Name: Ksenograf torebki nerkowej i podskórna implantacja osadu w celu oceny kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnego przerostu gruczołu krokowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj technikę ksenografu torebki nerkowej i implantacji podskórnej pelletów hormonalnych w myszach. Ta metoda pozwala ocenić kancerogenezę hormonalną i łagodny przerost gruczołu krokowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Ricke, byłym i obecnym. Dziękujemy Calvinowi Pattenowi, Jr., DVM i Brigitte Raabe, DVM, za pomocne komentarze dotyczące protokołu. Chcielibyśmy podziękować NIDDK, NCI i NIEHS za wsparcie finansowe dla tych badań: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN jest stażystą w programie szkoleniowym dla naukowców medycznych na Uniwersytecie w Rochester finansowanym przez NIH T32 GM07356; NIH w ramach nagrody Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 również wspiera ten projekt. CDV jest wspierany przez T32CA157322, a ABT jest wspierany przez T32ES007015 na Uniwersytecie Wisconsin-Madison. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych lub NIH.

1. Przygotowanie skompresowanego hormonu/granulki leku
<ol>
	<li>Procedurę tę należy wykonywać w kapturze ochrony przeciwchemicznej, mając na sobie fartuch laboratoryjny, rękawice, maskę, okulary ochronne i czepek. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, bardzo ważne jest, aby sprzęt do produkcji peletów był dokładnie czyszczony 70% etanolem przed i po wyprodukowaniu każdego rodzaju pelletu.</li>
	<li>Za pomocą wagi analitycznej i papieru wagowego odmierz żądaną ilość hormonu/leku w proszku. Zaleca się około 5% dodatkowego materiału, aby zrekompensować straty podczas prasowania.</li>
	<li>Niektóre hormony/leki wymagają środka wiążącego lub wypełniacza, który jest mieszany przed produkcją granulek. Na przykład, aby wyprodukować 2,5 mg granulki 17β-estradiolu, połącz hormon z 22,5 mg cholesterolu, co daje 25 mg granulki.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś do zestawu matryc, umieść pod prasą i mocno popchnij dźwignię w dół, aby ścisnąć granulat. Używaj stałego nacisku, aby utrzymać stały stosunek powierzchni do objętości.</li>
	<li>Następnie odwróć uchwyt matrycy i ponownie popchnij dźwignię w dół, aby zwolnić śrut.</li>
	<li>Sprawdź granulkę pod kątem integralności i określ, czy masa końcowa mieści się w pożądanym zakresie. Dopuszczalny zakres to ± 5% różnicy w końcowej masie (na przykład dopuszczalny zakres dla granulki 25 mg wynosi 23,8-26,3 mg).</li>
	<li>Granulki mogą być wytwarzane przed zabiegiem chirurgicznym i przechowywane (warunki i długość przechowywania zależą od stabilności hormonu lub leku stosowanego w produkcji granulek). Hormony granulki można kupić jako alternatywę dla produkcji peletów. Zakup granulek pozwala uniknąć stosowania leków niefarmaceutycznych jakości, ponieważ będą one formułowane i złożone.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ksenoprzeszczepów rekombinowanych komórek
<ol>
	<li>Zbieraj i hoduj pierwotne komórki zrębu mezenchymy moczowo-płciowej myszy (UGM) przez mniej niż 4 tygodnie przed pobraniem do liczenia.</li>
	<li>Kultura unieśmiertelniła linie komórkowe nabłonka prostaty w zwykły sposób i zbiera do liczenia. W tym przykładzie przygotuj przeszczepy rekombinowane komórek, mieszając 100 000 komórek nabłonkowych BPH-1 na przeszczep z 250 000 komórek zrębu UGM na przeszczep w zawiesinie.</li>
	<li>Połącz komórki ze sobą i ponownie zawiesić w wystarczającej ilości zneutralizowanego kolagenu z ogona szczura typu 1, aby uzyskać pożądaną liczbę przeszczepów, każdy w objętości od 25 μl do 50 μl.</li>
	<li>Umieść rekombinowane przeszczepy w temperaturze 37 °C na 15 minut, a następnie przykryj pożywką wzrostową do przechowywania w temperaturze 37 °C do 48 godzin przed szczepieniem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ksenoprzeszczepów tkankowych
<ol>
	<li>Zachowaj uniwersalne środki ostrożności dotyczące patogenów przenoszonych przez krew podczas pobierania tkanek i zabiegu chirurgicznego. Po zatwierdzeniu przez instytucjonalną komisję rewizyjną i świadomej zgodzie, należy pobrać świeżą tkankę prostaty z resekcji chirurgicznej. Do badań wzrostu BPH można pobrać tkanki z przezcewkowej resekcji prostaty lub prostych zabiegów prostatektomii. Pierwotne ksenoprzeszczepy PrCa lub łagodnej tkanki gruczołu krokowego można uzyskać z próbek z radykalnej prostatektomii.</li>
