Synteza, dostarczanie komórkowe i zastosowanie in vivo czujników pH na bazie dendrymerów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie nowych czujników fluorescencyjnych opartych na bębniarach Dun o ulepszonych właściwościach do obrazowania pH in vitro w żywych komórkach i in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie sprzężenie barwników wrażliwych na pH z rusztowaniem dendrytycznym wraz z innymi ugrupowaniami, takimi jak grupy docelowe lub pH w barwnikach wrażliwych. Pomiary in vitro są wykonywane w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej pH obok pH obrazu w żywych komórkach.

Czujnik jest dostarczany za pomocą elektroporacji, a mapy pH są generowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zobrazowania pH w przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu. Podczas fizjologicznej i patologicznej aktywności neuronalnej czujnik jest mikrowstrzykiwany do mózgu znieczulonych myszy. Dane fluorescencyjne są następnie pozyskiwane za pomocą mikroskopii fotonowej.

Uzyskane wyniki pokazują, że czujniki oparte na drymierze skutecznie mierzą zmiany pH z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, zarówno w żywych komórkach, jak i in vivo. Chociaż zastosowano już kilka barwników kominowych o zachowaniu wrażliwym na pH, cierpią one na kilka wad, takich jak słaba mobilność i wyciek komórek. Co więcej, nie pozwalają na pomiar bezwzględny w postaci wysypki.

Tutaj wykazaliśmy konfuzję barwników wrażliwych na pH z rusztowaniem genetycznym D, a ponieważ wydajność pozwala na dokładny pomiar ze specjalną i czasową rozdzielczością, metoda ta może być użytecznym narzędziem do badania fizjologicznych i patologicznych procesów regulowanych przez pH w żywych komórkach. Zakłócenie regulacji pH w układzie neurologicznym jest związane z kilkoma stanami, takimi jak udar mózgu i padaczka, a dostępny czujnik pH okazał się mało skuteczny, co doprowadziło do zaprojektowania prezentowanego czujnika. Chociaż to met został tutaj zastosowany do obrazowania pH h, jest to podejście ogólne i może być stosowane do innych gatunków istotnych biologicznie.

Wybierając barwnik wykrywający zysk, łatwe i wszechstronne podejście syntetyczne sprawia, że procedury te są proste. Dzisiaj zademonstrują procedurę Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody i Sebastian Suli Aby skoniugować wskaźniki pH do Piama Demersa. Rozpocząć od rozpuszczenia rimera w bezwodnym DMSO o końcowym stężeniu 50 mikromolowym.

Przygotować 10 mikromolowych roztworów podstawowych fluoresceiny NHS i tetraetylu RUMINE NHS, znanego również jako TMR w postaci bezwodnej, DMSO w mikroprobówce wirówkowej połączonej, jeden mililitr roztworu G four peram dederer z ośmioma równoważnikami lub 40 mikrolitrów fluoresceiny i ośmiu równoważników lub 40 mikrolitrów TMR. Stosunek molowy w mieszaninie będzie odzwierciedlał ilość barwników załadowanych na demer. Mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.

Następnie rozcieńczyć mieszaninę od 1 do 10 wodą dejonizowaną i załadować mieszaninę reakcyjną do worka dializacyjnego z odciętą masą cząsteczkową 10 kilodaltonów, dializować z wodą dejonizowaną i zastąpić wodę w zbiorniku trzy razy w ciągu 24 godzin. Następnego dnia przenieś roztwór do szklanej fiolki i zamroź go w temperaturze minus 80 na kilka godzin. Gdy roztwór jest całkowicie zamrożony, przenieś fiolkę do liofilizatora i liofilizuj przez 24 godziny.

Należy uzyskać fioletowy proszek, pofalowany w postaci stałej i rozpuścić go w wodzie mqe. Przy końcowym stężeniu 10 mikromolowych. Dozuj roztwór w 50 mikrolitrowych porcjach do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Do kalibracji in vitro przygotuj 500-nanomolowy roztwór bębnika D w dwóch milimolowych PBS W kwarcowym Q vet. Bardzo rozcieńczony bufor PBS stosuje się w celu uniknięcia nagłych zmian pH podczas miareczkowania. Zmierz widma emisyjne fluoresceiny i TMR oraz zoptymalizuj ustawienia optyczne fluorymetru, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu.

Następnie przeprowadzić miareczkowanie pH, dodając małe objętości 0,1 normalnego wodorotlenku sodu i 0,1 normalnego kwasu solnego. Po każdym dodaniu wstrząśnij Q vet, aby wymieszać. Odczekaj minutę do zrównoważenia, a następnie zmierz pH za pomocą pH.

Widma emisyjne fluoresceiny i TMR mikroelektrod powinny być rejestrowane dla każdego kroku bez żadnych zmian. W ustawieniach optycznych wykreśl intensywność fluorescencji w funkcji pH. W przypadku miareczkowania pH nie powinno mieć wpływu na sygnał dominacji pręcika.

