Pomiar siły podczas skurczu w celu oceny funkcji mięśni u larw danio pręgowanego
23 lipca 2013
Pomiary siły mogą być użyte do pokazania zmian w funkcjonowaniu mięśni spowodowanych rozwojem, kontuzją, chorobą, leczeniem lub toksycznością chemiczną. W tym filmie pokazujemy metodę pomiaru siły podczas maksymalnego skurczu mięśnia tułowia larw danio pręgowanego.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar wytwarzania siły podczas maksymalnego skurczu danio pręgowanego, larwy, mięśni tułowia. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw pętli do szwów, które będą używane do utrzymywania larw na miejscu podczas pomiarów siły. Następnie znieczulone larwy umieszcza się w komorze doświadczalnej.
Po umieszczeniu na miejscu siła jest rejestrowana podczas maksymalnego skurczu drgawkowego. Ostatnim krokiem jest zmierzenie wymiarów mięśni tułowia, tak aby siła szczytowa mogła zostać znormalizowana do pola przekroju mięśniowego. Ostatecznie pomiar wytwarzania siły podczas skurczu służy do pokazania zmian w funkcjonowaniu mięśni i ogólnym zdrowiu mięśni.
Chociaż demonstrujemy tę metodę na larwach danio pręgowanego typu dzikiego, może być ona również stosowana z larwami modyfikowanymi genetycznie lub z larwami traktowanymi lekami lub substancjami toksycznymi. Metoda ta może być następnie wykorzystana do scharakteryzowania modeli chorób mięśni i oceny leczenia lub do badania rozwoju mięśni, urazów lub toksyczności chemicznej. Pierwszym krokiem jest przygotowanie pętli do szwów, które będą służyły do utrzymywania larw na miejscu.
Podczas próby siłowej użyj kleszczy, aby rozdzielić niesterylny szew na trzy pasma. Po rozdzieleniu zacznij wiązać podwójny węzeł od góry w jednym z pasm, ale zatrzymaj się przed całkowitym zaciśnięciem węzła, aby utworzyć małą pętlę. Zamiast tego, aby zakończyć pętlę, użyj nożyczek, aby odciąć nadmiar szwu z ogonów.
Umieść pętelkę po lepkiej stronie karteczki samoprzylepnej do późniejszego wykorzystania. Wykonaj dwie pętle szwów dla każdej larwy, która będzie testowana. Najpierw umieść aparaturę badawczą na stoliku mikroskopu stereoskopowego.
Następnie podłącz przetwornika siły i regulatora długości do aparatury testującej. Włącz przetwornik siły i regulator długości, a następnie przestaw przełącznik z przodu regulatora długości. To sprawia, że rurka regulatora długości jest zmostkowana z jednorazowym transferem. Pipeta.
Napełnij komorę doświadczalną roztworem testowym. Użyj kleszczy, aby podnieść pętlę do szwów za jeden z ogonów jako chwytanie. Pętla na zakrzywionej części może zagiąć szew i spowodować jego pęknięcie podczas kolejnych kroków.
Zawieś jedną pętlę na rurce przetwornika siły, a drugą na regulatorze długości Za pomocą jednorazowej pipety transferowej przenieś larwy danio pręgowanego na małą szalkę Petriego wypełnioną roztworem testowym. Gdy środek znieczulający zacznie działać, delikatnie szturchnij ogon, aby sprawdzić, czy brak dotyku przypomina pływanie. Następnie za pomocą szklanej pipety przenieś larwy do komory doświadczalnej za pomocą kleszczy.
Delikatnie przeprowadź przednią część larwy przez pętlę szwu na rurce przetwornika siły, chwytając oba ogony pętli szwów. Pociągnij je jednocześnie, aby zacisnąć pętlę z tyłu do dębowego worka lub pęcherza pławnego za pomocą kleszczy. Przytrzymaj jeden ogon szwu i pociągnij, powodując, że larwy obracają się o 90 stopni wokół rurki, aż boczna strona larwy będzie skierowana do góry.
Za pomocą urządzenia pozycjonującego X, Y, Z dołączonego do regulatora długości, przesuń rurkę regulatora długości wzdłuż osi x oraz pod tułowiem i ogonem larw. Pozostaw przestrzeń między końcami rurki regulatora długości a rurką przetwornika siły. Następnie poprowadź pętlę szwów przez ogon larw i zaciśnij pętlę szwów.
