Name: Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Naucz się barwienia immunofluorescencyjnego siatkówki noworodka myszy w celu badania angiogenezy in vivo. Ta metoda umożliwia wizualizację naczyń krwionośnych i analizę rozwoju układu naczyniowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust i British Heart Foundation.

Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Wyłuszczenie i fiksacja oczu po urodzeniu
<ol>
	<li>Połóż humanitarnie zabite szczenię myszy na boku, usuń skórę zakrywającą oko nożyczkami.</li>
	<li>Użyj nożyczek i kleszczy, aby wyłuszczyć oko.</li>
	<li>Umieść nożyczki poniżej wyłuszczonego oka, przetnij nerw wzrokowy i otaczające tkanki, a następnie wyjmij oko. Przenieść na 24-dołkową płytkę zawierającą 4% paraformaldehydu (PFA) utworzonego w 2x PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pozwól każdemu oku związać się na 10 - 15 minut, a następnie przenieś do zimnego 2x PBS na lodzie na 5 - 10 minut. Najlepiej jest rozłożyć enukleacje i późniejszą fiksację, aby upewnić się, że stopień utrwalenia jest równy dla każdego oka.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie poporodowych mysich siatkówk
<ol>
	<li>Przenieś oczy na szalkę Petriego zawierającą 2x PBS za pomocą plastikowej pipety Pasteura, która została wycięta w celu poszerzenia otworu i umieszczona pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Usuń tłuszcz wokół oka za pomocą kleszczy i nożyczek.</li>
	<li>Przebij krawędź rogówki ostrymi nożyczkami i przetnij wokół rogówki i tęczówki, a następnie wyrzuć.</li>
	<li>Włóż kleszczyki między siatkówkę a twardówkę i usuń twardówkę, uważając, aby nie rozerwać siatkówki. Warstwę naczyniówki można również usunąć, ale jeśli istnieje ryzyko uszkodzenia siatkówki na tym etapie, warstwę naczyniówki można pozostawić, ponieważ nie powinno to znacząco wpłynąć na jakość barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Usuń soczewkę i ciało szkliste za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Usuń naczynia hialoidowe, zbierając je razem w środku oka za pomocą drobnych kleszczy, a następnie szybko odciągnij od środka siatkówki (alternatywnie odetnij podstawę naczyń hialoidalnych drobnymi nożyczkami).</li>
	<li>Opłucz siatkówkę w kształcie miseczki za pomocą PBS na czystej szalce Petriego.</li>
	<li>Wykonaj od 4 do 5 promieniowych nacięć sięgających około 2/3 promienia siatkówki za pomocą nożyczek sprężynowych, aby uzyskać kształt "płatka".</li>
	<li>Odciągnij PBS za pomocą pipety Pasteura, aby spłaszczyć siatkówkę, a następnie usuń nadmiar PBS za pomocą małego kawałka chłonnego papieru.</li>
	<li>Powoli pipetować zimny (-20 °C) metanol kropla po kropli na powierzchnię siatkówki, aż do całkowitego pokrycia, a następnie zalać dodatkowym metanolem. Pomoże to naprawić siatkówki i ułatwi przepuszczalność. Siatkówki zmienią kolor na biały.</li>
	<li>Przenieść do probówki o pojemności 2 ml za pomocą plastikowej pipety Pasteura, która została przycięta w celu poszerzenia otworu.</li>
	<li>Pozostaw siatkówkę w zimnym metanolu na co najmniej 20 minut przed przystąpieniem do barwienia immunologicznego. Spośród zastosowanych tutaj przeciwciał tylko VE-Cadherin nie może być z powodzeniem stosowana na siatkówkach utrwalonych metanolem. W takim przypadku siatkówki muszą przejść bezpośrednio do barwienia immunologicznego po kroku 9.</li>
	<li>W razie potrzeby siatkówki mogą być przechowywane w metanolu w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy przed barwieniem.</li>
</ol>
3. Barwienie układu krwiodawczego siatkówki metodą immuno/izolektyny
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjąć/wylać metanol i delikatnie przepłukać siatkówki krótko w PBS (na tym etapie siatkówka jest nadal w tej samej probówce o pojemności 2 ml z kroku 11 powyżej).</li>