Sygnał fluoresceiny powinien być krzywą sigmoidalną i powinien być wyposażony w model pojedynczego wiązania o PK 6,4 dla elektroporacji. Przenieś sześć razy 10 do piątej komórki hela w 72 mikrolitrach do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej do zawieszonych komórek. Dodać dendri lub roztwór wodny o stężeniu dwóch mikromolowych, dodać trzy mililitry buforu elektroporacyjnego do probówki do mikrooczyszczania.

Następnie za pomocą końcówki do elektroporacji o pojemności 10 mikrolitrów odessać mieszaniny ogniw i rimerów. Następnie włóż mikropipetę do stacji pipetowej i ustaw tutaj warunki impulsu mikrooczyszczania. Napięcie impulsu jest ustawione na 1005 woltów.

Szerokość impulsu jest ustawiona na 35 milisekund, a liczba impulsu jest ustawiona na dwie za płytką impulsową. 20 mikrolitrów komórek wyelektroporowanych na szklane naczynia denne ze świeżą pożywką bez antybiotyków. 12 godzin po elektroporacji zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu standardowego zestawu filtrów dla fluoresceiny i r dominy.

Skoncentruj się na próbce i dostosuj moc lasera oraz wzmocnienie detektora, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu. Jeśli elektroporacja się powiodła, ogniwa powinny być jasno fluorescencyjne w obu kanałach. Lokalizacja zależy od wielkości i ładunku D, które są używane. Często.

Lokalizacja lizosomalna słońca, która jest postrzegana jako małe pęcherzyki okołojądrowe, jest obecna z powodu endocytozy lub kompartmentalizacji com. Jeśli dominuje lokalizacja lizosomalna, w której większość fluorescencji jest zlokalizowana wewnątrz pęcherzyków, a w cytozolu obserwuje się sygnał porowy. Oznacza to toksyczność i pomiary należy odrzucić.

Rejestruj oba kanały sekwencyjnie, uzyskaj kilka obrazów i uśredniaj obrazy, aby poprawić jakość obrazu. Aby wygenerować krzywą kalibracyjną pH, użyj z opfor o różnych pH, aby zbić wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe pH o tej samej wartości. Uzyskaj co najmniej 20 obrazów komórek na pH i zmierz co najmniej pięć punktów od pH 5,5 do pH 7,5.

Przypomina to, że pH B sześć jest toksyczne dla komórek, ale może być tolerowane przez krótki czas, więc uzyskuj obrazy tak krótko, jak to możliwe. Jeśli zauważysz oznaki apoptozy, wyrzuć komórki i uruchom ponownie. Po przejęciu.

Użyj obrazu J lub analogicznego oprogramowania do analizy danych. Najpierw określ stosunek koloru zielonego do czerwonego. Następnie wykreśl stosunek w funkcji pH, aby uzyskać trend liniowy, który da krzywą kalibracyjną, którą można wykorzystać do przeliczenia stosunku na pH w przyszłych eksperymentach.

W celu przygotowania próbki in vivo należy rozpocząć od C 57 black six J i samic myszy między 28. a 70. dniem po urodzeniu. Po znieczuleniu myszy uretanem wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone i nałóż maść do oczu, aby zmniejszyć reakcję na stres korowy i obrzęk mózgu. Podczas zabiegu należy wstrzyknąć domięśniowo dwa miligramy na kilogram masy ciała deksametazonu, fosforanu sodu.

Następnie za pomocą nożyc chirurgicznych ogol głowę zwierzęcia, a następnie umieść serwetę chirurgiczną i nałóż 2,5% żel lidokainy na skórę głowy. Użyj nożyczek, aby przeciąć płat skóry pokrywający czaszkę obu półkul. Odsłoniętą kość umyć solą fizjologiczną i kleszczami, delikatnie usunąć okostną.

Zapewni to lepszą powierzchnię przyczepności. W przypadku kleju i cementu dentystycznego nałóż wykonany na zamówienie stalowy słupek głowy z centralną komorą obrazowania i za pomocą cyjanoakrylanu przyklej go na miejscu w prostej mniej więcej równolegle do czaszki nad obszarem kory mózgowej. Przymocuj słupek na miejscu za pomocą białego cementu dentystycznego.

Zamocuj głowę myszy i wykonaj kraniotomię o średnicy od dwóch do trzech milimetrów, wiercąc w obszarze zainteresowania. Często podczas procedury wiercenia używa się strzykawki do nakładania świeżego sterylnego płynu mózgowo-rdzeniowego A do czaszki, aby zminimalizować nagrzewanie się kory podczas operacji. Po kraniotomii przenieś zwierzę do etapu obrazowania, aby głowa nadal znajdowała się pod obiektywem.

Przykręć komorę obrazowania do regulowanego słupka. Zastosuj wykonany na zamówienie plastikowy kaganiec podłączony do tlenu. Zapewni to powietrze wzbogacone w tlen podczas eksperymentu, aby wspomóc oddychanie zwierząt.

