</td><td>LIPEX, Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>10 ml Wytłaczarka Thermobarrel</td></tr><tr><td>Cyrkulatory z podgrzewaną kąpielą (cyrkulator termostatyczny)</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>SC100-S5P</td><td></td></tr><tr><td>Filtry poliwęglanowe </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>Wielkość porów 100 nm i średnica membrany 19 mm</td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofototmetr UV/widzialny</td><td>Varian Australia</td><td>Spektrofotometr Cary 50 Bio UV / widzialnym</td> Spektrofluorometr HORIBA Scientific FluoroMax-4 Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)Hitachi H-7000 Inkubator kultur komórkowych SANYO MCO-18AIC Miernik mocy Thorlabs PM100D z czujnikiem S142C 671nm Laser LaserGlow Technologies <td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>LRS-0671_PFN-02000-05</td><td>S/N:10097270</td></tr><tr><td>Termometr na podczerwień</td><td>Mikroshot, LUMASENSE Technologies</td><td>9102409</td><td></td></tr><tr><td>Laserowe gogle ochronne</td><td>LaserGlow Technologies</td><td>AGF6602XX</td><td>Gęstość optyczna: 1,5+ przy 630-700 nm</td></tr></tbody></table>

jednominutowa, sub-jednowatowa fototermiczna ablacja guza przy użyciu porfisomów, wewnętrznych wielofunkcyjnych nanopęcherzyków

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

Niedawno opracowaliśmy porfisomy jako wewnętrznie wielofunkcyjne nanopęcherzyki. Fotouczulacz, pirofeoforbid α, został sprzężony z fosfolipidem, a następnie samoorganizujący się w liposomowe kuliste pęcherzyki. Ze względu na niezwykle wysoką gęstość porfiryny w dwuwarstwie porfirynowo-lipidowej, porfisomy generowały duże współczynniki ekstynkcji, zależne od struktury samowygaszanie fluorescencji i doskonałą skuteczność fototermiczną. W naszym preparacie porfisomy zostały zsyntetyzowane przy użyciu wytłaczania pod wysokim ciśnieniem i wykazały średnią wielkość cząstek około 120 nm. Dwadzieścia cztery godziny po dożylnym wstrzyknięciu porfisomów, lokalna temperatura guza gwałtownie wzrosła z 30 °C do 62 °C po jednej minucie ekspozycji na 750 mW (1,18 W/cm2), 671 nm naświetlanie laserowe. Po całkowitej ablacji termicznej guza utworzyły się strupy i zagoiły się w ciągu 2 tygodni, podczas gdy w grupach kontrolnych guzy nadal rosły i wszystkie osiągnęły określony punkt końcowy w ciągu 3 tygodni. Dane te pokazują, w jaki sposób porfisomy mogą być stosowane jako silne środki terapii fototermicznej (PTT).

Pyrofioforbida jest sprzężona z fosfolipidem w formie stabilnego monomeru lipidowego (Rysunek 1a), a koniugaty samoorganizują się w porfizomy metodą ekstruzji błonowej przy użyciu ekstrudera wysokociśnieniowego. Zazwyczaj podczas pierwszych trzech cykli ekstruzji trudno jest przeprowadzić zawiesinę porfizomowo-lipidową ze względu na stosunkowo wolną prędkość przepływu. W miarę powtarzania kolejnych ekstruzji prędkość przepływu ekstrudowanego roztworu stopniowo wzrasta, a ciśnienie można w razie potrzeby ...

Opracowaliśmy nowe, wielofunkcyjne nanopęcherzyki zwane porfisomami, które mają zależne od struktury samowygaszanie fluorescencji i unikalne właściwości fototermiczne, dzięki czemu działają jako silne środki terapii fototermicznej. Opracowaliśmy porfisomy za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem i zbadaliśmy ich skuteczność terapii fototermicznej w modelu guza ksenoprzeszczepu.

Jednominutowa, sub-jednowatowa fototermiczna ablacja guza przy użyciu porfisomów, wewnętrznych wielofunkcyjnych nanopęcherzyków

