Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych
1 września 2013
Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja struktur subkomórkowych w gruczołach ślinowych myszy. Jest to realizowane poprzez wstępne chirurgiczne odsłonięcie gruczołów ślinowych bez ich uszkadzania. W drugim kroku znieczulone zwierzę zostaje unieruchomione na stole mikroskopu.
Następnie ślinianki są ostrożnie ustawiane tak, aby nie upośledzić ich funkcji w końcowym etapie. Myszy stabilizuje się za pomocą specjalistycznego uchwytu, aby zminimalizować wszelkie artefakty ruchowe wynikające z bicia serca lub oddychania zwierzęcia. Ostatecznie dynamika struktur podkomórkowych może być obrazowana za pomocą mikroskopii intravitalnej.
Przed znieczuleniem zważ myszy, aby określić odpowiednią dawkę środka znieczulającego. Następnie wprowadź znieczulenie wstępne poprzez inhalację izofluranem. Gdy zwierzęta stracą przytomność, co 15 minut potwierdzaj stopień sedacji za pomocą odruchu zaciśnięcia skóry w okolicy opuszka łapy oraz utrzymuj myszy pod lampą grzewczą przez cały czas trwania operacji.
Monitoruj temperaturę ciała zwierząt za pomocą termometru z sondą rektalną. Następnie ogól szyję myszy za pomocą maszynki elektrycznej, a potem użyj nasączonej etanolem gazy, aby przetrzeć brzuszna stronę szyi, osuszając nadmiar alkoholu ręcznikiem papierowym typu Kimwipe. Następnie za pomocą tępych pęsety zakrzywionej unieś niewielki fragment skóry w dolnej części mięśni żwaczy i wykonaj małe nacięcie.
Wprowadź nożyczki w miejsce nacięcia, kierując końcówki w górę, w stronę spodniej strony skóry, i otwórz ostrza kilkukrotnie, aż skóra oddzieli się od leżącej pod nią tkanki. Następnie zacznij w okolicy podstawy ślinianek, w miejscu, gdzie przewód nerwowy i naczynia krwionośne łączą gruczoł z resztą organizmu. Za pomocą nożyczek wytnij pas rozluźnionej skóry o szerokości 3 mm i długości 10 mm.
Po oczyszczeniu obszaru rany powstały otwór będzie miał kształt owalny i wymiary około 8 na 12 mm. Oba ślinianki będą widoczne. Za pomocą strzykawki nanieś żel sprzęgający optycznie na środek nacięcia, a następnie użyj świeżych kawałków sterylnej gazy, aby rozprowadzić żel w kierunku zewnętrznym otworu, aż do usunięcia całej krwi oraz luźnych włosów.
Następnie, używając pęsety numer siedem, zlokalizuj koniuszek prawego gruczołu ślinowego, chwytając tkankę łączną kilka milimetrów powyżej górnej części gruczołu. Następnie przerwij tkankę łączną wokół gruczołu, uważając, aby nie uszkodzić miąższu. Po odsłonięciu gruczołu delikatnie oddziel tkankę łączną od gruczołu, wypłukując krew solą fizjologiczną.
Upewnij się, że wszystkie tkanki łączna zostały oddzielone, a gruczoł jest w pełni odsłonięty. Przed przeniesieniem zwierzęcia pod mikroskop, umieść na stoliku mikroskopowym grubą warstwę gazy oraz ogrzewacz, przykrywając górną część ogrzewacza również cienką warstwą gazy. Na środku stolika umieść szkiełko nakrywki.
Następnie ułóż mysz na prawym boku na gazie, unieruchamiając zwierzę za pomocą kawałka taśmy maskującej na stronie brzusznej prawej przedniej łapy oraz jedwabnej nici zaplecionej wokół siekaczy. Wywołaj lekkie napięcie między nicią a łapą, a następnie przymocuj je do stolika. Za pomocą dodatkowej taśmy maskującej ustabilizuj zwierzę tak, aby gruczoł ślinowy spoczywał w naturalnej pozycji.
Na środku szkiełka nakrywki. Aby dodatkowo ustabilizować głowę i klatkę piersiową myszy, należy zastosować plastikowe kliny przymocowane do stolika mikroskopu. Następnie na gruczoł należy położyć mały kawałek chusteczki do czyszczenia soczewek.
Lekko rozciągnij gruczoł i umieść nad nim dostosowany uchwyt. Następnie mocno przymocuj stabilizator do stołu za pomocą metalowego zacisku i taśmy maskującej. Przykryj zwierzę gazą oraz podkładką grzewczą i monitoruj temperaturę odsłoniętych gruczołów za pomocą termometru z elastyczną sondą termoparową. Niezwłocznie po ustabilizowaniu zwierzęcia użyj oświetlenia epifluorescencyjnego, aby ustawić ostrość na powierzchni gruczołu.
Oceń przepływ krwi w naczyniach kapilarnych oraz ogólną morfologię tkanki. W celu wzbudzenia genu GFP użyj lasera o długości fali 488 nm. Ustaw moc szczytową na 0,5 mW, aby uniknąć fotowybielania białka tandem tomato.
