Name: Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-01T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżyciową do obrazowania struktur subkomórkowych w gruczołach ślinowych myszy. Ta metoda pozwala badać dynamikę ziaren sekrecyjnych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Badań Wewnątrzściennych NIH, Narodowego Instytutu Badań Stomatologicznych i Twarzoczaszkowych.

Część 1: Mikroskop i przygotowanie zestawu do obrazowania
<ol>
	<li>Każdy odwrócony mikroskop konfokalny powinien być odpowiedni do IVM. W pracy wykorzystano mikroskop odwrócony Olympus IX81, wyposażony w laserowy skaningowy zespół konfokalny Fluoview-1000. Aby osiągnąć najlepszą możliwą rozdzielczość, zaleca się stosowanie obiektywów o wysokiej NA, takich jak zanurzenie w wodzie UPLSAPO 60x/1.20 NA i zanurzenie w oleju Plan-Apo 60x/1.42 NA. Obiektywy immersyjne z olejkiem mają wyższą skuteczność zbierania i chociaż wymagają użycia szkiełka nakrywkowego między tkanką a obiektywem, zapewniają lepszą jakość obrazowania, gdy są używane do obrazowania obszarów w odległości 15-20 μm od powierzchni. Dodatkowo zastosowanie oleju eliminuje obawy o parowanie wody podczas dłuższych sesji obrazowania. Aby utrzymać temperaturę i wilgotność, mikroskop powinien być całkowicie zamknięty i zasilany ciepłym i nawilżonym powietrzem. Alternatywnie, zwierzę, stolik mikroskopowy i obiektyw muszą być ogrzane w inny sposób. Na przykład chemiczne poduszki grzewcze mogą być używane do zwierzęcia i sceny, a specjalnie zaprojektowane grzejniki obiektywowe mogą być używane do obiektywu (rysunek 1A). Grzałka obiektywu powinna być włączona na 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu. Uwaga: gdy poduszki grzewcze są używane do utrzymywania zwierzęcia w cieple, gaza musi zostać umieszczona między podkładką a skórą. Skóra musi być monitorowana pod kątem oparzeń.</li>
	<li>Standardowe stoliki w większości dostępnych na rynku mikroskopów konfokalnych mają otwór, który służy do wkładania różnych uchwytów, które są używane do pasowania szkiełek, szalek Petriego i płytek o różnych rozmiarach. W celu wykonania IVM standardowa wkładka stolika dla szalek Petriego o średnicy 35 mm jest odwrócona do góry nogami, przykryta szkiełkiem o średnicy 40 mm, która jest następnie zabezpieczana wysokopróżniowym smarem silikonowym lub taśmą maskującą (rysunek 1A). Wkładka niestandardowa może być również wykonana z płyty aluminiowej o grubości 3 mm. Szklana powierzchnia jest następnie czyszczona 70% etanolem i przecierana za pomocą Kimwipe.</li>
	<li>Wyprodukuj niestandardowy uchwyt do unieruchomienia SG (stabilizatora). Zadaniem uchwytu jest ustabilizowanie SG na miejscu i sztywne połączenie ich ze stolikiem i szkiełkiem nakrywkowym. Uchwyt może być wykonany z plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 mm. Najpierw dno naczynia odłamuje się od ścianek i kroi na prostokąty o wymiarach około 15 x 10 mm. Następnie krawędzie są zaokrąglane i polerowane za pomocą drobnego papieru ściernego. Cztery przekładki (1,5-2 mm) są budowane poprzez usunięcie gumowych końcówek tłoków strzykawek o pojemności 1 ml. Za pomocą drobnego papieru ściernego powierzchnia przekładek i cztery rogi plastikowego elementu są polerowane. Przekładki są następnie klejone za pomocą galaretowatego kleju superglue, a następnie wygładzane drobnym papierem ściernym na płaskiej powierzchni. Należy pamiętać, że w przypadku starszych zwierząt może być konieczne zwiększenie rozmiaru uchwytów i przekładek, aby pomieścić nieco większe gruczoły.</li>