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie syntezy porfoursomów z wykorzystaniem ekstrudera wysokociśnieniowego oraz efektywności terapii fototermicznej opartej na porfoursomach w leczeniu guzów w podskórnym modelu ksenoprzeszczepu. Osiąga się to poprzez koniugację pyro four by alpha z fosfolipidami w celu utworzenia pyro feel four by lipid; w drugim etapie pyro four by lipids samoorganizują się w porfoursomy poprzez ekstruzję wysokociśnieniową, a następnie poddawane są charakterystyce w ramach kontroli jakości. Następnie porfivesomy wstrzykuje się zwierzętom z guzami podskórnymi, aby wykazać ich skuteczność w terapii fototermicznej. Po naświetlaniu laserem wyniki pokazują, że porfivesomy są nanocząsteczkami o wysokiej homogeniczności i silnie wygaszonej fluorescencji oraz że porfivesomy stanowią potężny czynnik fototermiczny, co potwierdza 100% wskaźnik przeżywalności w badaniu in vivo na zwierzętach.Poryfosomy są pierwszymi organicznymi nanocząsteczkami, które służą jako wydajne wzmacniacze fototermalne, zachowując jednocześnie zdolność do ładowania leków i biozgodność konwencjonalnych liposomów, a także są odpowiednie do obrazowania multimodalnego i terapii sterowanej obrazem. Zastosowania tej techniki rozciągają się zatem na terapię i diagnostykę nowotworów. Przed rozpoczęciem tej procedury, poryfosomy lipidowe zostały wcześniej zsyntetyzowane zgodnie z protokołem tekstowym.Rozpuść oddzielnie pyro four, lipid poli(glikol etylenowy) oraz cholesterol w chloroformie. Zapisz stężenia każdego z roztworów w dygestorium w temperaturze pokojowej. Przygotuj liposomy por four w probówce borokrzemowej, przyjmując całkowitą masę lipidów wynoszącą 5 mg na probówkę.Połącz porfirynowy lipid PEG 2000 PE oraz cholesterol w ułamkowych stężeniach molowych odpowiednio 65%, 5% i 30%. Następnie krótko osusz filmy lipidowe strumieniem gazu azotowego, a potem poddaj je działaniu próżni przez godzinę. Filmy lipidowe można teraz przechowywać w temperaturze -20 °C w atmosferze argonu do późniejszej hydratacji i ekstruzji.Aby rozpocząć hydratację i ekstruzję, dodając 1 ml PBS do każdej probówki z filmy lipidową, zamrozić całkowicie każdą probówkę w ciekłym azocie. Następnie rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, gdy przestaną być zamrożone. Każdą probówkę wymieszać w wirówce typu vortex trzy razy po 10 s, z pięciosekundowym ponownym podgrzaniem w łaźni pomiędzy kolejnymi cyklami mieszania.Powtórz cykle zamrażania, rozmrażania i mieszania w wortexie pięć lub więcej razy, aż w uwodnionym roztworze nie będą widoczne duże agregaty. Na koniec pozostaw zawiesinę porów na lodzie. Następnie przygotuj ekstruder wysokociśnieniowy o pojemności 10 ml z dwoma nałożonymi na siebie filtrami poliwęglanowymi o rozmiarze porów 100 nm.Podłącz ekstruder do regulowanej łaźni wodnej z cyrkulacją w temperaturze 65 °C. Następnie podłącz system ekstrudera do butli z azotem w celu zapewnienia odpowiedniego ciśnienia. Teraz za pomocą dziewięciocalowej pipety szklanej przenieś zawiesinę do komory ekstrudera.Ustaw początkowe ciśnienie ekstruzji w zakresie od 200 do 300 PSIG. Następnie stopniowo otwieraj zawór, aż do uzyskania wystarczającego przepływu porowatego. Po pierwszym przejściu ekstruzji nie stosuj ciśnienia przekraczającego 800 PSIG.Zamknij zawór sterujący ciśnieniem i otwórz zawór bezpieczeństwa. Ponownie napełnij ekstruder świeżym roztworem i powtórz ten proces co najmniej 10 razy, aby upewnić się, że końcowy ekstrudowany roztwór jest całkowicie homogeniczny. Określ stężenie końcowego roztworu por foursome, mierząc absorbancję rozcieńczonej próbki w metanolu przy użyciu spektrometru UV-Vis.Następnie