	<li>Usunąć PBS i przykryć siatkówki 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/bloku (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% odpowiedniej surowicy (patrz Tabela 1) i delikatnie wstrząsać przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć trwałą ondulację/blok i inkubować siatkówki, delikatnie wstrząsając przez noc w temperaturze 4 °C ze 100 μl wybranych przeciwciał pierwszorzędowych (patrz tabela 1) i/lub izololektyny B4, przygotowanych przez rozcieńczenie w trwałym ondulacji/bloku.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało/izolektynę i przemyć siatkówki 4 x 10 min w PBS + 0,3% Triton (PBSTX).</li>
	<li>W niektórych przypadkach, np. po barwieniu IsolectinB4-Alexa488 lub bezpośrednio sprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciało drugorzędowe nie jest wymagane, a siatkówki można montować bezpośrednio (krok 7). Jeżeli w kroku 3 użyto niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego, dodaje się 100 μl odpowiedniego fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w stosunku 1:200 w PBSTX) i pozostawia do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało wtórne i przemyć siatkówki 4 x 15 min w 2 ml PBSTX.</li>
	<li>Przenieść siatkówki na szkiełka za pomocą plastikowej pipety Pasteura o szerokim otworze i usunąć nadmiar PBSTX za pomocą chłonnej tkanki. Zamontuj siatkówkę, dodając 50 μl Prolong mountant na szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść na siatkówce.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do lodówki na noc w temperaturze 4 °C, upewniając się, że są płaskie i chronione przed światłem, aby umożliwić ustawienie mocowania Prolong.</li>
	<li>Obraz siatkówki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu epifluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li>
<li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li>
<li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184(2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336(2012).</li>
<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li>
<li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li>
<li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiona tutaj metoda oferuje prosty i skuteczny sposób uzyskiwania obrazów barwionych preparatów z całego wierzchowca siatkówki noworodków myszy, dzięki czemu jest łatwo mierzalnym i fizjologicznie istotnym modelem angiogenezy. Początkowo oko myszy może być dość trudne do wypreparowania ze względu na jego mały rozmiar i kształt kuli, więc aby uzyskać wiarygodne wyniki, potrzebna jest pewna praktyka i dobre narzędzia do preparowania. Wypreparowanie oczu przygotowane w 2x stężeniu PBS jest o tyle istotne, że powoduje...

Angiogeneza to złożony proces rozwojowy definiowany przez tworzenie nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejącej sieci naczyń krwionośnych i jest regulowany przez kilka ścieżek sygnałowych. Najbardziej znanym z nich jest szlak VEGF. VEGF jest uwalniany przez komórki niedokrwienne i prowadzi do inicjacji angiogennego kiełkowania w sąsiednich naczyniach krwionośnych. Wiodąca komórka śródbłonka z nowego kiełka naczyniowego jest komórką "wierzchołkową", która wytwarza filopodia sięgające w kierunku źródła VEGF, a następnie proliferujące komórki śródbłonka "łodygi". W ten sposób aktywowane komórki śródbłonka migrują i namnażają się w kierunku obszaru jałowego, gdzie tworzą nowe rurki naczyniowe. Aby ustabilizować te rurki w celu wsparcia przepływu krwi, komórki śródbłonka oddziałują z perycytami i komórkami mięśni gładkich, które otaczają nowe naczynia krwionośne 1. Angiogeneza jest niezbędna do unaczynienia zarodka i wzrostu tkanek. Jednak przyczynia się również do wielu zaburzeń patologicznych, takich jak rak; Natomiast defekty angiogenezy są związane z chorobami niedokrwiennymi. Opracowanie skutecznych terapii lekowych regulujących angiogenezę jako metody leczenia choroby jest zatem bardzo interesujące. Na przykład skuteczne czynniki antyangiogenne ograniczą wzrost raka, podczas gdy strategie proangiogenne mogą być stosowane w leczeniu choroby niedokrwiennej. W związku z tym modele angiogenezy są niezbędne do lepszego zrozumienia regulacji powstawania nowych naczyń krwionośnych i opracowania nowych strategii terapeutycznych w celu zwiększenia lub zmniejszenia wzrostu naczyń krwionośnych.