	<li>Przygotowanie żelu do sprzęgania optycznego. 0,3% żelu Carbomer-940 (Tabela 2) przygotowuje się przez podgrzanie 100 ml ultraczystej wody i rozpuszczenie 5,47 g D-Sorbitolu. Następnie dodaje się 0,3 g Carbomer-940. Zlewkę należy przykryć i umieścić na mieszającej płycie grzejnej (najniższe ustawienie grzania) na kilka godzin lub do momentu, gdy wszystkie grudki karbomeru całkowicie się rozpuszczą. Na koniec trietanolaminę dodaje się kroplami, delikatnie mieszając, aż do osiągnięcia pH około 7,4. Żel jest przechowywany w temperaturze 4 °C 13.</li>
</ol>
Część 2: Zwierzęta i znieczulenie
<ol>
	<li>Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach protokoły powinny zostać zatwierdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i etyki. Co ważne, badacze powinni być odpowiednio przeszkoleni w zakresie wykonywania zabiegów chirurgicznych i przed przystąpieniem do zabiegu powinni skonsultować się z lokalną komisją ds. opieki nad zwierzętami lub lekarzem weterynarii.</li>
	<li>W tym badaniu wykorzystano model mysi (GFP / mTomato-mouse) uzyskany przez skrzyżowanie myszy FVB z ekspresją rozpuszczalnego GFP (GFP-mouse) z myszami C57B6 wykazującymi ekspresję ukierunkowanego na błonę peptydu połączonego z fluorescencyjnym białkiem tandem-Tomato (mTomato-mouse) 6. Uwaga: zwykle potrzeba 20-30 minut, aby zwierzę zostało w pełni znieczulone i przygotowane do obrazowania</li>
	<li>Myszy są trzymane w kontrolowanym środowisku w pomieszczeniu dla zwierząt i mogą się zaaklimatyzować przez tydzień przed eksperymentem. Ten krok jest konieczny do obrazowania SG, ponieważ każdy niepokój powoduje zwiększoną aktywność wydzielniczą12. Woda i jedzenie są dostarczane ad libitum. Do eksperymentów obrazowych wykorzystuje się samce w wieku od 2 do 5 miesięcy (20-30 g).</li>
	<li>Przed znieczuleniem należy zważyć zwierzęta, aby określić odpowiednią dawkę środka znieczulającego.</li>
	<li>Ponieważ stres wywołany podawaniem środków znieczulających do wstrzykiwań może upośledzać aktywność wydzielniczą SG, należy wywołać znieczulenie wstępne przez inhalację izofluranu, a następnie wstrzyknięcie środków znieczulających. W tym celu należy bardzo delikatnie umieścić myszy w komorze parownika i włączyć przepływ tlenu (800-900 mmHg). Ustaw poziom izofluranu na 3%, aby rozpocząć indukcję przed znieczuleniem.</li>
	<li>Gdy zwierzęta stracą przytomność, wstrzyknąć mieszaninę 100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny do jamy otrzewnowej (igła 25 G). Środki znieczulające są świeżo przygotowywane przez rozcieńczenie 100 mg/ml ksylazyny do 20 mg/ml w soli fizjologicznej, a następnie zmieszanie jej z ketaminą. Mieszaninę tę rozcieńcza się następnie w stosunku 1:1 solą fizjologiczną i wstrzykuje odpowiednią ilość w zależności od masy ciała zwierzęcia. To rozcieńczenie pomaga w zapobieganiu przypadkowemu przedawkowaniu. Należy pamiętać, że mieszanina traci swoją skuteczność po 20 minutach.</li>
	<li>Należy obserwować zwierzęta pod kątem oznak czuwania i wstrzykiwać większą ilość mieszanki znieczulającej, jeśli wychodzą z narkozy (około 75% dawki początkowej w ciągu 45 minut po pierwszym wstrzyknięciu i 50% co godzinę po wstrzyknięciu). Sprawdzaj głębokość znieczulenia co 15 minut, szczypiąc łapę i obserwując reakcję. Uwaga: Zawsze podawaj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Środki znieczulające wywołują hipotermię, która może wpływać na powtarzalność eksperymentów i zdrowie zwierzęcia. Dlatego myszy powinny być trzymane pod lampą grzewczą lub na podgrzewanej podkładce przez cały czas trwania eksperymentu. Uwaga: lampa grzewcza powinna znajdować się co najmniej 12-18 cali od zwierzęcia, aby zapobiec poparzeniu</li>
	<li>Temperatura ciała zwierząt musi być monitorowana za pomocą termometru wyposażonego w sondę temperatury w odbycie.</li>
</ol>
Część 3: Chirurgia zwierząt i pozycjonowanie w mikroskopii przyżyciowej
<ol>