Aby wstrzyknąć czujnik do kory mózgowej, załaduj szklaną pipetę o średnicy końcówki czterech milimetrów i elektrodę chlorku srebra. Dzięki jednemu roztworowi ER do mikromolowego drimmera elektroda ułatwi rejestrację potencjałów pola zewnątrzkomórkowego za pomocą zestawu do mikroiniekcji. Włóż pipetę do kory na głębokość około 150 mikronów.

Wstrzykiwać przez jedną do dwóch minut pod ciśnieniem 0,5 funta na cal kwadratowy, aby zoptymalizować konfigurację optyczną do obrazowania. Dostosuj moc lasera, aby zminimalizować wybielanie zdjęć i uszkodzenia zdjęć. Zazwyczaj moc zastosowanego lasera wynosi około 20 miliwatów, a wzmocnienie PMT jest utrzymywane na stałym poziomie 667 woltów.

Ustaw długość fali lasera tak, aby wzbudzić czujnik na 820 nanometrach i skieruj oprogramowanie do jednoczesnego wykrywania fluoresceiny i fluorescencji dominy pręcików przez standardowe filtry FTSE i trit. Ustaw także częstotliwość akwizycji na częstotliwość odświeżania dwóch Hz w celu korekcji tła. Uzyskaj ciemną ramkę z zamkniętą migawką laserową, aby zmierzyć średni szum termiczny powstający w PMT i cokole.

Na koniec uzyskaj obrazy fluorescencji zależne od pH i przechowuj je do późniejszej analizy. Przeanalizuj dane jak poprzednio, aby ocenić zachowanie fluoresceiny i żwacza in vitro. Po załadowaniu do rimeru przeprowadzono miareczkowanie pH za pomocą fluorymetru.

Rysunek przedstawia typowe miareczkowanie czujnika pH. Fluoresceina i żwacz mogą być oddzielnie wzbudzane odpowiednio przy 488 nanometrach i 550 nanometrach, co pozwala na minimalny przesłuch między tymi dwoma kanałami, co wyraźnie widać. Fluoresceina wykazuje zachowanie zależne od pH, podczas gdy sygnał miny R nie zmienia się znacząco w fizjologicznym zakresie pH.

Dlatego stosunek tych dwóch sygnałów nie zależy od stężenia czujnika, a jedynie od pH. Następnie, aby dostarczyć wskaźnik wewnątrzkomórkowo, komórki hela zostały elektroporowane za pomocą czujników dederera i wykonano obrazowanie konfokalne, jak opisano w tym filmie. Te obrazy konfokalne pokazują komórki w kanale fluoresceiny po lewej stronie, kanał dominowy R pośrodku i są wyświetlane jako mapa metryczna stosunku pH po prawej.

Obserwuje się silne sygnały fluoresceiny i r domin, które współlokalizują się, wykazując integralność struktury czujnika. Mapa metryczna proporcji jest rekonstruowana przez podzielenie dwóch obrazów piksel po pikselu i jest reprezentowana za pomocą pseudo skali kolorów. Aby skalibrować odpowiedź czujnika wewnątrz komórek, przeprowadzono zaciskanie pH za pomocą jonoforów, jak pokazano tutaj.

Wskaźniki łatwo reagują na pH zmianą stosunku koloru zielonego do czerwonego. Uzyskane dane wykorzystano do wygenerowania krzywej kalibracyjnej w celu uzyskania dokładnych pomiarów pH. Trend liniowy w kalibracji pokazuje zdolność czujnika do reagowania na pH bez żadnych zakłóceń ze strony środowiska komórkowego.

Aby zademonstrować, w jaki sposób czujniki oparte na dendri mogą być wykorzystane do obrazowania in vivo, przeprowadzono obrazowanie pH w mózgu znieczulonej myszy dendri lub znieczulonej myszy, której wstrzyknięto. Sygnały fluoresceiny i r domine uzyskano jednocześnie ze wzbudzeniem 820 nanometrów, a mapa proporcji została zbudowana na podstawie piksel po pikselu, podobnie jak w przypadku pomiarów żywych komórek. Warto zauważyć, że wskaźniki lokalizują się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, niefluorescencyjne obszary na obrazie identyfikują ciała komórkowe lub małe naczynia krwionośne w celu zweryfikowania reakcji czujnika na pH.

Zastosowaliśmy hiperkapneę. Rzeczywiście, wiadomo, że dwutlenek węgla zmienia równowagę węglanowych we krwi i tkankach, powodując zakwaszenie tkanki. Jak widać na tym wykresie, wdychanie 30% dwutlenku węgla wystarczy, aby wywołać silną reakcję czujnika, która jest całkowicie odwracalna po zwiększeniu obrotów wentylacji myszy.

Wyniki te pokazują potencjał czujników opartych na OFER do wykrywania fizjologicznych i patologicznych zmian pH w żywych komórkach i in vivo. A, nasza procedura jest kompatybilna z innymi pomiarami, takimi jak zapisy elektrofizjologiczne. Pozwoliło to na uzyskanie jednocześnie uzupełniających się informacji o zachodzącym procesie biologicznym.

Metoda ta, po jej opracowaniu, utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii komórki i neurobiologii do badania procesów regulowanych pH w komórkach hodowlanych i in vivo.