	<li>Pobraną tkankę należy przechowywać w izotonicznym buforowanym pożywce komórkowej lub w roztworze soli fizjologicznej na lodzie. W zależności od tkanki i warunków przechowywania, próbki mogą być przechowywane do 24 godzin przed przygotowaniem przeszczepów tkankowych. Powszechną praktyką jest dzielenie próbki na trzy części, z których jedna jest utrwalona w formalinie i rutynowo przetwarzana do badania histologicznego, jedna część jest zamrażana do analizy molekularnej, a jedna część jest dalej dzielona na ksenoprzeszczepy tkankowe (o wielkości 1-3 mm).</li>
</ol>
4. Przygotowanie pipety ze szkła polerowanego ogniowo
<ol>
	<li>Nosząc okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice żaroodporne, umieść szklaną końcówkę pipety Pasteura w płomieniu palnika Bunsena pod kątem około 60°, aby rozpocząć.</li>
	<li>Utrzymuj stały, lekki ruch pipety, aby uniknąć gorących punktów.</li>
	<li>Narysuj końcówkę cienko i wypoleruj na gorąco, tak aby celem był lekko zakrzywiony koniec z zaokrągloną, zamkniętą końcówką.</li>
</ol>
5. Przygotowanie narzędzi i sali operacyjnej
<ol>
	<li>Autoklaw wszystkich instrumentów. Przed zabiegiem należy sprawdzić wszystkie narzędzia, zwracając uwagę na utrzymanie sterylnego pola.</li>
	<li>Ustaw sterylny obszar operacyjny z wkładkami chłonnymi, zakresem preparacyjnym, stożkiem nosowym anestezjologicznym, narzędziami chirurgicznymi i lampą grzewczą skierowaną w stronę obszaru roboczego. Aby wysterylizować narzędzia między myszami, podgrzej sterylizator koralików.</li>
	<li>Zmontuj i przetestuj aparat anestezjologiczny; zważ pochłaniacz gazu.</li>
	<li>Za pomocą kuchenki mikrofalowej podgrzewaj poduszki woskowe przez maksymalnie 5 minut (w odstępach co 1 minutę, ugniatanie poduszki woskowej w celu połączenia stopionego i niestopionego wosku) przy mocy 70-80%, aż cały wosk zostanie równomiernie stopiony. Dotykiem upewnij się, że podkładka nie jest zbyt gorąca i umieść ją pod pustą klatką do odzyskiwania gryzoni.</li>
	<li>Załóż środki ochrony osobistej do zabiegów chirurgicznych na gryzoniach, w tym maskę chirurgiczną, czepek, rękawiczki i fartuch.</li>
</ol>
6. Zabieg chirurgiczny: Ksenograf torebki nerkowej
<ol>
	<li>Wszystkie procedury z udziałem zwierząt badawczych powinny być przeprowadzane za zgodą instytucjonalnych komitetów ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Przed indukcją znieczulenia obserwuj mysz, aby zapewnić jej zdrowie i dobre samopoczucie.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze do indukcji znieczulenia izofluranem w tempie 3-5%. Gdy zwierzę przestanie się poruszać, a częstość oddechów zmniejszy się, przenieś się na stożek nosowy w pozycji leżącej i utrzymuj znieczulenie na poziomie 1-3%.</li>
	<li>W razie potrzeby użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić tył myszy. Nie jest to konieczne w przypadku korzystania z myszy atymicznych nude (nu/nu).</li>
	<li>Mocno dociśnij taśmę wyprostowanej tylnej stopy, aby ocenić adekwatność znieczulenia. Jeśli mysz reaguje na nacisk, potrzeba więcej czasu, aby znieczulenie zadziałało. W razie potrzeby nieznacznie dostosuj przepływ znieczulenia, aby uzyskać odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Gdy mysz jest odpowiednio znieczulona, zdezynfekuj miejsce operowane roztworem jodu chirurgicznego (Betadine), a następnie 70% alkoholem.</li>
	<li>Załóż sterylne rękawiczki i fartuch; nałóż sterylne obłożenia na miejsce operacji. Podnieś tylną skórę za pomocą kleszczy zębatych i za pomocą grubych nożyczek wykonaj 2-3 cm nacięcie grzbietowej linii środkowej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek lub sondy oddziel leżącą pod spodem skórę właściwą od ściany ciała (po obu stronach nacięcia w przypadku przeszczepu obustronnego lub po jednej stronie w przypadku przeszczepu jednostronnego).</li>
	<li>Ustaw mysz w pozycji bocznej i zidentyfikuj lokalizację nerki, oglądając profil nerkowy przez ścianę mięśniową. Delikatne ręczne naciskanie kciukiem i palcem wskazującym na brzuch może pomóc w wizualizacji narządów wewnętrznych.</li>