Podstawowym elementem badań nad angiogenezą jest wybór odpowiedniego modelu naczyniowego. Wiele modeli in vitro zaprojektowano w celu odtworzenia podstawowych etapów angiogenezy, takich jak migracja komórek śródbłonka, proliferacja i przeżycie 2,3 . Często stosowanym testem in vitro jest tworzenie rozgałęzionej sieci komórek śródbłonka na matrycy Matrigel, chociaż nie jest to specyficzne dla komórek śródbłonka, ani zwykle nie obejmuje wsparcia perycytów lub komórek mięśni gładkich. Ocena angiogenezy kiełkowania ex vivo przy użyciu hodowli narządów myszy, takich jak test ciała zarodka, test pierścienia aortalnego i test śródstopia płodu, umożliwia analizę angiogenezy komórek śródbłonka w kontekście dodatkowych komórek podporowych. Jednak główne ograniczenia tych testów obejmują brak przepływu krwi i regresję naczyń w czasie, co daje ograniczone okno na analizę. Dlatego, aby dokładniej zrozumieć regulację angiogenezy, potrzebne są modele in vivo, takie jak te opracowane u myszy przy użyciu podskórnie wszczepionych gąbek lub zatyczek matrigelowych, a także model niedokrwienia kończyn tylnych. Modele te są jednak trudne do analizy ze względu na złożoną architekturę 3D neovessels. Natomiast zarodek danio pręgowanego okazał się doskonałym modelem do wizualizacji angiogenezy w całym organizmie 4. Jednak mysz jest ewolucyjnie znacznie bliżej spokrewniona z człowiekiem niż danio pręgowany, co czyni mysz preferowanym modelem w wielu przypadkach. W związku z tym angiogeneza pourodzeniowej siatkówki myszy stanowi dobrze scharakteryzowaną metodę z wyboru w badaniach angiogenezy. Zapewnia nie tylko ustawienie fizjologiczne, ale także splot naczyniowy 2D, który można łatwo uwidocznić za pomocą odpowiednich barwników fluorescencyjnych. Za pomocą tej techniki można badać architekturę sieci naczyń, proliferację śródbłonka, kiełkowanie, rekrutację komórek okołonaczyniowych i przebudowę naczyń.
W siatkówce noworodków myszy, rozwój naczyń krwionośnych siatkówki następuje w pierwszym tygodniu życia po urodzeniu. Myszy, w przeciwieństwie do ludzi, rodzą się ślepe, a siatkówki unaczyniają się dopiero po urodzeniu. Naczynia siatkówki powstają ze środka siatkówki w pobliżu nerwu wzrokowego w dniu pourodzeniowym 0 (P0) i rozwijają się w drodze angiogenezy, tworząc wysoce zorganizowany splot naczyniowy, który dociera do obwodu siatkówki o około P8 5. Naczynia krwionośne rozwijają się w charakterystyczny sposób, a splot kapilarny stopniowo rośnie na zewnątrz od tarczy nerwu wzrokowego w kierunku obwodu, aby wytworzyć regularny naprzemienny wzór tętnic i żył z pośrednią siecią naczyń włosowatych. Unaczynienie siatkówki stanowi idealny model do badania angiogenezy, ponieważ naczynia można łatwo zidentyfikować, gdy rosną w płaszczyźnie 2D, co ułatwia badanie unaczynienia siatkówki w preparatach do montażu płaskiego 5. Opisano metodę izolowania siatkówki noworodka myszy w celu analizy odpowiedzi komórek wierzchołka śródbłonka w ciągu kilku godzin ex vivo 6. Alternatywnie, bardziej szczegółowe badanie całego unaczynienia siatkówki i związanych z nią markerów naczyniowych wymaga barwienia immunologicznego utrwalonych próbek siatkówki na różnych etapach rozwoju.