	<li>Przygotuj miejsce pracy ze wszystkimi narzędziami chirurgicznymi (Tabela 1), które powinny być czyste i sterylne.</li>
	<li>Ogol obszar szyi myszy za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Przetrzyj brzuszną stronę szyi znieczulonej myszy gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem. Osusz nadmiar chusteczką Kimwipe.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionej pęsety podnieś mały kawałek skóry w linii środkowej (mniej więcej na dolnym końcu mięśni żwaczy) i wykonaj małe nacięcie (ryc. 1B).</li>
	<li>Włóż nożyczki do otworu i oddziel skórę od leżącej pod nią tkanki, otwierając ostrza nożyczek. Unikaj uszkadzania leżącej poniżej tkanki gruczołowej, kierując nożyczki w górę w kierunku spodu skóry. Powtórz ten krok kilka razy, aż skóra zostanie oddzielona od głębszych tkanek (ryc. 1B).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wytnij pasek poluzowanej skóry o szerokości około 3 mm i długości 10 mm. Skórę należy przeciąć tak, aby otwór zaczynał się w pobliżu podstawy SG, gdzie nerw, przewód i naczynia krwionośne łączą gruczoł z resztą ciała. Po oczyszczeniu obszaru rany, powstały otwór będzie miał owalny kształt i wymiary około 8 x 12 mm. Oba SG będą widoczne po otwarciu (Rysunek 1B).</li>
	<li>Za pomocą strzykawki nałóż żel sprzęgający optyczny na środek nacięcia i wytrzyj go na zewnątrz sterylną gazą. Do każdej chusteczki należy używać czystych kawałków gazy, aby zapobiec przedostawaniu się włosów lub krwi do odsłoniętej tkanki. Powtarzaj ten krok, aż cała krew i luźne włosy zostaną usunięte.</li>
	<li>Za pomocą pęsety #7 oddziel tkankę łączną od prawego gruczołu podżuchwowego aż do podstawy gruczołu (alternatywnie ten protokół można zastosować na lewym SG). Najpierw znajdź końcówkę SG i chwyć tkankę łączną kilka milimetrów powyżej czubka gruczołu. Rozerwij tkankę łączną wokół gruczołu, nie uszkadzając miąższu. (Rysunek 1B). Po odsłonięciu gruczołu delikatnie oddziel tkankę łączną od gruczołu. Jeśli wystąpi krwawienie, zmyj krew solą fizjologiczną. Upewnij się, że wszystkie tkanki łączne są oddzielone, a gruczoł jest całkowicie odsłonięty. Utrzymuj gruczoł wilgotny, regularnie nakładając żel do sprzęgania optycznego.</li>
	<li>Przed przyniesieniem zwierzęcia do mikroskopu należy umieścić gruby kawałek gazy i pakiet grzewczy na stoliku mikroskopu, aby utrzymać temperaturę 38 ± 2 °C. Temperaturę chemicznego pakietu grzewczego można regulować w zależności od wielkości nacięć, które wystawiają wewnętrzną torebkę na działanie atmosfery. Gaza zapewnia pewną izolację pakietu grzewczego od etapu metalowego. Przykryj również górną część opakowania grzewczego cienkim kawałkiem gazy.</li>
	<li>Ułóż zwierzę na boku (prawa strona dla prawego gruczołu) i na gazie. Umieść zwierzę tak, aby gruczoł ślinowy podżuchwowy znajdował się pośrodku szkiełka nakrywkowego (ryc. 1C).</li>
	<li>Zwierzę powinno być zabezpieczone i ustabilizowane w tej pozycji przed unieruchomieniem gruczołu. Umieść kawałek taśmy maskującej po brzusznej stronie przedniej prawej łapy myszy. Zaczep siekacze myszy jedwabnym szwem (ryc. 1C, wstawka). Stwórz pewne napięcie między jedwabną nicią a łapą i przymocuj je do sceny za pomocą taśmy maskującej. SG powinien spoczywać naturalnie w środku szkiełka nakrywkowego. Głowa i klatka piersiowa powinny być dodatkowo stabilizowane plastikowymi klinami, które można połączyć ze sceną.</li>
	<li>Umieść mały kawałek chusteczki do czyszczenia soczewek na gruczole (Rysunek 1C). Lekko rozciągnij dławik i umieść niestandardowy uchwyt na dławiku. Mocno przymocuj stabilizator do sceny za pomocą taśmy maskującej. Sprzężenie można poprawić za pomocą metalowego zacisku podłączonego do stolika (rysunek 1C). Należy unikać napięć i ostrych kątów, ponieważ mogą one utrudniać przepływ krwi. Natychmiast po ustabilizowaniu należy sprawdzić przepływ krwi, badając gruczoł wizualnie (powinien zachować różowe zabarwienie) lub przez epifluorescencję. U myszy z GFP/m-pomidorem można łatwo ocenić poważne zmiany w przepływie krwi, ponieważ zarówno naczynia krwionośne, jak i kilka komórek krwi są oznaczone m-pomidorem.</li>