rozcieńczyć roztwór por foursome w PBS w stosunku 1:60. Następnie przeprowadzić trzy pomiary rozkładu por foursome za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Wykonać 15 niezależnych serii pomiarowych i obliczyć średnią z wyników.Na koniec zdiagnozuj wygaszanie fluorescencji por foursome, porównując emisję fluorescencji wygaszonego PHY w stężeniu 1 mM w PBS z emisją niewygaszonego por fivesome w stężeniu 1 mM w 1% Triton X 100. Przechowuj roztwór por foursome w ciemności, owinięty folią i w atmosferze argonu, w temperaturze 4 °C. Hoduj komórki KB w pożywce RPMI 1640 z 10% FBS, a następnie zbierz komórki KB w stężeniu 20 000 komórek/ml w PBS i utrzymuj je w lodzie. Znieczulonej izofluranem myszy nagojowej o masie 20 g wstrzyknij podskórnie 100 µL zawiesiny komórek w prawy bok.Po 10 dniach powstały guz będzie miał od kilku do kilkunastu milimetrów średnicy i będzie gotowy do leczenia. Rozpocznij leczenie, wstrzykując 750 nanomoli porfirsomów do żyły ogonowej. Po 24 godzinach przeprowadź naświetlanie laserowe porfirsomów w zamkniętym pomieszczeniu bezpieczeństwa laserowego, nosząc okulary ochronne do laserów; światłowód laserowy oraz dyfuzor powinny być zamocowane na statywie.Ustaw moc lasera na niskim poziomie i włącz laser. Dostosuj wysokość włókna laserowego, aby uzyskać obszar naświetlania o średnicy 9 mm. Użyj miernika mocy, aby skalibrować moc lasera do 750 mW, co odpowiada 1,18 W/cm².Następnie wyłącz laser, znieczulając zwierzę gazem izofluranowym. Gdy zwierzę przestanie reagować na uciśnięcie palca, udokumentuj temperaturę guza za pomocą precyzyjnie ustawionej podczerwonej kamery termowizyjnej. Wykonaj obraz przed PTT oraz zwykły obraz w świetle białym.Następnie ustaw moc lasera na 750 milliwatts. Umieść guz w centrum wiązki lasera na jedną minutę i mierz temperaturę guza co pięć sekund. Po minucie wyłącz laser, zaprzestań podawania gazu isof fluorine i poczekaj, aż zwierzę wybudzi się z anestezji, przed powrotem do klatki.W dalszej kolejności, co dwa dni, należy fotografować guza i mierzyć jego średnicę za pomocą suwmiarki. Gdy średnica osiągnie 10 mm, zwierzę należy poddać humanitarnej eutanazji. Stosując ten protokół, pyro four bide sprzęgnięto z fosfolipidami, tworząc stabilny monomer lipidowy, a następnie poddano procesowi samoorganizacji w celu utworzenia por foursomes za pomocą ekstruzji wysokociśnieniowej.Otrzymane czwórki porfiryn będą charakteryzować się wysoką jednorodnością rozkładu wielkości z pikiem w okolicach 120 nanometrów. Wykazują one również dwa główne piki absorbancji przy 410 nanometrach i 677 nanometrach. Fluorescencja porfiryny została wygaszona aż w 99,8% w przypadku nienaruszonej nanostruktury.Stosując opisany protokół PTT in vivo, naświetlanie laserem grup czterech spowodowało wzrost temperatury guza o ponad 35°C po jednej minucie naświetlania. W tym czasie sam laser wywołał wzrost temperatury o mniej niż 10°C. Po naświetlaniu PTT guzy zazwyczaj stawały się białawe ze względu na silny efekt termiczny.Ablacja termiczna spowodowała powstanie ciemnobrązowego strupa na guzach oraz 100% redukcję ich objętości. Blizny ES były wyraźne 24 godziny po zabiegu i stopniowo regenerowały się w ciągu kolejnych dwóch tygodni. Dzięki zastosowaniu czterech grup, guzy podskórne zostały całkowicie wyeliminowane bez nawrotów.Dla porównania, guzy, w których wstrzyknięto sam ssom lub które poddano wyłącznie naświetlaniu laserowemu, nadal rosły. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak syntetyzować pryzmaty por przy użyciu ekstrudera wysokociśnieniowego oraz jak przeprowadzić naświetlanie laserowe po podaniu roone w ramach terapii fototermalnej.