Tutaj podajemy szczegółowy opis niezawodnej i technicznie prostej metody, której używamy do barwienia całego mocowania mysiego splotu naczyniowego siatkówki, od początkowego wyłuszczenia oka po urodzeniu (zobacz też 7) poprzez protokoły barwienia aż do końcowego obrazowania pod mikroskopem.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiał</td></tr><tr><td>Plastikowe pipety 3 ml</td><td>Naukowe materiały laboratoryjne</td><td>PIP4210</td><td>Usuń końcówkę nożyczkami, aby utworzyć 24-dołkowe</td></tr><tr><td>płytki BD Falcon o szerokim otworze</td><td>Materiały do laboratoriów naukowych</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Wybierz szalki Petriego TV 90 mm</td><td>Materiały do laboratorium naukowego</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Histobond</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #5</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe o długości 10,5 cm, z prostymi ostrzami 8 mm Światowe</td><td>instrumenty precyzyjne</td><td>501235</td><td>Służy do enukleacji</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas o długości 8,5 cm, z prostymi ostrzami 7 mm i bardzo cienkimi końcówkami 0,025 x 0,015 mm</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>500086</td><td>Służy do preparowania siatkówki</td></tr><tr><td>Bardzo drobne nożyczki vannas o długości 8 cm z prostymi ostrzami 3 mm i bardzo cienkimi końcówkami 0,015 x 0,015 mm</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>501778</td><td>Używany do preparowania siatkówki</td></tr><tr><td>krystalicznie czyste&#8217; probówki 2 ml</td><td>Starlab</td><td>E1420-2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>odczynnik Sigma</td><td>S0876</td><td>PBS Odczynnik</td></tr><tr><td>jednozasadowy fosforan potasu</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>PBS odczynnik</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Uzupełnić w 2x PBS i przechowywać w temperaturze -20 &#176; C</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td>Sigma A7638</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Odczynnik montażowy</td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Stosować w Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200</td></tr> <td colspan="4"><silne>Przeciwciała pierwotneAnty-NG2 (poliklonalne króliki) Millipore AB5320 Wykrywa perycyty Anty-GFAP (klon GA5, mysz monoklonalny)Millipore MAB360 Wykrywa astrocyty Anti-Desmin (klon Y66,<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> królik monoklonalny)</td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>Wykrywa perycyty</td></tr><tr><td>Anti-Collagen IV (poliklonalny królik)</td> <td>Chemicon</td><td>AB756P</td><td>Wykrywa błonę podstawną naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>Anty-alfa mięśnie gładkie aktyna-Cy3 (klon 1A4, mysz monoklonalna)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Wykrywa komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych.</td></tr><tr><td>Anti-Endoglin (klon MJ7/18, szczur monoklonalny)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>Wykrywa komórki śródbłonka</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (klon MEC13.3, monoklonalny szczur)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Wykrywa komórki śródbłonka</td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin (klon 11D4.1, monoklonalny szczur)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>Wykrywa połączenia komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>Anti-Alk1 (koza poliklonalna)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>Wykrywa komórki</td></tr><tr> śródbłonka<td colspan="4"><silne>Przeciwciała drugorzędowe</td></tr><tr><td>Goat anty-królicza-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Kozia anty-szczura-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Kozia anty-szczura-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysza-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Osioł anty-koza-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 &#176;C.</td></tr><tr><td colspan="4">mikroskopy</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Aparat Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td><td>do mikroskopu preparacyjnego</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axioimager z kamerą Apotome</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kamera Zeiss</td><td>Axiocam HRm</td> do mikroskopu konfokalnego <td>Axioimager</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogeneza to złożony proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych, definiowany przez kiełkowanie nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejącej sieci naczyń. Angiogeneza odgrywa kluczową rolę nie tylko w prawidłowym rozwoju narządów i tkanek, ale także w wielu chorobach, w których tworzenie naczyń krwionośnych jest rozregulowane, takich jak nowotwory, ślepota i choroby niedokrwienne. W dorosłym życiu naczynia krwionośne są na ogół w stanie spoczynku, więc angiogeneza jest ważnym celem dla opracowania nowych leków, aby spróbować regulować tworzenie nowych naczyń, szczególnie w chorobie. Aby lepiej zrozumieć angiogenezę i opracować odpowiednie strategie jej regulacji, potrzebne są modele, które dokładnie odzwierciedlają różne etapy biologiczne, które są w nią zaangażowane. Siatkówka noworodka myszy stanowi doskonały model angiogenezy, ponieważ tętnice, żyły i naczynia włosowate rozwijają się, tworząc splot naczyniowy w pierwszym tygodniu po urodzeniu. Model ten ma również tę zaletę, że ma dwuwymiarową (2D) strukturę, dzięki czemu analiza jest prosta w porównaniu ze złożoną anatomią 3D innych sieci naczyniowych. Analizując splot naczyniowy siatkówki w różnym czasie po urodzeniu, można obserwować różne etapy angiogenezy pod mikroskopem. W tym artykule przedstawiono prostą procedurę analizy unaczynienia siatkówki myszy przy użyciu barwienia fluorescencyjnego izolektyną i przeciwciałami specyficznymi dla naczyń krwionośnych.