	<li>Przykryj zwierzę gazą i podgrzewaną podkładką. Zmierz temperaturę odsłoniętego dławika za pomocą termometru wyposażonego w małą elastyczną sondę termopary umieszczoną w kontakcie z jedną stroną odsłoniętego dławika.</li>
</ol>
Część 4: Parametry obrazowania
<ol>
	<li>Korzystając z oświetlenia epifluorescencyjnego, skoncentruj się na powierzchni gruczołu za pomocą GFP lub zestawu filtrów RFP. Znajdź powierzchnię SG i oceń przepływ krwi w naczyniach włosowatych oraz ogólną morfologię tkanki. Oznaki uszkodzenia tkanek obejmują pęcherzenie błony lub pojawienie się dużych wakuoli.</li>
	<li>Oceń stabilność tkanki za pomocą epifluorescencji lub wstępnego skanowania wybranego obszaru. Stabilne przygotowanie jest niezbędne, ponieważ większości artefaktów ruchu nie można usunąć ani skorygować w analizie danych po przetworzeniu. Jeśli preparat nie jest stabilny, wymagane są regulacje.</li>
	<li>Aby znaleźć właściwy obraz płaszczyzny ogniskowej, gruczoły są w trybie wstępnego skanowania (1-krotny zoom) i stopniowo przesuwaj obiektyw w kierunku szkiełka nakrywkowego, aż struktury groniaste, granulki wydzielnicze i błona plazmatyczna staną się wyraźnie widoczne (ryc. 2).</li>
	<li>Parametry obrazowania dla filmu poklatkowego zależą od indywidualnego eksperymentu. Aby zobrazować dynamikę granulek wydzielniczych, należy użyć prędkości skanowania 0,5-2 sek./klatkę i 256 x 256 pikseli ze skalą przestrzenną 0,2 μm/piksel (pole widzenia około 50 μm x 50 μm). W celu optymalnego uwidocznienia granulek i błony plazmatycznej, grubość optyczną należy ustawić w zakresie 0,9-1,2 μm. Aby wzbudzić GFP i tandem-Tomato, można użyć długości fali odpowiednio 488 nm i 561 nm. Moc szczytowa wynosi około 0,5 mW dla długości fali 488 nm i 1 mW dla długości fali 561 nm. Zapewnia to minimalne fotowybielanie.</li>
	<li>Ustawienia detektora muszą być dostosowane, aby utrzymać sygnał w zakresie dynamicznym i zależeć od jasności próbki.</li>
	<li>Po ustawieniu wszystkich parametrów można rozpocząć obrazowanie. Najpierw zrób migawkę pola widzenia, które ma być używane jako punkt odniesienia. Podczas obrazowania poklatkowego może wystąpić dryf tkanki w XY i Z. Można to skompensować ręcznie, dostosowując obszar skanowania i pozycję Z. Korekty powinny być dokonywane stopniowo i małymi krokami, aby uniknąć artefaktów. Co więcej, obraz referencyjny może być wykorzystany do określenia, czy występuje fotowybielanie. W przypadku wykrycia znacznego fotowybielania (zmniejszenie fluorescencji o ponad 15-20%) należy zmniejszyć moc lasera o 0,1 mW.</li>
	<li>W celu pobudzenia egzocytozy należy wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg świeżo przygotowanego roztworu izoproterenolu w roztworze soli fizjologicznej. Egzocytoza jest wywoływana po około 1 minucie od wstrzyknięcia. Granulki wydzielnicze łączące się z błoną plazmatyczną zostaną wykryte przez wzrost fluorescencji GFP wokół granulek i dyfuzję peptydów tandemowych pomidorów do ich błon ograniczających (ryc. 3). Zalecamy wykonanie 3-4 sekwencji poklatkowych w tym samym obszarze, każda po 10 minut.</li>
	<li>Po sesji obrazowania należy poddać znieczulone zwierzę eutanazji poprzez wdychanie CO2 w komorze eutanazyjnej (10-12 mmHg przez 10 min).</li>
</ol>

<ol><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+%28%2A%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+exocytosis%3A+novel+insights+from+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li>
