Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo
July 9th, 2013
Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie angiogenezy w siatkówce noworodków myszy. Osiąga się to poprzez najpierw zarodkowanie oczu poporodowych, a następnie zastosowanie utrwalacza trzeciego kroku polega na dokładnym rozwarstwieniu siatkówki poporodowej murn w kształt płatka, a ostatnim krokiem jest zabarwienie układu naczyniowego siatkówki. Ostatecznie wizualizację unaczynienia siatkówki myszy uzyskuje się za pomocą barwienia fluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej.
Tę procedurę zademonstrują dr Simon Tlo, post-doc w moim laboratorium, oraz Kathleen Allenson, poprzednia członkini mojego laboratorium. W całej tej procedurze domyślną temperaturą jest temperatura pokojowa. Zacznij od umieszczenia humanitarnie zabitego szczeniaka myszy na boku za pomocą nożyczek.
Usuń skórę zakrywającą oko. Następnie, trzymając nożyczki umieszczone poniżej oka, przetnij nerw wzrokowy i otaczające go tkanki, a następnie wyjmij oko. Przenieś wyłuszczone oko na 24-dołkową płytkę zawierającą utrwalacz, który zawiera 4% PFA w dwóch razy.
PBS przystępuje do preparacji następnego oka, gdy jedno z nich znajduje się w utrwalaczu. Odstęp między dwoma rozwarstwieniami oczu wyniesie pół minuty. Z praktyką.
Pozwól każdemu oku utrwalić się przez 10 do 15 minut. Następnie przenieś je do schłodzonego dwa razy PBS na lodzie przez co najmniej pięć do 10 minut. Przed wyizolowaniem siatkówki należy zebrać tyle oczu do PBS, ile jest to pożądane, za pomocą plastikowej pipety pastwiskowej, która została przecięta w celu poszerzenia knura.
Przenieść oczy na szalkę Petriego zawierającą dwukrotność PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń tłuszcz wokół oka za pomocą kleszczy i nożyczek. Przebij krawędź rogówki ostrymi nożyczkami i przetnij wokół rogówki i tęczówki, wyrzuć te tkanki.
Następnie włóż kleszcze między siatkówkę a twardówkę. Usuń twardówkę, uważając, aby nie rozerwać siatkówki. Warstwę naczyniówki można również usunąć, o ile nie ma ryzyka uszkodzenia siatkówki.
Pozostawienie warstwy naczyniówki nie powinno znacząco wpłynąć na jakość barwienia immunologicznego. Teraz za pomocą kleszczy usuń soczewkę i ciało szkliste. Następnie usuń naczynia aloidowe.
Użyj cienkich kleszczy, aby zebrać je razem w środku oka. Następnie szybko odciągnij je od środka siatkówki. Zachowaj szczególną ostrożność, aby usunąć cały żółty oset, ponieważ jeśli zostawisz trochę, mogą one zaciemnić twoje wyniki stania.
Siatkówkę w kształcie miseczki należy teraz przenieść na czystą szalkę Petriego i spłukać do czysta PBS. Przejdźmy teraz do siatkówki. Wykonaj od czterech do pięciu promieniowych nacięć, które sięgają około dwóch trzecich drogi w kierunku środka.
Użyj nożyczek sprężynowych, aby stworzyć siatkówkę w kształcie pedału. Ten krok wymaga cierpliwości i praktyki, aby osiągnąć doskonałość. Teraz odbierz większość PBS za pomocą pipety pastwiskowej.
Spowoduje to spłaszczenie siatkówki. Następnie usuń nadmiar PBS za pomocą małego kawałka chłonnego papieru. Następnie nałóż minus 20 stopni metanolu kropla po kropli na powierzchnię siatkówki, aż będzie w większości zanurzona, a następnie obficie dodaj metanol.
Siatkówki zmienią kolor na biały. Ten krok pomaga naprawić siatkówki i ułatwia przenikanie. Przenieś siatkówki w zimnym metanolu do małej rurki.
Za pomocą plastikowej pipety o szerokim otworze. W razie potrzeby pozwól im inkubować w zimnym metanolu przez co najmniej 20 minut, siatkówki mogą pozostać w metanolu w temperaturze minus 20 stopni przez kilka miesięcy. Przeciwciała są używane tylko tutaj.
Kino nie może być z powodzeniem stosowane na stałej siatkówce matki. W takim przypadku siatkówka musi przejść od razu do barwienia immunologicznego po spłaszczeniu ich do kształtu płatka. Zacznij od ostrożnego odpipetowania metanolu z siatkówki.
Następnie szybko i delikatnie przepłucz siatkówki za jednym razem PBS. Usuń PBS i przykryj siatkówki 100 mikrolitrami roztworu bloku trwałej ondulacji z 5% odpowiedniej surowicy. Ustaw siatkówki tak, aby delikatnie wstrząsały przez godzinę później.
Usuń roztwór bloku do trwałej ondulacji za pomocą pipety i zastąp go 100 mikrolitrami roztworu blokowego do trwałej ondulacji zawierającego przeciwciało pierwotne lub selektynę wcześniej. Następnie ustaw siatkówki na inkubację przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem następnego ranka. Umyj siatkówki cztery razy w PBS TX przez 10 minut na pranie.
Stosuj delikatne kołysanie podczas wszystkich etapów prania. Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe jest niesprzężone, dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczonego w stosunku 1 do 200 w PBS tx. Inkubuj siatkówki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem w celu usunięcia przeciwciała wtórnego.
Umyj siatkówki cztery razy w PBS TX z delikatnym kołysaniem przez 15 minut na pranie. Teraz przystąp do montażu. Przenieś siatkówki na szkiełka za pomocą plastikowej pipety o szerokim otworze i usuń nadmiar P-B-S-T-X za pomocą chusteczki.