Po wypreparowaniu siatkówka powinna wyglądać jak płaski kwiat (Rycina 1). Stosując opisany powyżej protokół, komórki śródbłonka można uwidocznić za pomocą barwienia izolektyną B4-Alexa488, natomiast wspierające komórki mięśni naczyniowych wizualizuje się przy użyciu przeciwciał przeciwko alfa-aktynie mięśni gładkich (Rycina 2). Obraz przy niskim powiększeniu z użyciem obiektywu 5X na Rycynie 2 umożliwia uzyskanie ogólnego wglądu w organizację naczyniową siatkówki. Ponadt...

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie angiogenezy w siatkówce noworodka myszy. Osiąga się to poprzez najpierw enukleację oczu po urodzeniu, a następnie zastosowanie utrwalacza; trzecim krokiem jest ostrożne wycięcie siatkówki mysiej po urodzeniu w kształt płatka, a ostatnim krokiem jest barwienie naczyń krwionośnych siatkówki. Ostatecznie wizualizację naczyń krwionośnych siatkówki myszy uzyskuje się za pomocą barwienia fluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej.Procedurę tę zaprezentują dr Simon Tlo, stażysta podoktorski w moim laboratorium, oraz Kathleen Allenson, była członkini mojego laboratorium. W trakcie całej procedury domyślną temperaturą jest temperatura pokojowa. Należy rozpocząć od ułożenia humanitarnie uśmierconego szczenięcia myszy na boku przy użyciu nożyczek.Usuń skórę pokrywającą oko. Następnie, umieściwszy nożyczki poniżej oka, przetnij nerw wzrokowy oraz otaczające tkanki i wyjmij oko. Przenieś enukleowane oko do płytki 24-dołkowej zawierającej utrwalacz, którym jest 4%PFA w dwukrotnym rozcieńczeniu.PBS, następnie przystąp do preparowania kolejnego oka, podczas gdy pierwsze znajduje się w utrwalaczu. Przerwa między preparowaniem dwóch oczu powinna wynosić pół minuty. Wraz z praktyką.Pozostaw każde oko do utrwalenia na 10 do 15 minut. Następnie przenieś je do zimnego dwukrotnie płukanego PBS w lodzie na co najmniej 5 do 10 minut. Przed wyizolowaniem siatkówek zbierz do PBS taką liczbę oczu, jaka jest potrzebna, używając plastikowej pipety Pasteura z rozszerzonym końcem.Pod mikroskopem stereoskopowym przenieść gałki oczne do szalki Petriego zawierającej dwukrotny roztwór PBS. Za pomocą pęsety i nożyczek usunąć tkankę tłuszczową wokół oka. Przebić krawędź rogówki ostrymi nożyczkami, a następnie wyciąć rogówkę wraz z tęczówką i usunąć te tkanki.Następnie należy wprowadzić pęsetę między siatkówkę a twardówkę. Usunąć twardówkę, uważając, aby nie przerwać siatkówki. Można również usunąć warstwę naczyniówki, o ile nie istnieje ryzyko uszkodzenia siatkówki.Pozostawienie warstwy naczyniówki nie powinno znacząco wpłynąć na jakość barwienia immunocytochemicznego. Następnie za pomocą pęsety należy usunąć soczewkę oraz ciałko szkliste. Kolejnym krokiem jest usunięcie naczyń naczyniówki.Używając precyzyjnej pęsety, zbierz je w centrum oka. Następnie szybko odciągnij je od centrum siatkówki. Należy zachować szczególną ostrożność, aby usunąć cały żółty ostropest, ponieważ pozostawienie jego fragmentów może zakłócić otrzymane wyniki.Siatkówkę o kształcie czaszy należy teraz przenieść do czystej szalki Petriego i opłukać roztworem PBS. Następnie w siatkówce należy wykonać od czterech do pięciu nacięć radialnych, sięgających około dwóch trzecich drogi do centrum.Użyj nożyczek sprężynowych, aby wyciąć siatkówkę w kształcie płatka. Ten krok wymaga cierpliwości i praktyki, aby go dopracować. Następnie odciągnij większość PBS za pomocą pipety Pasteura. pozwoli to na spłaszczenie siatkówki. Następnie należy usunąć nadmiar PBS za pomocą małego kawałka papieru chłonnego. W kolejnym kroku należy nanosić metanol o temperaturze -20 °C kropla po kropli na powierzchnię siatkówki, aż zostanie ona w większości zanurzona, a następnie obficie dodać metanol.Siatkówki zmienią kolor na biały. Krok ten pomaga utrwalić siatkówki i ułatwi ich permeabilizację. Przenieś siatkówki z zimnego metanolu do małej probówki.Użyj plastikowej pipety o szerokim otworze. Pozostaw