one-minute-sub-one-watt-photothermal-tumor-ablation-using-porphysomes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Jeden minut, sub-jedno-watowe fototermiczne usuwanie guzów przy użyciu porfisomów, wrodzonych wielofunkcyjnych nanowezykuł

Insonacja mikropęcherzyków jest obiecującą strategią ablacji guzów przy zredukowanej średniej mocy akustycznej, a także ukierunkowanego dostarczania leków. Celem niniejszego badania jest opracowanie strategii impulsowania ultradźwiękami o niskim cyklu pracy oraz nanonośników w celu maksymalizacji nietermicznej ablacji mikro naczyniowej i dostarczania ładunku do podskórnych glejaków C6.

Porównanie ukierunkowanego leczenia glejaków u myszy z wykorzystaniem ultradźwięków poprzez dostarczanie nanocząsteczek z lekiem oraz ablację mikro naczyniową

Nanoemulsje przesunięcia fazowego (PSNE) mogą być waporyzowane przy użyciu wysokointensywnego skupionego ultradźwięku w celu wzmocnienia lokalnego ogrzewania i poprawy ablacji termicznej w guzach. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie stabilnych PSNE o wąskim rozkładzie wielkości. Ponadto zademonstrowano wpływ waporyzowanych PSNE na ablację indukowaną ultradźwiękami w fantomach imitujących tkankę.

Synteza nanoemulsji przesunięcia fazowego o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej waporyzacji kropli i ablacji wspomaganej ultradźwiękami z wykorzystaniem pęcherzyków

AN został opracowany specjalnie zaprojektowany laserowy aparat grzewczy kompatybilny z MRI, aby zapewnić miejscowe ogrzewanie guzów podskórnych w celu aktywacji uwalniania czynników z termoczułych liposomów, szczególnie w obszarze guza.

Specjalnie zaprojektowane laserowe urządzenie grzewcze do wyzwalanego uwalniania cisplatyny z termoczułych liposomów z prowadzeniem obrazu rezonansu magnetycznego

Ten protokół demonstruje kontrolowane zarodkowanie kawitacji w fantomach żelowych, poprzez jednoczesną ekspozycję zarówno na pulsacyjne światło laserowe bliskiej podczerwieni, jak i skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU). Aktywność kawitacyjna może być następnie wykorzystana do poprawy obrazowania i/lub zastosowań terapeutycznych HIFU.

Kontrolowane zarodkowanie kawitacji z nanocząstek plazmonicznego złota w celu wzmocnienia zastosowań ultradźwięków o wysokiej intensywności

Prezentowany tutaj jest protokół wytwarzania mikropęcherzyków z nanocząsteczkami tlenku żelaza (NSM) poprzez samoorganizację, synergię reakcji magnetycznej, akustycznej i optycznej w jednej nanoterapeutycznej platformie do hipertermii magnetycznej i fototermicznej terapii przeciwnowotworowej.

Mikropęcherzyki reagujące na magnesy, akustycznie i optycznie do hipertermii magnetycznej i potototermicznej skojarzonej terapii nowotworów

Ten artykuł przedstawia protokół przygotowania fantomów tkanki nowotworowej, które replikują właściwości optyczne dla plazmonicznej terapii fototermicznej. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie fantomowe, oceny fototermiczne i walidację opracowanego modelu numerycznego opartego na pomiarach temperatury fototermicznej w celu oceny parametrów terapeutycznych, oferując etyczną, opłacalną alternatywę dla badań in vivo do wstępnych testów.

Plazmoniczna terapia raka fototermicznego: Fantomy naśladujące tkankę nowotworową osadzone w nanocząstkach do wizualizacji fototermicznego rozkładu temperatury

W protokole tym przedstawiono techniki i metodologię niezbędne do celowanej terapii hipertermicznej w modelach guzów litych. Podejście to wykorzystuje fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni przez wstrzykiwane domięśniowo złote nanopręty w celu wywołania miejscowego ogrzewania w mikrośrodowisku guza.

Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

Opisano metodę obrazowania preparatów z resekcji płuc ex vivo za pomocą obrazowania w dziedzinie częstotliwości optycznych (OFDI) oraz uzyskiwania precyzyjnej korelacji z histologią, co jest niezbędne do opracowania specyficznych kryteriów interpretacji OFDI w patologii płuc. Metoda ta może być zastosowana w przypadku innych typów tkanek i technik obrazowania w celu uzyskania precyzyjnej korelacji obrazowania z histologią dla dokładnej interpretacji i oceny obrazów. Kryteria obrazowania...

Obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Ten artykuł opisuje wewnętrzne procedury konstruowania przedklinicznego fantomu multimodalnego wykonanego z materiałów naśladujących tkanki (TM) do zapewnienia jakości (QA) pomiaru wielkości guza w metodach obrazowania zwierząt, takich jak ultrasonografia (US), tomografia komputerowa (CT) i rezonans magnetyczny (MRI).

Budowa przedklinicznego fantomu multimodalnego z wykorzystaniem materiałów naśladujących tkanki w celu zapewnienia jakości w pomiarze wielkości guza

Poznaj syntezę porfisomów metodą ekstruzji wysokociśnieniowej oraz ich zastosowanie w fototermalnej terapii guzów. Badanie wykazało 100% przeżywalność zwierząt i całkowitą eliminację nowotworów bez nawrotów.

Jednominutowa, sub-jednowatowa fototermiczna ablacja guza przy użyciu porfisomów, wewnętrznych wielofunkcyjnych nanopęcherzyków

Przeglądaj więcej filmów