PCR: Reakcja łańcuchowa polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy, czyli PCR, jest powszechnie stosowaną metodą amplifikacji fragmentów DNA. PCR wykorzystuje termocykling, polegający na wielokrotnym ogrzewaniu i chłodzeniu mieszaniny reakcyjnej w trzech określonych temperaturach, odpowiadających etapom denaturacji, przyłączania starterów oraz przedłużania (elongacji).

Reakcja termocykliczna rozpoczyna się po umieszczeniu odczynników do PCR w termocyklerze, czyli urządzeniu zaprogramowanym do precyzyjnego ogrzewania i chłodzenia mieszaniny reakcyjnej.

Cykl PCR rozpoczyna się od denaturacji, która trwa od 20 do 30 sekund w temperaturze 95 °C, znacznie powyżej temperatury topnienia DNA. Temperatura topnienia to stan, w którym połowa cząsteczek DNA występuje w formie podwójnej helisy, a druga połowa w formie pojedynczych nici o strukturze przypadkowej. Temperatura denaturacji jest znacznie wyższa od temperatury topnienia, aby zapewnić zerwanie wszystkich wiązań wodorowych między komplementarnymi parami zasad, w wyniku czego powstają wyłącznie pojedyncze nici DNA. Sparowane pojedyncze nici nazywa się nicią sensowną (kodującą) oraz antysensowną. Sekwencja nici sensownej jest identyczna z sekwencją mRNA, która ostatecznie będzie kodować białko. Dlatego nazywa się ją nicią sensowną. Czytana od lewej do prawej zaczyna się od fosforanu 5’, a kończy grupą hydroksylową 3’. Nić antysensowna jest również nazywana nicią komplementarną; czytana od lewej do prawej zaczyna się od grupy hydroksylowej 3’, a kończy fosforanem 5’.

W drugim kroku, anelingu, krótkie fragmenty DNA zwane starterami, specyficzne dla nici sensownej lub antysensownej, wiążą się poprzez wiązania wodorowe. Starter, który wiąże się z nicią antysensowną i posiada taką samą sekwencję jak nić sensowna, jest starterem przednim (forward) lub sensownym. Starter, który wiąże się z nicią sensowną i posiada sekwencję odwrotną i komplementarną do nici sensownej, jest starterem tylnym (reverse) lub antysensownym. W zależności od długości użytych starterów, temperatura anelingu w tym kroku jest zazwyczaj o 3 do 5 °C niższa od niższej temperatury topnienia dwóch starterów. Aneling zazwyczaj zachodzi w temperaturze od 50 do 65 °C i trwa od 20 do 40 sekund.

Po związaniu się z DNA startery inicjują reakcję, tworząc wolną grupę hydroksylową 3’, do której przyłączy się polimeraza – enzym replikujący DNA.

Kolejny etap, zwany elongacją lub przedłużaniem, odbywa się w temperaturze 72 °C, która jest optymalna dla aktywności polimerazy. Po związaniu się polimeraza zaczyna dołączać wolne nukleotydy trójfosforanowe (dNTP) do końców startera, jeden po drugim, w kierunku 5’ do 3’, tworząc podwójną nić DNA.

Po zakończeniu elongacji rozpoczyna się kolejny cykl. W następnym cyklu startery zwiążą się z pojedynczymi nićmi DNA powstałymi podczas poprzedniego przedłużania. Krótki fragment, który jest amplifikowany – amplikon – powstanie ostatecznie wtedy, gdy polimeraza przedłuży nić od startera przedniego na nici wygenerowanej przez amplifikację ze startera tylnego lub odwrotnie. Po utworzeniu ilość amplikonu będzie rosła wykładniczo w kolejnych cyklach. W zależności od celu reakcji wymaganych będzie od 20 do 40 cykli.

W przypadku długich amplikonów zazwyczaj przeprowadza się końcowy etap elongacji w temperaturze 72 °C przez 5 do 15 minut, aby zapewnić, że całe DNA jest dwuniciowe. Zazwyczaj w termocyklerze programuje się końcowy etap przechowywania w temperaturze 4 °C jako środek ostrożności, aby zapewnić stabilność DNA do momentu wyjęcia go z urządzenia.

Reakcja PCR wymaga kilku kluczowych odczynników. Pierwszym z nich jest matryca DNA, czyli próbka DNA, z której zostanie powielony pożądany fragment. Następnie stosuje się primery, będące krótkimi odcinkami DNA lub oligonukleotydami, które inicjują reakcję polimerazy.

Przy wyborze primerów należy wziąć pod uwagę kilka istotnych kwestii. Po pierwsze, muszą one być komplementarne do regionów 5’ i 3’ matrycy DNA, które flankują sekwencję przeznaczoną do amplifikacji. Po drugie, ich długość powinna wynosić od 15 do 30 par zasad, a zawartość guaniny i cytozyny powinna wynosić około 50%. Po trzecie, temperatury topnienia obu primerów powinny przekraczać 50 °C i różnić się od siebie o jeden lub dwa stopnie, aby mogły one efektywnie wiązać się w tej samej temperaturze przyłączania. Po czwarte, primery nie mogą być komplementarne względem siebie, aby nie tworzyły dimerów primerów. Po piąte, nie powinny one tworzyć struktur drugorzędowych, powstających w wyniku samozwiązania w obrębie jednego z primerów.

Oprócz primerów i matrycy DNA, w reakcji PCR niezbędna jest polimeraza DNA. Enzymem najczęściej stosowanym w PCR jest polimeraza Taq, która jest enzymem termostabilnym wyizolowanym z bakterii Thermus aquaticus zamieszkującej gorące źródła. Polimeraza Taq jest odporna na temperatury przekraczające 90 °C.