je do inkubacji w zimnym metanolu przez co najmniej 20 minut; w razie potrzeby siatkówki mogą pozostawać w metanolu w temperaturze -20°C przez kilka miesięcy. Przeciwciało stosowane wyłącznie w tej procedurze.Metoda filmowania (cine) nie może być z sukcesem zastosowana w przypadku utrwalonej siatkówki matczynej. W takim przypadku siatkówkę należy poddać bezpośrednio barwieniu immunologicznemu po jej rozprostowaniu do kształtu płatka. Należy rozpocząć od ostrożnego odpipetowania metanolu z siatkówek.Następnie należy szybko i delikatnie przepłukać siatkówki w 1x PBS. Usunąć PBS i pokryć siatkówki 100 µl roztworu blokującego perm z 5% odpowiedniego serum. Pozostawić siatkówki do delikatnego wstrząsania przez kolejną godzinę.Usunąć roztwór blokujący permeabilizację za pomocą pipety i zastąpić go 100 µL roztworu blokującego permeabilizację zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe lub izotyp kontrolny przed rozpoczęciem. Następnie inkubować siatkówki przez noc w temperaturze 4 °C w warunkach delikatnego kołysania. Następnego ranka przemyć siatkówki czterokrotnie w PBS TX, wykonując każde przemywanie przez 10 minut.Podczas wszystkich etapów płukania należy zastosować delikatne kołysanie. Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe nie jest koniugowane, należy dodać 100 µL odpowiedniego fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego, rozcieńczonego w stosunku 1:200 w PBS tx. Siatkówki należy inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu, a następnie usunąć przeciwciało wtórne.Przemyj siatkówki czterokrotnie w PBS TX, delikatnie kołysząc naczyniem przez 15 minut podczas każdego mycia. Następnie przejdź do montowania. Przenieś siatkówki na szkiełka przedmiotowe za pomocą plastikowej pipety o szerokim wylocie i usuń nadmiar P-B-S-T-X za pomocą chusteczki.Następnie zamocuj siatkówki w 50 µL Prolonged Gold i delikatnie przykryj roztwór szkiełkiem nakrywkowym. Aby umożliwić utrwalenie preparatu w Prolonged Gold, przechowuj slajdy w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem. Następnego dnia przystąp do obrazowania siatkówek po przeprowadzeniu sekcji.Siatkówka powinna przypominać płaski kwiat dzięki zastosowaniu przeciwciała anty-selectyna B4 Alexa 488. Komórki śródbłonka zostały zabarwione i mają kolor zielony. Wspierające komórki mięśni naczyniowych zwizualizowano za pomocą przeciwciała anty-aktyna mięśni gładkich. Obraz przy niskim powiększeniu, uzyskany za pomocą obiektywu 5×, pozwolił na ogólny wgląd w organizację naczyniową siatkówki dzięki zastosowaniu innej kombinacji przeciwciał.Komórki śródbłonka można zidentyfikować za pomocą barwienia immunocytochemicznego przeciwko CD 31, natomiast pasożyty wspierające wizualizowano przy użyciu przeciwciała przeciwko NG dwa. Alternatywnie pasożyty wspierające barwiono przeciwciałem przeciwko desminie. Barwienie przeciwko desminie pozwala na wizualizację palczastych wypustek pasożytów i pomaga określić, czy są one ściśle powiązane z komórkami śródbłonka.Z kolei barwienie przeciwciałem anty-NG2 obrysowuje jądra każdego pasożyta, co jest przydatne przy ilościowym określaniu liczby komórek pasożytniczych w naczyniach krwionośnych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, aby unikać dotykania i uszkadzania powierzchni siatkówki narzędziami do sekcji. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak barwienie BrdU, w celu zbadania proliferacji konkretnych komórek.

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Całkowite barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka mysiego w celu zbadania angiogenezy in vivo

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Naucz się barwienia immunofluorescencyjnego siatkówki noworodka myszy w celu badania angiogenezy in vivo. Ta metoda umożliwia wizualizację naczyń krwionośnych i analizę rozwoju układu naczyniowego.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Przeglądaj więcej filmów