Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych
1 września 2013
Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.
Ogólnym celem tej procedury jest uwidocznienie struktur subkomórkowych w mysich gruczołach ślinowych. Osiąga się to poprzez uprzednie chirurgiczne odsłonięcie gruczołów ślinowych bez ich uszkodzenia. W drugim etapie znieczulone zwierzę jest unieruchamiane na stoliku mikroskopowym.
Następnie gruczoły ślinowe są starannie ustawiane, aby nie zagrozić ich funkcji w ostatnim etapie. Mysz jest stabilizowana za pomocą niestandardowego uchwytu, aby zminimalizować wszelkie artefakty ruchu spowodowane biciem serca lub oddychaniem zwierzęcia. Ostatecznie dynamikę struktur subkomórkowych można zobrazować za pomocą mikroskopii intrażyciowej.
Przed znieczuleniem zważ myszy, aby określić odpowiednią dawkę środka znieczulającego. Następnie wywołaj znieczulenie wstępne przez inhalację fluoru. Gdy zwierzęta stracą przytomność, należy potwierdzić sedację co 15 minut za pomocą trzasku i trzymać myszy pod lampą grzewczą przez cały czas trwania operacji.
Monitoruj temperaturę ciała zwierząt za pomocą termometru z sondą doodbytniczą. Teraz ogol szyję myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia, a następnie użyj gąbki z gazy nasączonej etanolem, aby wytrzeć brzuszną stronę szyi, osuszając nadmiar alkoholu chusteczką kim. Następnie użyj pary, zakrzywionych pęset, aby podnieść mały kawałek skóry na dolnym końcu mięśni masytarza i wykonać małe nacięcie.
Włóż nożyczki do nacięcia, kierując końcówki do góry w kierunku spodu skóry i kilkakrotnie otwierając ostrza, aż skóra oddzieli się od leżącej pod spodem tkanki. Następnie zaczynając w pobliżu podstawy gruczołów ślinowych, gdzie przewód nerwowy i naczynia krwionośne łączą gruczoł z resztą ciała. Użyj nożyczek, aby wyciąć pasek luźnej skóry o szerokości trzech milimetrów i długości 10 milimetrów.
Po oczyszczeniu obszaru rany, powstały otwór będzie miał owalny kształt i będzie miał wymiary około ośmiu na 12 milimetrów. Oba gruczoły ślinowe będą widoczne. Użyj strzykawki, aby nałożyć żel sprzęgający optyczny na środek cięcia, a następnie użyj świeżych kawałków sterylnej gazy, aby wytrzeć żel w kierunku zewnętrznej strony otworu, aż cała krew i luźne włosy zostaną usunięte.
Teraz użyj pęsety numer siedem, aby znaleźć końcówkę prawego gruczołu ślinowego, chwytając tkankę łączną kilka milimetrów powyżej górnej części gruczołu. Następnie rozerwij tkankę łączną wokół gruczołu, nie uszkadzając miąższu. Po odsłonięciu gruczołu delikatnie oddziel tkankę łączną od gruczołu, zmywając krwawienie solą fizjologiczną.
Upewnij się, że wszystkie tkanki łączne są oddzielone, a gruczoł jest całkowicie odsłonięty. Przed przyniesieniem zwierzęcia do mikroskopu umieść gruby kawałek gazy i okład grzewczy na stoliku mikroskopu, przykrywając również górną część opakowania cienką gazą. Umieść szkiełko nakrywkowe na środku stołu montażowego.
Następnie ustaw mysz na prawym boku na gazie, zabezpieczając zwierzę kawałkiem taśmy maskującej po brzusznej stronie przedniej prawej łapy i jedwabnym szwem zaczepionym wokół siekaczy. Stwórz pewne napięcie między nicią a łapą i przymocuj je do sceny. Przy większej ilości taśmy maskującej gruczoł ślinowy powinien odpoczywać naturalnie.
W środku szkiełka nakrywkowego. Użyj plastikowych klinów połączonych ze stolikiem mikroskopu, aby dodatkowo ustabilizować głowę i klatkę piersiową myszy. Następnie umieść mały kawałek chusteczki do czyszczenia soczewek na gruczole.