Jak wykazano wcześniej, może być konieczne obrócenie tylnej części larw tak, aby boczna strona była skierowana do góry. Po umieszczeniu na miejscu przytnij ogony pętli szwów. Użyj urządzeń pozycjonujących XY, Z, aby powoli opuścić rurki, aż dotkną dna komory.
Następnie podnieś larwy na odpowiednią odległość od dna komory. Powinno to znajdować się w odległości roboczej odwróconego obiektywu mikroskopowego używanego później. Na koniec wyreguluj rurkę regulatora długości, aby wyrównać długą oś larwy z długą osią rurki przetwornika siły.
Aby rozpocząć, przesuń aparaturę testującą na stopień odwróconego mikroskopu. Następnie podłącz termometr cyrkulatora kąpieli wodnej i regulator temperatury do aparatury testującej. Włącz niezbędne komponenty i dostosuj ustawienie regulatora temperatury do żądanej wartości.
Podłączyć od stymulatora do aparatury badawczej. Włącz zasilanie stymulatora, ale w tym momencie nie stymuluj larw. Aby sprawdzić, czy larwy są równoległe do dna komory, obejrzyj część larw między końcami rurek.
Jeśli są równoległe, oba końce larw będą w razie potrzeby ostre. Wyreguluj rurkę przetwornika siły, aż oba końce będą zogniskowane, a larwa będzie równoległa. Włącz system długości sarkomeru wideo i obróć kamerę wideo tak, aby prążki były równoległe do boków klatki wideo.
Odstępy prążkowane są używane jako wskaźnik długości sarkomeru. Ustaw mikroskop tak, aby ustawił ostrość na włóknach obwodowych i zanotuj wskazaną długość sarkomeru. W razie potrzeby wyreguluj regulator długości, aby skrócić larwy, aż długość sarkomeru będzie mniejsza niż optymalna Aby zoptymalizować siłę drgania.
Najpierw ustaw prąd wyjściowy na stymulatorze na niską wielkość, a następnie zaprogramuj specjalistyczne oprogramowanie do dostarczania impulsów prądu. Czas trwania 0,2 milisekundy. Dostarcz pierwszy impuls i użyj oscyloskopu, aby zmierzyć szczytową siłę drgania.
Zwiększ prąd o 50 miliamperów i zmierz szczytową siłę drgań przy każdym nowym poziomie prądu. Odczekaj 30 sekund między drganiami, aby zapobiec zmęczeniu wraz ze wzrostem prądu stymulacji. Szczytowa siła drgania zwykle wzrasta do maksimum, a następnie stopniowo zmniejsza prąd, przy którym wytwarza larwa.
Największą siłą jest optymalny prąd stymulacji Po zidentyfikowaniu należy ustawić amplitudę prądu na optymalny prąd stymulacji i dostosować długość larw w celu wywołania maksymalnej siły drgania. Na koniec wywołaj drgnięcie mięśni larwy. Użyj oscyloskopu, aby zarejestrować reakcję siły i zapisać zapis do późniejszej analizy.
Aby zmierzyć wymiary mięśni, przesuń aparaturę testującą z powrotem do mikroskopu stereoskopowego. Korzystając ze skali IP, zmierz wysokość muskulatury patrząc z boku. Wykonaj pomiary w anatomicznym punkcie orientacyjnym.
Na przykład otwór moczowo-płciowy zaznaczony tutaj na czerwono. Następnie uważając, aby nie zmienić długości larw. Obróć larwy o 90 stopni za pomocą ogonów pętli do szwów, aby zobaczyć larwy od dołu.
Zmierz szerokość muskulatury patrząc od dołu. Na koniec przeciąć pętle szwów za pomocą mikroostrza, aby uwolnić larwy ze sprzętu testowego w zdrowych larwach danio pręgowanego typu dzikiego, włókna mięśniowe powinny być równoległe do siebie bez dużych przerw między nimi i mieć widoczne prążki Larwy danio pręgowanego typu dzikiego, które nie wykazują tych cech lub z widocznymi uszkodzeniami, takimi jak oderwane włókna, jak pokazano tutaj, należy tutaj wyrzucić. Szczytowa siła drgania w funkcji prądu stymulacyjnego jest wykreślana dla pojedynczej larwy danio pręgowanego.