Do reakcji należy również dodać dNTP, które będą stanowić pary zasad w rosnących niciach. Niezbędnym składnikiem jest także bufor reakcyjny, który utrzymuje pH i zawiera ważne jony, takie jak mangan, magnez i potas; stabilizuje on reakcję i dostarcza polimerazie kluczowych kofaktorów. Jak w przypadku wszystkich reakcji, PCR wymaga rozpuszczalnika, dlatego stosuje się wodę klasy PCR, wolną od jonów mogących hamować przebieg reakcji.

Przed rozpoczęciem reakcji PCR należy upewnić się, że środowisko pracy jest czyste, aby uniknąć kontaminacji. Należy zawsze nosić rękawiczki.

Aby ułatwić monitorowanie poszczególnych składników reakcji, przygotuj tabelę z objętościami i stężeniami odczynników dla każdej z próbek, włącznie z kontrolami. Typowa reakcja powinna zawierać 5μL buforu reakcyjnego 10X, 4μL 25 mM MgCl2, 1μL dNTPs o stężeniu 10 mM, 2μL starterów bezpośrednich i odwrotnych o stężeniu 50 ng/μL oraz 0,3μL polimerazy Taq o stężeniu 5 U/μL. Należy dodać taką ilość matrycy, aby w reakcji znajdowało się 100 ng. Większość reakcji PCR przeprowadza się w całkowitej objętości 50μL. Należy zatem użyć odpowiedniej objętości wody klasy PCR, aby zapewnić, że objętość końcowa wynosi dokładnie 50μL.

Po zaplanowaniu reakcji na papierze, przygotuj odczynniki na lodzie.

Następnie dodaj odczynniki do probówki PCR. Najpierw dodaj wodę, następnie matrycę, startery, bufor, chlorek magnezu i dNTPs; na końcu dodaj polimerazę Taq i dokładnie wymieszaj.

Po przygotowaniu reakcji umieść próbkę w termocyklerze i uruchom program PCR. Urządzenie składa się z bloku termicznego, w którym umieszcza się probówkę lub płytkę PCR i który poddawany jest precyzyjnym zmianom temperatury, podgrzewanej pokrywy, która zapobiega kondensacji i utracie próbki, oraz interfejsu z wyświetlaczem do programowania temperatur i czasu trwania cykli PCR. Zawsze konfiguruj program przed przygotowaniem mieszaniny reakcyjnej.

Po zakończeniu pracy termocyklera wyjmij próbkę i zweryfikuj produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu. Jeśli reakcja PCR przebiegła pomyślnie, powinien być widoczny amplikon o prawidłowej liczbie par zasad.

A teraz kilka pomocnych wskazówek dotyczących pracy z PCR. Gdy próbują Państwo amplifikować ten sam produkt PCR z wielu różnych matryc, co wiąże się z przygotowaniem wielu różnych reakcji, warto przeskalować reakcję w celu przygotowania mieszaniny głównej (master mix). PCR master mix to mieszanina wszystkich odczynników wspólnych dla próbek w większej objętości, która jest następnie rozdzielana do wielu probówek reakcyjnych.

Większość reakcji PCR rozpoczyna się od etapu początkowej denaturacji, która odbywa się w temperaturze 95°C przez 1 do 9 minut. Krok ten zapewnia, że cała matryca jest jednoniciowa przed pierwszym cyklem amplifikacji.

Często w sytuacjach wysokiego ryzyka kontaminacji próbek zaleca się korzystanie z komory do PCR. Aby sprawdzić obecność zanieczyszczeń w reakcji, warto przygotować kontrolę negatywną, która nie zawiera matrycy DNA i nie powinna przynieść produktu w żelu DNA.

Często PCR wymaga optymalizacji poprzez dostosowanie temperatur, stężenia chlorku magnezu lub przetestowanie nowych starterów. Gdy PCR działa poprawnie, dobrą praktyką jest zawsze stosowanie matrycy kontroli pozytywnej, o której wiadomo, że wytworzy produkt.

Istnieje wiele wariantów i zastosowań techniki PCR dla różnych celów.

Jednym z wariantów PCR jest hot start PCR, który polega na powstrzymaniu aktywności polimerazy w reakcji aż do zakończenia pierwszego etapu denaturacji, co zapobiega niespecyficznej amplifikacji, która mogłaby wystąpić przed rozpoczęciem cykli.

Metodę PCR można również zmodyfikować w celu jednoczesnej amplifikacji wielu sekwencji DNA poprzez zastosowanie wielu starterów w jednej reakcji PCR, co określa się mianem multiplex PCR.

W połączeniu z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi, PCR może stać się techniką umożliwiającą pomiar względnych lub bezwzględnych poziomów ekspresji genów lub ilości mRNA produkowanego dla danego genu lub grupy genów. Metoda ta jest nazywana qPCR.

PCR może być również wykorzystywany do określania obecności konkretnej sekwencji DNA w organizmie. Procedura ta jest nazywana genotypowaniem. Na przykład genotypowanie może służyć do potwierdzania autentyczności próbek ryb poprzez ustalenie, czy w próbce znajduje się sekwencja specyficzna dla danego gatunku. Genotypowanie jest również stosowane w analizie kryminalistycznej w celu ustalenia, czy DNA znalezione na miejscu zbrodni odpowiada DNA podejrzanego.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do metody PCR. W tym filmie omówiliśmy, czym jest PCR i jak działa, przeanalizowaliśmy liczne komponenty reakcji PCR, mechanizm, dzięki któremu PCR może powielać DNA, a także wiele wariantów i zastosowań tej niezwykle użytecznej techniki. Dziękujemy za uwagę!