Lekko rozciągnij dławik i umieść niestandardowy uchwyt na dławiku. Następnie mocno przymocuj stabilizator do sceny za pomocą metalowego zacisku i taśmy maskującej. Przykryj zwierzę gazą i poduszką grzewczą i monitoruj temperaturę odsłoniętych gruczołów za pomocą elastycznego termometru wyposażonego w sondę termiczną Natychmiast po ustabilizowaniu zwierzęcia użyj oświetlenia fluorescencyjnego epi, aby skupić się na powierzchni gruczołu.
Oceń przepływ krwi w naczyniach włosowatych i ogólną morfologię tkanki. Aby wzbudzić gen GFP, użyj lasera o długości fali 488 nanometrów. Ustaw moc szczytową na 0,5 miliwata, aby uniknąć fotowybielania białka pomidora tandemowego.
Użyj lasera o długości fali 561 nm, ustawiając moc szczytową na jeden miliwat. Teraz oceń stabilność tkanki, wstępnie skanując wybrany obszar. Jeśli preparat nie jest stabilny, odpowiednio wyreguluj zwierzę, aby znaleźć odpowiednią płaszczyznę ogniskowej.
W trybie wstępnym. Stopniowo przesuwaj obiektyw w kierunku szkiełka nakrywkowego, aż struktury aserowe, granulki wydzielnicze i błona plazmatyczna staną się wyraźnie widoczne. Następnie, aby zobrazować dynamikę granulek wydzielniczych, użyj prędkości skanowania od 0,5 do dwóch sekund na klatkę i 256 na 256 pikseli ze skalą przestrzenną 0,2 mikrometra na piksel.
Aby optymalnie uwidocznić granulki i błonę plazmatyczną, należy ustawić grubość optyczną w zakresie od 0,9 do 1,2 mikrometra. Następnie zapisz obraz pola widzenia, który ma być używany jako punkt odniesienia. Na koniec stymuluj egzocytozę, wstrzykując podskórnie 0,1 miligrama na kilogram świeżo przygotowanego izoproterenolu i soli fizjologicznej.
Jedna minuta po wstrzyknięciu. Fuzja granulek wydzielniczych z błoną plazmatyczną zostanie wykryta przez wzrost fluorescencji GFP wokół granulek i dyfuzję tandemowego peptydu pomidorowego do ich błon ograniczających. U myszy pomidorowej z GFPM azynina pojawia się jako wyraźnie wyraźne struktury, które wyrażają cytozolowy GFP i ukierunkowany na błonę tandemowy peptyd pomidorowy, jak wskazują przerywane linie.
W poszczególnych aser komórki są wyznaczone przez tandemowy peptyd pomidorowy, jak wskazano strzałkami. GFP wykrywa się również w jądrach, które są wyraźnie widoczne wewnątrz komórek aser. Cytozolowy GFP wskazywany przez grot strzałki jest wykluczony z granulek wydzielniczych, które pojawiają się jako ciemne okrągłe pęcherzyki o średnicy około jednego do 1,5 mikrometra.
Aby uwidocznić zdarzenia egzofityczne, po wstrzyknięciu izoproterenolu pokazano reprezentatywny obszar błony plazmatycznej, który jest wzbogacony w granulki wydzielnicze, jak wskazano gwiazdką. Można zaobserwować wzrost poziomu fluorescencji GFP oznaczony zielonymi strzałkami wokół niektórych granulek wydzielniczych, które znajdują się w bliskiej odległości od błony komórkowej. Ponadto, po fuzji z błoną plazmatyczną, tandemowy peptyd pomidorowy dyfunduje do błon ograniczających granulek wydzielniczych, jak zaznaczono czerwonymi strzałkami.
Po 30 do 40 sekundach granulki sekretarki stopniowo się zapadają, a ich błony ograniczające są integrowane z wierzchołkową błoną plazmatyczną. Zaprezentowane tutaj podejście stanowi duży przełom w biologii komórki, ponieważ umożliwia obrazowanie dynamiki specyficznego procesu transportu błonowego u żywych myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę wizualizowania struktur subkomórkowych w śliniankach gryzoni za pomocą mikroskopii intravitalnej. Procedura obejmuje chirurgiczne narażenie gruczołów, unieruchomienie zwierzęcia i staranne pozycjonowanie w celu zminimalizowania artefaktów ruchowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Techniki obrazowania
Tło
- Mikroskopia intravitalna pozwala na obrazowanie procesów biologicznych w czasie rzeczywistym.
- Jest szczególnie przydatna do badania dynamicznych struktur komórkowych.