Optymalny prąd stymulacji wynosi zwykle od 400 do 600 miliamperów. Reprezentatywna reakcja siły zebrana podczas maksymalnego skurczu drgawkowego pojedynczej larwy jest pokazana tutaj. Tu. Wykazano, że szczytowe wartości siły od larw typu dzikiego w różnym wieku wahają się od 0,9 do 1,7.
Milli Newtony ze starszymi larwami generującymi większą siłę niż młodsze larwy. Starsze larwy wytwarzają większą siłę niż młodsze larwy, nawet po znormalizowaniu sił szczytowych do obszaru mięśni w przekroju poprzecznym. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zacisnąć pętle szwów na tyle, aby larwy nie mogły łatwo obracać się wokół przetwornika siły i rurek regulatora długości.
Jeśli pętle szwów są zbyt luźne, siła generowana przez larwę nie zostanie w pełni przeniesiona na przetwornik siły, a maksymalna siła drgania będzie niedoszacowana.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę pomiaru wytwarzania siły podczas maksymalnych skurczu mięśni tułowia larw rybki zebrafish. Technika ta jest przydatna do oceny funkcji mięśni w różnych kontekstach, w tym rozwoju, urazów i narażenia na substancje chemiczne.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Fizjologia mięśni
- Biologia rozwoju
Tło
- Pomiar siły może wskazywać na zmiany w zdrowiu mięśni.
- Larwy rybek zebrafish służą jako model do badania funkcji mięśni.
- Metoda ta może być przystosowana do różnych warunków eksperymentalnych.
- Rozumienie skurczu mięśni jest kluczowe dla oceny terapii i modeli chorobowych.
Cel badania
- Pomiar siły podczas maksymalnych skurczu larw rybek zebrafish.
- Przedstawienie protokołu do oceny funkcji i zdrowia mięśni.
- Możliwość badania reakcji mięśni na leki i toksyny.
Stosowane metody
- Przygotowanie pętli szwowych do zamocowania larw podczas testów.
- Zastosowanie przetwornika siły do rejestracji skurczu mięśni.
- Pomiar wymiarów mięśni w celu normalizacji siły.
- Stymulacja larw w celu wywołania drżenia do pomiaru siły.
Główne wyniki
- Udane pomiary siły szczytowego drżenia u larw rybek zebrafish.
- Identyfikacja optymalnego prądu stymulacji dla maksymalnego wytwarzania siły.
- Demonstracja przydatności metody w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Wgląd w funkcjonowanie i zdrowie mięśni na podstawie pomiarów siły.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodny sposób oceny funkcji mięśni u larw rybek zebrafish.
- Pomiar siły może ujawniać ważne informacje o zdrowiu mięśni.
- Technika ta może być wykorzystana w badaniach nad chorobami mięśni i oceną terapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative force measurement during zebrafish larval muscle contraction provides a functional readout for muscle health, enabling robust assessment of disease models and pharmacological interventions. This approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to measurable physiological outcomes. Integrating functional muscle assays into discovery workflows enhances predictive confidence and informs portfolio triage for muscle-related therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of muscle function in genetically modified or compound-treated zebrafish larvae.
- Supports biological de-risking by providing quantitative evidence of target engagement or pathway modulation.
- Facilitates predictive confidence in disease model selection and validation.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for muscle contractility suitable for screening interventions.
- Standardizes force measurement outputs, supporting cross-study and cross-team comparability.
- Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional muscle readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by linking molecular interventions to physiological outcomes.
- Supports biomarker development by correlating force measurements with histological or molecular changes.
Pipeline & Workflow Integration
This force measurement method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical model assessment, providing a bridge between molecular perturbation and functional outcome.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying muscle response to genetic or chemical manipulation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides force and cross-sectional area measurements for robust statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects in vivo functional data to preclinical validation and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse muscle disease and toxicity studies across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle-targeted programs.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability for high-throughput applications.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing functional endpoints early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of muscle-related assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, muscle physiology, and force transducer instrumentation.
- Demands precise setup of stimulation, measurement, and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of protocols and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or compound classes.
- Careful attention to suture tension and larval positioning is critical for accurate force transmission.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Preparing Suture Loops
1:50
Preparing the Experimental Chamber and Positioning the Larva
4:11
Recording Force During a Maximal Twitch Contraction
6:20
Measuring Musculature Dimensions with Larva at Optimal Length
7:00
Results: Peak Force During Maximal Twitch
7:56
Conclusion