<li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li>
<li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium%3A+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li>
<li>Sramkova, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSramkova%2C+M+%22Current+Frontiers+and+Perspectives+in+Cell+Biology%22">Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology</a>. Najman, S. , Intech. (2012).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy%3A+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li>
<li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li>
<li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li>
<li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li>
<li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li>
<li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li>
</ol>

Do tej pory struktury subkomórkowe były obrazowane głównie w systemach modelowych in vitro (tj. hodowle komórkowe) lub ex vivo (tj. hodowle narządów, wycinki tkanek, preparaty groniaste), które często nie oddają cech nienaruszonych żywych tkanek 6. Pod tym względem przedstawione tutaj podejście stanowi duży przełom, ponieważ umożliwia obrazowanie dynamiki określonego etapu transportu błonowego (tj. regulowanej egzocytozy) u żywych myszy.	
	<p class="jove_content...

W ciągu ostatnich dwóch dekad pojawienie się mikroskopii na żywo i użycie białek fluorescencyjnych doprowadziło do przełomu w każdym procesie komórkowym, jaki można sobie wyobrazić, pogłębiając tym samym nasze zrozumienie biologii komórki 1. Dziedzina ta odniosła ogromne korzyści dzięki wykorzystaniu kultur komórek ssaków, które są niezwykle potężnymi systemami modelowymi, szczególnie jeśli chodzi o manipulacje eksperymentalne. Jednak często nie zapewniają one prawdziwej reprezentacji biologii złożonych organizmów wielokomórkowych 2. Kwestia ta zaczęła być rozwiązywana poprzez rozwój mikroskopii przyżyciowej (IVM), która otworzyła drzwi do badania kluczowych pytań biologicznych w dziedzinach takich jak neurobiologia, immunologia i biologia nowotworów 3. Do tej pory większość badań opartych na IVM przeprowadzono na poziomie tkanek i pojedynczych komórek, nie dostarczając żadnych informacji na temat dynamiki kompartmentów subkomórkowych. Ostatnio nasze laboratorium i inne opracowały techniki IVM zdolne do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych gryzoni 4-7, 13-15 i umożliwiające manipulacje farmakologiczne i genetyczne in vivo. Podejście to zostało przez nas wykorzystane do badania transportu błonowego in vivo, a dokładniej endocytozy i regulowanej egzocytozy 6,7.
Nasz eksperymentalny system modelowy opiera się na ekspozycji, stabilizacji i obrazowaniu podżuchwowych gruczołów ślinowych (SG) znieczulonych gryzoni. Wybór SG jako narządu modelowego dla IVM wynika z faktu, że gruczoły są łatwo dostępne po wykonaniu drobnej operacji, mogą być eksternalizowane bez uszczerbku dla ich fizjologii i stabilizowane w celu zmniejszenia artefaktów ruchowych spowodowanych biciem serca i oddychaniem. Ponadto SG mogą być selektywnie manipulowane genetycznie poprzez wstrzykiwanie wektorów wirusowych lub niewirusowych przez przewód ślinowy 8,9. Wreszcie, SG to gruczoły zewnątrzwydzielnicze zbudowane ze spolaryzowanych komórek nabłonkowych, które tworzą acini i przewody, komórki mioepitelialne i złożoną populację komórek zrębu. Z tego powodu są doskonałym modelem do badania egzocytozy, endocytozy, dostarczania genów i cytoszkieletu aktynowego, jak podkreślono w naszych ostatnich badaniach 10, a także oferują możliwość badania aspektów biologii komórki, takich jak polaryzacja komórki, podział komórki, połączenia komórka-komórka i kanały jonowe.