Następnie zamontuj siatkówki w 50 mikrolitrach przedłużonego złota i delikatnie przykryj roztwór szkiełkiem nakrywkowym. Aby umożliwić przedłużone przechowywanie złota, należy schłodzić szkiełka przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem następnego dnia. Kontynuuj obrazowanie siatkówki po sekcji.
Siatkówka powinna wyglądać jak płaski kwiat przy użyciu wyboru ISO B cztery Alexa 4 88. Komórki śródbłonka zostały wybarwione i mają zielony kolor. Wspierające komórki mięśni naczyniowych wizualizowano za pomocą mięśni gładkich Antifa, działały w widoku niskiej mocy przy użyciu pięciokrotnego obiektywu, umożliwiły przegląd organizacji naczyniowej siatkówki przy użyciu innej kombinacji przeciwciał.
Komórki śródbłonka można zobaczyć za pomocą barwienia immunologicznego anty CD 31, wspierając pasożyty, które są wizualizowane za pomocą przeciwciała przeciwko NG dwa. Alternatywnie, wspierające pasożyty zostały zabarwione anty desminą. Barwienie antydesminowe wizualizuje procesy podobne do palców pasożytów i pomaga określić, czy są one ściśle związane z komórkami śródbłonka.
W przeciwieństwie do tego, barwienie anty NG dwa zarysowuje jądra każdego pasożyta, co jest przydatne przy ilościowym określaniu liczby komórek pasożyta w układzie naczyniowym. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać dotykania i uszkadzania powierzchni siatkówki narzędziami do preparowania. Po tej procedurze można wykonać inną metodę, taką jak barwienie BD, w celu zbadania proliferacji określonych komórek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsza procedura bada angiogenesę w siatkówce noworodków myszy, którą jest dobrze scharakteryzowany model do badania rozwoju naczyń krwionośnych. Polega ona na starannej dysekcji i barwieniu naczyń krwionośnych siatkówki w celu wizualizacji angiogenesy in vivo.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Angiogenesa
- Rozwój siatkówki
Tło
- Siatkówka noworodka myszy jest uznanym modelem do badań nad angiogenesą.
- Rozumienie ról genów i leków w angiogenesie jest kluczowe dla rozwoju terapii.
- Barwienie immunofluorescencyjne jest niezbędne do wizualizacji splotu naczyniowego.
- Ten model pozwala na in vivo badania modulacyjnych zmian w naczyniach krwionośnych.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów angiogenesy w siatkówce noworodka myszy.
- Wizualizacja naczyń krwionośnych siatkówki za pomocą technik barwienia fluorescencyjnego.
- Demonstracja procedury do przyszłych zastosowań w badaniach.
Zastosowanie metod
- Uzyskiwanie oczu noworodków myszy po urodzeniu.
- Zastosowanie utrwalacza w celu zachowania struktury tkanki.
- Dysekcja siatkówki w kształt płatka dla optymalnego barwienia.
- Wykorzystanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji zabarwionych naczyń krwionośnych.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja splotu naczyniowego siatkówki.
- Demonstracja procesu angiogenesy w kontrolowanym środowisku.
- Wgląd w modulacyjne zmiany angiogenesy przez różne czynniki.
- Ustawienie niezawodnej metody dla przyszłych badań.
Wnioski
- Siatkówka noworodka myszy służy jako skuteczny model do badań nad angiogenesą.
- Barwienie fluorescencyjne i mikroskopia konfokalna są niezbędne do wizualizacji struktur naczyniowych.
- Ta procedura może pomóc w zrozumieniu genetycznych i farmakologicznych wpływów na angiogenesę.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The neonatal mouse retina model enables mechanistic interrogation of angiogenic pathways critical for target validation in vascular disease research. Fluorescent staining of vascular structures provides quantitative, reproducible readouts that support preclinical de-risking of anti-angiogenic candidates. This approach bridges discovery biology with translational decision-making by visualizing vascular plexus formation in a disease-relevant, 2D-confined system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of angiogenic targets through direct visualization of endothelial and perivascular cell dynamics.
- Operational Value: Standardized whole-mount preparation supports consistent vascular plexus quantification across experimental conditions.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological modulation to vascular sprouting phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent isolectin and antibody staining generates standardized, multiplexable readouts for vascular density and branching analysis.
- Quantitative Output: Confocal imaging enables morphometric quantification of vascular plexus parameters essential for hit validation.
- Scalability: Whole-mount format allows parallel processing of multiple retinas for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathological angiogenesis relevant to ischemic retinopathy and tumor vascularization.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit validation to preclinical efficacy testing in vascular modulation studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular readouts with downstream functional outcomes such as perfusion or leakage.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing angiogenic phenotype data that informs target selection and lead optimization prior to in vivo efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic regulators through direct visualization of vascular network formation.
- Screening: Generates standardized, imaging-based vascular metrics for compound effect assessment in angiogenesis-focused assays.
- Analytics: Delivers quantitative vascular parameters (density, branch points, vessel area) that enable inter-group comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects mechanistic angiogenesis data to preclinical models of vascular disease through conserved molecular pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis-inducing or -suppressing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, visual evidence of vascular modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, staining, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts later-stage efficacy in angiogenesis-dependent models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic targets based on functional vascular outcomes in a physiologically relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and whole-mount preparation to preserve retinal integrity.
- Dependent on confocal microscopy and fluorescent imaging infrastructure for high-resolution vascular visualization.
- Necessitates standardization of staining protocols and antibody validation across users and sites.
- Adaptation to alternative models may require optimization of dissociation and staining conditions due to retinal-specific architecture.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential antibody penetration challenges in thicker preparations.