Należy użyć lasera o długości fali 561 nm, ustawiając moc szczytową na 1 mW. Następnie należy ocenić stabilność tkanki, wykonując skan wstępny wybranego obszaru. Jeśli preparat nie jest stabilny, należy odpowiednio skorygować położenie zwierzęcia, aby odnaleźć właściwą płaszczyznę ogniskowania.
W trybie wstępnym powoli przesuwaj obiektyw w stronę szkiełka nakrywnego, aż struktury laserowe, granule wydzielnicze i błona plazmatyczna staną się wyraźnie widoczne. Następnie, aby zobrazować dynamikę granul wydzielniczych, zastosuj prędkość skanowania od 0,5 do dwóch sekund na klatkę oraz rozdzielczość 256 na 256 pikseli z skalą przestrzenną 0,2 µm na piksel.
Aby optymalnie zwizualizować ziarnistości i błonę komórkową, ustaw grubość optyczną w zakresie od 0,9 do 1,2 micrometers. Następnie zarejestruj obraz pola widzenia, który posłuży jako punkt odniesienia. Na koniec stymuluj egzocytozę, wstrzykując podskórnie 0,1 milligram per kilogram świeżo przygotowanego izoproterenolu i soli fizjologicznej.
Minuta po wstrzyknięciu. Fuzja ziarnistości wydzielniczych z błoną plazmatyczną zostanie wykryta poprzez wzrost fluorescencji GFP wokół ziarnistości oraz dyfuzję tandemowego peptydu tomato do ich błon ograniczających. U myszy GFPM tomato asynizyny pojawiają się jako wyraźnie odrębne struktury wykazujące ekspresję cytozolowego GFP oraz celowanego w błonę tandemowego peptydu tomato, co zaznaczono przerywanymi liniami.
W poszczególnych komórkach aser są one wyznaczone przez tandemowy peptyd tomato, co wskazują strzałki. GFP jest również wykrywane w jądrach, które są wyraźnie widoczne wewnątrz komórek aser. Cytozolowe GFP, wskazane grotem strzałki, jest wykluczone z ziarnistości wydzielniczych, które występują jako ciemne, okrągłe pęcherzyki o średnicy około 1 do 1.5 µm.
Aby zwizualizować zdarzenia egzofityczne, przedstawiono reprezentatywny obszar błony plazmatycznej wzbogacony w ziarnistości wydzielnicze (oznaczony gwiazdką) po wstrzyknięciu izoproterenolu. Można zaobserwować wzrost poziomu fluorescencji GFP, zaznaczony zielonymi strzałkami wokół niektórych ziarnistości wydzielniczych znajdujących się w bliskim sąsiedztwie błony plazmatycznej. Ponadto, po fuzji z błoną plazmatyczną, tandemowy peptyd tomato dyfunduje do błon ograniczających ziarnistości wydzielnicze, co zaznaczono czerwonymi strzałkami.
Po 30 do 40 sekund ziarnistości wydzielnicze stopniowo ulegają kolapsowi, a ich błony ograniczające są integrowane z apikalną błoną plazmatyczną. Przedstawione tutaj podejście stanowi istotny przełom w biologii komórki, ponieważ umożliwia obrazowanie dynamiki konkretnego procesu transportu błonowego u żywych myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółową metodę wizualizacji struktur wewnątrzkomórkowych w śliniankach myszy z wykorzystaniem mikroskopii intravitalnej. Procedura obejmuje chirurgiczne odsłonięcie gruczołów, unieruchomienie zwierzęcia oraz precyzyjne ustawienie w celu zminimalizowania artefaktów ruchowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Mikroskopia intravitalna umożliwia obrazowanie procesów biologicznych w czasie rzeczywistym.
- Jest ona szczególnie użyteczna w badaniu dynamicznych struktur komórkowych.
- Gruczoły ślinowe służą jako model do obserwacji dynamiki subkomórkowej.
- Zrozumienie tej dynamiki może dostarczyć wiedzy na temat różnych procesów fizjologicznych.
Cel badania
- W celu wizualizacji dynamiki struktur podkomórkowych u żywych myszy.
- W celu opracowania wiarygodnej metody obrazowania ziarnistości wydzielniczych.
- W celu pogłębienia zrozumienia funkcji komórkowych w gruczołach ślinowych.
Zastosowane metody
- Chirurgiczne odsłonięcie ślinianek bez powodowania uszkodzeń.
- Unieruchomienie znieczulonego zwierzęcia na stoliku mikroskopu.
- Staranne ustawienie ślinianek w celu zachowania ich funkcji.
- Zastosowanie specjalnego uchwytu do stabilizacji myszy i redukcji artefaktów ruchowych.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie struktur podkomórkowych w żywych śliniankach.
- Wykazanie dynamiki ziarnistości wydzielniczych.
- Walidacja metody do przyszłych badań w żywych modelach zwierzęcych.
- Wgląd w role fizjologiczne tych struktur.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne podejście do badania dynamiki subkomórkowej.
- Mikroskopia intravitalna może być zastosowana w różnych obszarach badań biologicznych.