W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół obrazowania do osiągnięcia subkomórkowej rozdzielczości w nabłonku SG żywej myszy. W szczególności pokazujemy, jak obrazować ziarnistości wydzielnicze w komórkach groniastych SG podczas regulowanej egzocytozy. Jak wykazano wcześniej, po stymulacji agonistami receptora beta-adrenergicznego, ziarnistości wydzielnicze łączą się z wierzchołkową błoną plazmatyczną i stopniowo zapadają się, uwalniając swoją zawartość do kanalików groniastych 6. Naszym celem jest dostarczenie podstawowych narzędzi badaczom z minimalnym doświadczeniem w zabiegach chirurgicznych i obchodzeniu się ze zwierzętami, tak aby mogli z powodzeniem wykonywać IVM w rozdzielczości subkomórkowej. Ponieważ najtrudniejszą częścią IVM jest przygotowanie zwierzęcia, tutaj skupiamy się na opisie podstawowych procedur chirurgicznych, które są wykorzystywane do odsłonięcia i unieruchomienia SG bez uszczerbku dla ich funkcji. Jeśli chodzi o procedury znakowania struktur subkomórkowych, kilka strategii, takich jak ogólnoustrojowe dostarczanie sond fluorescencyjnych, wykorzystanie zwierząt transgenicznych lub kombinacja obu, zostało opisanych w innym miejscu 7,11.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik</td></tr><tr><td>Isoflourane (Forane)</td><td>Baxter</td><td>101936-40</td><td>Uchwyt pod kapturem chemicznym</td></tr><tr><td>Ketamina (ketaved)</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>57457-034-10</td><td>Roztwór podstawowy 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna (Anased)</td><td>Akorn, Decatur</td><td>61311-481-10</td><td>Roztwór podstawowy 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Neomycyna/Polimyksyna B</td><td>Bausch i Lomb</td><td>24208-785-55</td><td>Służy do smarowania oka myszy</td></tr><tr><td>Carbomer-940</td><td>Ashalnd, Inc.</td><td>4607-1</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279</td><td>Dodawać kroplami, aby zapobiec zestaleniu się roztworu</td></tr><tr><td>Isoproternol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16504</td><td>W razie potrzeby przygotować świeże roztwory w soli fizjologicznej. Zapasy mogą być przechowywane w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Isoflurane V 1.9 (waporyzator)</td><td>Braintree Scientific</td><td>190AF</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny stół zstępujący wyposażony w filtr HEPA</td><td>Hazard Technology</td><td>PDDT</td><td></td></tr><tr><td>Lampa grzewcza, model HL1</td><td>Braintree Scientific</td><td>HL-1 US</td><td></td></tr><tr><td>MicroTherma 2T Termometr</td><td>Braintree Scientific</td><td>TW2</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne (11,5 cm proste</td><td>World Precision Instruments</td><td>5003708-12</td><td></td></tr><tr><td>#7 pęseta z zakrzywioną końcówką</td><td>World Precision Instruments</td><td>14187</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>World Precision Instruments</td><td>503365</td><td></td></tr><tr><td>pleciony jedwabny szew #4.0</td><td>George Tiemann Co</td><td>160-1219-4</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki z gazy 2 "x 2"</td><td>Tyco Healthcare</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczka do czyszczenia soczewek</td><td>Olympus</td><td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania struktur subkomórkowych u żywych gryzoni, która opiera się na użyciu konfokalnej mikroskopii przyżyciowej. Jako narząd modelowy używamy gruczołów ślinowych żywych myszy, ponieważ mają one kilka zalet. Po pierwsze, można je łatwo naświetlić, aby umożliwić dostęp do optyki, i ustabilizować, aby ułatwić redukcję artefaktów ruchu spowodowanych biciem serca i oddychaniem. To znacznie ułatwia obrazowanie i śledzenie małych struktur subkomórkowych. Po drugie, większość populacji komórek gruczołów ślinowych jest dostępna z powierzchni narządu. Pozwala to na zastosowanie mikroskopii konfokalnej, która ma wyższą rozdzielczość przestrzenną niż inne techniki stosowane do obrazowania in vivo, takie jak mikroskopia dwufotonowa. Wreszcie, gruczołami ślinowymi można łatwo manipulować farmakologicznie i genetycznie, zapewniając w ten sposób solidny system do badania procesów biologicznych na poziomie molekularnym.