- Śliwianki służą jako model do obserwacji dynamiki subkomórkowej.
- Zrozumienie tej dynamiki może dostarczyć wglądu w różne procesy fizjologiczne.
Cel badania
- Wizualizacja dynamiki struktur subkomórkowych u żywych myszy.
- Rozwój niezawodnej metody obrazowania ziaren wydzielniczych.
- Pogłębienie zrozumienia funkcji komórkowych w śliniankach.
Stosowane metody
- Chirurgiczne narażenie ślinianek bez uszkodzenia.
- Unieruchomienie znieczulonego zwierzęcia na scenie mikroskopu.
- Staranne pozycjonowanie ślinianek w celu zachowania ich funkcji.
- Użycie niestandardowego uchwytu do stabilizacji myszy i zmniejszenia artefaktów ruchowych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja struktur subkomórkowych w żywych śliniankach.
- Demonstracja dynamiki ziaren wydzielniczych.
- Walidacja metody dla przyszłych badań na żywych modelach zwierzęcych.
- Wgląd w fizjologiczne role tych struktur.
Wnioski
- Metoda zapewnia solidne podejście do badania dynamiki subkomórkowej.
- Mikroskopia intravitalna może być stosowana w różnych dziedzinach badań biologicznych.
- Ta technika zwiększa nasze zrozumienie procesów komórkowych in vivo.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Intravital microscopy enables real-time visualization of subcellular dynamics in live animal models, providing critical mechanistic insights for target validation and pathway analysis. By imaging secretory granule exocytosis and membrane trafficking in salivary glands, this method supports preclinical de-risking of GPCR-mediated signaling pathways relevant to metabolic and secretory disease targets. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular perturbations to functional subcellular outputs in a physiologically relevant context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of beta-adrenergic receptor-stimulated secretory granule fusion, supporting functional validation of GPCR targets in live tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible platform to interrogate kinase, phosphatase, or cytoskeletal regulators of exocytosis using fluorescent biosensors.
- Therapeutic Value: Facilitates mechanistic de-risking of compounds targeting cAMP/PKA pathways by quantifying subcellular translocation kinetics in real time.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Stabilized salivary gland preparation allows consistent baseline imaging of GFP and tandem-Tomato signals for compound library screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of granule fusion frequency, membrane diffusion rates, and collapse kinetics as functional readouts for pathway modulation.
- Scalability: The surgical stabilization and imaging workflow can be adapted to multi-animal studies with standardized thermal and motion control.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models regulated secretion in exocrine tissues, applicable to pancreatitis, Sjogren’s syndrome, or cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) dysfunction studies.
- Biomarker Continuity: Fluorescent reporters for granule membranes and cytosol enable correlation of imaging endpoints with biochemical assays of secretion.
- Preclinical De-risking: Supports go/no-go decisions by linking target engagement to functional subcellular outcomes before organ-level phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where real-time subcellular imaging informs mechanism of action and pathway selectivity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of GPCR effector pathways by visualizing downstream effector recruitment and membrane dynamics in intact tissue.
- Screening: Enables assay-ready preparations for evaluating compound effects on exocytosis kinetics with spatial and temporal resolution.
- Analytics: Generates quantitative data on fluorescence intensity shifts, diffusion rates, and vesicle collapse timing to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular targeting to functional secretion in a disease-relevant exocrine model, supporting extrapolation to human pathophysiology.
- Enterprise Reuse: The stabilization and imaging platform can be reused across multiple fluorescent reporters and disease models with minimal revalidation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in signal transduction by providing direct visualization of effector translocation and membrane integration events.
- Operational Value: Standardized immobilization and imaging protocol improves reproducibility across laboratories and study timelines.
- Strategic Value: Enables earlier identification of false-positive hits by confirming functional subcellular activity beyond binding or bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Increases confidence in target selection by validating pathway engagement in a physiologically intact, dynamic cellular environment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, anesthesia, and intravital microscopy setup.
- Dependent on confocal microscope with 488 nm and 561 nm laser lines, thermal stage, and motion stabilization hardware.
- Necessitates standardized animal preparation protocols to ensure gland accessibility and functional stability across experiments.
- Adaptation to other tissues may require modified stabilization approaches due to differences in organ mobility and accessibility.
- Photobleaching limits necessitate careful laser power calibration and frame rate selection for longitudinal imaging.