- Technika ta pogłębia naszą wiedzę na temat procesów komórkowych in vivo.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia intravitalna umożliwia wizualizację dynamiki podkomórkowej w czasie rzeczywistym w żywych modelach zwierzęcych, dostarczając kluczowych informacji mechanistycznych niezbędnych do walidacji celów i analizy szlaków sygnałowych. Poprzez obrazowanie egzocytozy ziarnistości wydzielniczych oraz transportu błonowego w śliniankach, metoda ta wspomaga przedkliniczną redukcję ryzyka w badaniach nad szlakami sygnalizacyjnymi zależnymi od GPCR, które są istotne dla celów terapeutycznych w chorobach metabolicznych i wydzielniczych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków, łącząc perturbacje molekularne z funkcjonalnymi efektami podkomórkowymi w fizjologicznie istotnym kontekście.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią obserwację fuzji ziarnistości wydzielniczych stymulowanej przez receptory beta-adrenergiczne, co wspiera walidację funkcjonalną celów GPCR w żywej tkance.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę do badania regulatorów egzocytozy w postaci kinaz, fosfataz lub elementów cytoszkieletu z wykorzystaniem fluorescencyjnych biosensorów.
- Wartość terapeutyczna: Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka związków celujących w szlaki cAMP/PKA poprzez ilościowe określanie kinetyki translokacji subkomórkowej w czasie rzeczywistym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Stabilizowany preparat ślinianki umożliwia spójne obrazowanie sygnałów GFP i tandem-Tomato w stanie wyjściowym na potrzeby przesiewowych badań biblioteki związków.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar częstotliwości fuzji granulek, szybkości dyfuzji błony oraz kinetyki zapadania się jako funkcjonalne odczyty modulacji szlaku.
- Skalowalność: Procedura chirurgicznej stabilizacji i obrazowania może zostać dostosowana do badań na wielu zwierzętach z ustandaryzowaną kontrolą temperatury i ruchu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje regulowaną sekrecję w tkankach egzokrynnych, co znajduje zastosowanie w badaniach nad zapaleniem trzustki, zespołem Sjögrena lub dysfunkcją regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR).
- Ciągłość biomarkerów: Fluorescencyjne reportery błon ziarnistych i cytozolu umożliwiają korelację wyników obrazowania z biochemicznymi analizami sekrecji.
- Przedkliniczna redukcja ryzyka: Wspiera decyzje typu „go/no-go” poprzez powiązanie oddziaływania na cel z funkcjonalnymi skutkami wewnątrzkomórkowymi przed fenotypowaniem na poziomie narządu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, w którym obrazowanie subkomórkowe w czasie rzeczywistym dostarcza informacji o mechanizmie działania oraz selektywności szlaku.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków efektorowych GPCR poprzez wizualizację rekrutacji efektorów w dół kaskady oraz dynamiki błon w nienaruszonym tkance.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie preparatów do analiz w celu oceny wpływu związków na kinetykę egzocytozy z rozdzielczością przestrzenną i czasową.
- Analityka: Generuje ilościowe dane dotyczące zmian intensywności fluorescencji, szybkości dyfuzji oraz czasu zapadania się pęcherzyków w celu porównania warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy celowanie molekularne z funkcjonalnym wydzielaniem w modelu egzokrynnym istotnym dla danej choroby, wspierając ekstrapolację do ludzkiej patofizjologii.
- Ponowne zastosowanie w przedsiębiorstwie: Platformę stabilizacji i obrazowania można ponownie wykorzystać dla wielu reporterów fluorescencyjnych i modeli chorób przy minimalnej rewalidacji.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w transdukcji sygnału poprzez zapewnienie bezpośredniej wizualizacji zdarzeń translokacji efektorów oraz ich integracji z błoną.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany protokół immobilizacji i obrazowania poprawia powtarzalność wyników między laboratoriami oraz w ramach różnych ram czasowych badań.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejszą identyfikację wyników fałszywie dodatnich poprzez potwierdzenie funkcjonalnej aktywności wewnątrzkomórkowej wykraczającej poza wiązanie lub masowe analizy biochemiczne.
- Wpływ na portfolio: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez walidację zaangażowania szlaku w fizjologicznie nienaruszonym, dynamicznym środowisku komórkowym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w przeprowadzaniu operacji na myszach, znieczulaniu oraz konfiguracji mikroskopii intravitalnej.
- Metoda jest zależna od mikroskopu konfokalnego z liniami laserowymi 488 nm i 561 nm, platformy termicznej oraz sprzętu do stabilizacji ruchu.
- Niezbędne są standaryzowane protokoły przygotowania zwierząt, aby zapewnić dostęp do gruczołu oraz stabilność funkcjonalną w kolejnych eksperymentach.
- Adaptacja do innych tkanek może wymagać zmodyfikowanych podejść do stabilizacji ze względu na różnice w ruchomości i dostępności organów.
- Ograniczenia wynikające z fotobleachingu wymagają starnej kalibracji mocy lasera oraz odpowiedniego doboru częstotliwości klatek dla obrazowania podłużnego.