W tym badaniu skupiamy się na protokole zaprojektowanym do śledzenia kinetyki egzocytozy granulek wydzielniczych w komórkach groniastych oraz dynamiki wierzchołkowej błony plazmatycznej, gdzie granulki wydzielnicze łączą się po stymulacji receptorów beta-adrenergicznych. W szczególności użyliśmy transgenicznej myszy, która wykazuje współekspresję cytozolowego GFP i peptydu ukierunkowanego na błonę połączonego z białkiem fluorescencyjnym tandem-Tomato. Jednak procedury, które zastosowaliśmy do stabilizacji i obrazowania gruczołów ślinowych, można rozszerzyć na inne modele myszy i połączyć z innymi podejściami do znakowania składników komórkowych in vivo, umożliwiając wizualizację różnych struktur subkomórkowych, takich jak endosomy, lizosomy, mitochondria i cytoszkielet aktynowy.

U myszy GFP/mTomato acini jawią się jako wyraźnie odrębne struktury, wykazujące ekspresję cytozolowego GFP oraz celowanego w błonę peptydu tandem-Tomato (Rysunek 2, przerywana linia). W poszczególnych acini komórki acinarne są obrysowane przez peptyd tandem-Tomato. GFP wykryto również w jądrach komórkowych, które są wyraźnie widoczne wewnątrz komórek acinarnych (Rysunek 2, strzałki). Cytozolowe GFP jest wykluczone z ziarnistości wydzielniczych, które pojawiają się jako ciemne koliste pęc...

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja struktur subkomórkowych w gruczołach ślinowych myszy. Jest to realizowane poprzez wstępne chirurgiczne odsłonięcie gruczołów ślinowych bez ich uszkadzania. W drugim kroku znieczulone zwierzę zostaje unieruchomione na stole mikroskopu.Następnie ślinianki są ostrożnie ustawiane tak, aby nie upośledzić ich funkcji w końcowym etapie. Myszy stabilizuje się za pomocą specjalistycznego uchwytu, aby zminimalizować wszelkie artefakty ruchowe wynikające z bicia serca lub oddychania zwierzęcia. Ostatecznie dynamika struktur podkomórkowych może być obrazowana za pomocą mikroskopii intravitalnej.Przed znieczuleniem zważ myszy, aby określić odpowiednią dawkę środka znieczulającego. Następnie wprowadź znieczulenie wstępne poprzez inhalację izofluranem. Gdy zwierzęta stracą przytomność, co 15 minut potwierdzaj stopień sedacji za pomocą odruchu zaciśnięcia skóry w okolicy opuszka łapy oraz utrzymuj myszy pod lampą grzewczą przez cały czas trwania operacji.Monitoruj temperaturę ciała zwierząt za pomocą termometru z sondą rektalną. Następnie ogól szyję myszy za pomocą maszynki elektrycznej, a potem użyj nasączonej etanolem gazy, aby przetrzeć brzus

intravital-microscopy-for-imaging-subcellular-structures-live-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia intravitalna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy ekspresujących białka fluorescencyjne

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

W tym filmie opisujemy obrazowanie trzustki myszy w trybie przyżyciowym przez ustabilizowane okno do długoterminowej wizualizacji dynamiki komórkowej.

Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Opisujemy protokół chirurgicznego odsłaniania i stabilizacji mysiego podżuchwowego gruczołu ślinowego do obrazowania przyżyciowego za pomocą pionowej mikroskopii przyżyciowej. Protokół ten można łatwo dostosować do innych gruczołów zewnątrzwydzielniczych okolicy głowy i szyi myszy i innych małych gryzoni.

Przygotowanie mysiego śliniaka podżuchwowego do pionowej mikroskopii przyżyciowej

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj mikroskopię przyżyciową do obrazowania struktur subkomórkowych w gruczołach ślinowych myszy. Ta metoda pozwala badać dynamikę ziaren sekrecyjnych in vivo.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów