PCR: reakcja łańcuchowa polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy lub PCR jest szeroko stosowaną metodą amplifikacji fragmentów DNA. PCR wykorzystuje termocykling, który polega na wielokrotnym ogrzewaniu i chłodzeniu reakcji za pomocą trzech różnych temperatur zwanych denaturacją, wyżarzaniem i wydłużaniem lub wydłużeniem.

Reakcja termocyklingu rozpoczyna się po umieszczeniu odczynników PCR w termocyklerze, maszynie, która jest zaprogramowana do precyzyjnego podgrzewania i chłodzenia reakcji.

Cykl PCR rozpoczyna się od denaturacji, która trwa od 20 do 30 sekund w temperaturze 95 °C, znacznie powyżej temperatury topnienia DNA. Temperatura topnienia to stan, w którym połowa DNA to dwuniciowa helisa, a druga to jednoniciowa losowa cewka. Temperatura denaturacji jest znacznie wyższa od temperatury topnienia, aby zapewnić, że wszystkie wiązania wodorowe między komplementarnymi parami zasad zostaną zerwane, dając tylko jednoniciowe DNA. Sparowane pojedyncze nici nazywane są pasmami sensu i antysensu. Sekwencja zmysłu lub nici kodującej jest identyczna z sekwencją mRNA, która ostatecznie koduje białko. Dlatego ma to sens. Czytany od lewej do prawej zaczyna się od fosforanu 5', a kończy na hydroksylu 3'. Nić antysensowna jest również nazywana nicią komplementarną i zaczyna się od hydroksylu 3' i kończy się fosforanem 5', gdy czyta się ją od lewej do prawej.

W drugim etapie, wyżarzaniu, krótkie fragmenty DNA zwane starterami, które są specyficzne dla nici zmysłowych lub antysensownych, wiążą się wiązaniami wodorowymi. Starter, który wiąże się z nicią antysensowną i ma taką samą sekwencję jak nić sensowna, to starter do przodu lub zmysłowy. Elementarz, który wiąże się z nicią zmysłową i ma sekwencję, która jest odwrotna i komplementarna do nici zmysłu, jest twoim starterem odwrotnym lub antysensownym. W zależności od długości użytych podkładów, temperatura wyżarzania na tym etapie jest zwykle o 3 do 5 °C niższa od dolnej temperatury topnienia dwóch podkładów. Wyżarzanie ma tendencję do zachodzenia w temperaturze od 50 do 65 °C i trwa od 20 do 40 sekund.

Gdy startery zwiążą się z DNA, przygotowują reakcję, tworząc koniec grupy hydroksylowej 3', z którym zwiąże się polimeraza, enzym replikujący DNA.

Następny etap zwany wydłużeniem lub wydłużeniem zachodzi w temperaturze 72 °C, która jest optymalna dla aktywności polimerazy. Po związaniu polimeraza zaczyna dodawać wolne trifosforany nukleotydów lub dNTP do końców startera jeden po drugim w kierunku od 5 'do 3', aby utworzyć dwuniciowy DNA.

Po zakończeniu wydłużania rozpoczyna się następny cykl. W następnym cyklu startery zwiążą się z jednoniciowym DNA powstałym w wyniku wcześniejszego wydłużenia. Krótki fragment, który próbujesz wzmocnić, amplikon, ostatecznie uformuje się, gdy polimeraza rozciągnie się z przedniego startera na nić, która została wygenerowana przez amplifikację z odwrotnego startera lub odwrotnie. Po wygenerowaniu ilość amplikonu będzie rosła wykładniczo w kolejnych cyklach. W zależności od celu twojej reakcji potrzebnych będzie od 20 do 40 cykli.

W przypadku długich amplikonów końcowy etap wydłużania jest zwykle uruchamiany w temperaturze 72 °C przez 5 do 15 minut, aby upewnić się, że całe DNA jest dwuniciowe. Zazwyczaj końcowy etap utrzymywania w temperaturze 4 °C jest programowany w termocyklerze jako krok zapobiegawczy, aby zapewnić, że DNA pozostanie stabilne do momentu wyjęcia z termocyklera.

Reakcja PCR wymaga kilku kluczowych odczynników. Pierwszą z nich jest matryca DNA, która jest próbką DNA, z której zostanie amplifikowany twój fragment. Są też twoje startery, które są krótkimi fragmentami DNA lub oligonukleotydami, które przygotowują reakcję polimerazy.

Istnieje kilka ważnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze podkładów. Po pierwsze, muszą być komplementarne z regionami 5' i 3' matrycy DNA, które otaczają sekwencję, którą chcesz amplifikować. Po drugie, powinny mieć od 15 do 30 par zasad i składać się z około 50% guaniny i cytozyny. Po trzecie, temperatury topnienia obu podkładów powinny przekraczać 50 °C i mieścić się w odległości od jednego do dwóch stopni od siebie, aby mogły skutecznie wiązać się w tej samej temperaturze wyżarzania. Po czwarte, nie mogą się wzajemnie uzupełniać i tworzyć dimerów starterowych. I po piąte, nie powinny zawierać struktury drugorzędowej, która powstaje w wyniku samoczynnego wyżarzania w jednym ze starterów.

Oprócz starterów i matrycy DNA, polimeraza DNA jest niezbędna do reakcji PCR. Enzymem najczęściej stosowanym w PCR jest polimeraza Taq, która jest termostabilnym enzymem wyizolowanym z bakterii Thermus aquaticus, która zamieszkuje gorące źródła. Polimeraza Taq wytrzymuje temperatury powyżej 90 °C.

dNTP, które będą składać się z par zasad w rosnących niciach, również muszą zostać dodane do reakcji. Bufor reakcyjny, który utrzymuje pH i zawiera ważne jony, takie jak mangan, magnez i potas, jest również niezbędnym składnikiem reakcji, który stabilizuje reakcję i dostarcza ważnych kofaktorów enzymowi polimerazy. Podobnie jak wszystkie reakcje, PCR wymaga rozpuszczalnika, dlatego stosuje się wodę klasy PCR, która jest wolna od jonów, które mogą hamować reakcję.

Przed rozpoczęciem PCR upewnij się, że środowisko pracy jest czyste, aby uniknąć zanieczyszczenia. Należy zawsze nosić rękawice.

Aby pomóc w śledzeniu różnych składników reakcji, które będą potrzebne. Sporządź tabelę objętości i stężeń odczynników dla każdej z próbek, w tym dla próbek. Pod względem objętości typowa reakcja powinna zawierać 5 μL 10X buforu reakcyjnego, 4 μL 25 mM MgCl2, 1 μL dNTP przy 10 mM, 2 μL starterów do przodu i do tyłu przy 50 ng/μL oraz 0,3 μL polimerazy Taq przy 5 U/μL. Chcesz dodać wystarczającą ilość szablonu, aby 100 ng było obecne w reakcji. Wreszcie większość reakcji PCR przeprowadza się w całkowitej objętości 50 μl. Tak więc należy użyć objętości wody klasy PCR, aby upewnić się, że całkowita objętość wynosi rzeczywiście 50 μl.

Gdy reakcja jest zaplanowana na papierze, złóż odczynniki na lodzie.

Następnie dodaj odczynniki do probówki PCR. Najpierw dodaj wodę, następnie szablon, podkłady, bufor, chlorek magnezu i dNTP, na końcu dodaj polimerazę Taq i dokładnie wymieszaj.

Po skonfigurowaniu reakcji umieść próbkę w termocyklerze i uruchom program PCR. Krótko mówiąc, części maszyny składają się z termobloku, do którego wkładana jest probówka lub płytka PCR i podlegają precyzyjnym zmianom temperatury. Podgrzewana pokrywa, która zapobiega kondensacji, dzięki czemu nie dochodzi do utraty próbki oraz interfejs z wyświetlaczem do programowania temperatur PCR i czasu trwania cyklu. Zawsze konfiguruj swój program przed złożeniem reakcji.

Gdy termocykler wykona swoją pracę. Wyjmij swoją reakcję i zweryfikuj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Jeśli PCR się powiedzie, powinieneś zobaczyć amplikon o odpowiednim rozmiarze pary zasad.

A teraz kilka pomocnych wskazówek podczas pracy z PCR. Kiedy próbujesz wzmocnić ten sam produkt PCR z wielu różnych szablonów, a zatem masz wiele różnych reakcji na konfigurację. Przydatne jest zwiększenie skali reakcji w celu stworzenia mieszanki wzorcowej. Główna mieszanina PCR to mieszanina o dużej objętości wszystkich odczynników współdzielonych między próbkami, która jest następnie rozprowadzana do wielu probówek reakcyjnych.

Większość reakcji PCR rozpoczyna się od początkowego etapu denaturacji, który zachodzi w temperaturze 95°C przez 1 do 9 minut. Ten krok zapewnia, że cała matryca jest jednoniciowa dla pierwszego cyklu amplifikacji.

Często pożądane jest użycie komory PCR, gdy ryzyko zanieczyszczenia próbki jest wysokie. Aby sprawdzić, czy w reakcji nie ma zanieczyszczeń, korzystne jest ustawienie kontroli negatywnej, która nie ma matrycy DNA i nie powinna wytwarzać produktu w żelu DNA.

Często PCR musi być zoptymalizowany poprzez dostosowanie temperatury, stężenia chlorku magnezu lub wypróbowanie nowych starterów. Gdy już Twój PCR będzie działał. Dobrym pomysłem jest zawsze uruchamianie szablonu kontroli pozytywnej, o którym wiesz, że wytworzy produkt.

Istnieje wiele odmian i zastosowań PCR do różnych celów.

Jedna z odmian PCR, hot start PCR, polega na wstrzymaniu polimerazy z reakcji do czasu pierwszego etapu denaturacji, co zapobiega niespecyficznej amplifikacji, która może wystąpić przed cyklem.

PCR może być również modyfikowany w celu jednoczesnej amplifikacji wielu sekwencji DNA poprzez zastosowanie wielu starterów w jednej reakcji PCR zwanej multiplex PCR.

W połączeniu z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi, PCR może stać się techniką, która może mierzyć względne lub bezwzględne poziomy ekspresji genów lub ilość mRNA wytwarzanego dla danego genu lub grupy genów. Ta metoda jest określana jako qPCR.

PCR może być również stosowany do określania obecności określonej sekwencji DNA w organizmie. Ta procedura jest określana jako genotypowanie. Na przykład genotypowanie można wykorzystać do określenia autentyczności próbek ryb poprzez ustalenie, czy w próbce występuje sekwencja specyficzna dla gatunku. Genotypowanie jest również wykorzystywane w analizie kryminalistycznej w celu określenia, czy DNA znalezione na miejscu przestępstwa pasuje do podejrzanego.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do PCR. W tym filmie omówiliśmy, czym jest PCR i jak działa, wiele elementów reakcji PCR, mechanizm, za pomocą którego PCR może amplifikować DNA oraz wiele odmian i zastosowań tej bardzo przydatnej techniki. Dzięki za oglądanie!