	<li>Używając cienkich nożyczek do tęczówki i uważając, aby uniknąć głównych naczyń krwionośnych i nerwów rdzeniowych, wykonaj 1 cm nacięcie w ścianie ciała równolegle do kręgosłupa. Poszerz to nacięcie do 1,5-2,0 cm (nieco dłuższe niż długa oś nerki), delikatnie otwierając nożyczki szerzej po umieszczeniu ich w początkowym nacięciu.</li>
	<li>Zewnętrzizuj nerkę, wywierając delikatny nacisk na zewnątrz ściany mięśniowej po obu stronach nerki za pomocą palca wskazującego i kciuka. Wsuń krawędzie skóry poniżej zewnętrznej nerki, która będzie spoczywać na ścianie ciała. Podczas gdy nerka jest eksterioryjna, utrzymuj nawodnienie torebki nerkowej, stosując sterylną sól fizjologiczną.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków #5 delikatnie wyjmij torebkę nerkową z miąższu nerki i cienkim skalpelem wykonaj 2 -4 mm nacięcie w torebce. Wielkość nacięcia zależy od wielkości przeszczepu, ale powinna być zminimalizowana, aby zachować integralność torebki.</li>
	<li>Manipulować szklaną pipetą Pasteura, która została narysowana cienka i wypolerowana ogniowo, z zaokrąglonym, zamkniętym końcem pod kapsułką styczną, do powierzchni nerki. Delikatnie otwórz małą kieszeń na kapsułkę na przeszczepy, zachowując szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić miąższu nerki.</li>
	<li>Przecięta krawędź torebki nerkowej jest podnoszona za pomocą cienkich kleszczyków, a przeszczep jest wprowadzany do kieszeni pod kapsułką za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo. Kilka przeszczepów można umieścić pod torebką nerkową i równomiernie rozmieścić na powierzchni nerki.</li>
	<li>Jeśli w trakcie szczepienia kapsułka ulegnie odwodnieniu, należy ją zwilżyć poprzez zastosowanie sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Po zakończeniu przeszczepu delikatnie unieś boki nacięcia ściany mięśniowej, aby umieścić nerkę z powrotem w jamie ciała. Zwróć uwagę, aby przeszczepy nie wyślizgiwały się spod kapsułki.</li>
	<li>Zamknij ścianę mięśniową pojedynczym szwem (4-0, szew vicryl FS-2). Zabieg chirurgiczny można powtórzyć na przeciwległej nerce poprzez zmianę położenia myszy.</li>
	<li>Po zakończeniu szczepienia mysz może zostać poddana podskórnej implantacji granulek podczas tego samego zabiegu chirurgicznego (patrz krok 7 protokołu).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zębatych wyrównaj krawędzie nacięcia skóry i przyłóż 2-3 klipsy chirurgiczne, aby zamknąć nacięcie. Podaj środek przeciwbólowy (używamy 5-10 mg/kg karprofenu za pomocą iniekcji podskórnej) i umieść mysz w bocznej pozycji leżącej w klatce rekonwalescencji. Zapewnij utrzymanie temperatury ciała za pomocą ciepła z lampy lub poduszki grzewczej. Obserwuj, czy mysz w pełni się regeneruje, co powinno nastąpić w czasie krótszym niż 15 minut.</li>
	<li>Myszy należy obserwować przez następne 24 godziny pod kątem objawów bólu pooperacyjnego, krwawienia i/lub innych powikłań. Regularnie sprawdzaj nacięcie chirurgiczne pod kątem oznak infekcji.</li>
	<li>Usuń klipsy do ran za pomocą chirurgicznego klipsa do usuwania ran 7-14 dni po zabiegu.</li>
</ol>
7. Zabieg chirurgiczny: podskórna implantacja granulek
<ol>
	<li>Powtórz kroki 6.1-6.5 od zabiegu chirurgicznego ksenoprzeszczepu torebki nerkowej.</li>
	<li>Podnieś tylną skórę za pomocą kleszczy do skóry i za pomocą grubych nożyczek wykonaj 1-2 cm nacięcie grzbietowej linii środkowej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek lub sondy oddziel leżącą pod spodem skórę właściwą od ściany ciała w kierunku czaszki.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy do skóry delikatnie unieś czaszkową część nacięcia skóry i delikatnie przytrzymując granulkę hormonu prostymi, ząbkowanymi kleszczami, włóż granulkę i uwolnij na karku szyi, w kieszeni, którą utworzyłeś za pomocą sondy.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.18-6.20 od zabiegu chirurgicznego ksenoprzeszczepu torebki nerkowej. W przypadku wykonywania tylko implantacji podskórnej granulki, należy użyć 1 klipsa chirurgicznego, aby zamknąć nacięcie chirurgiczne.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Facts+Figures%22">Cancer Facts Figures</a>. 4, American Cancer Society. (2010).</li>
<li>McVary, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPH%3A+epidemiology+and+comorbidities%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Manag.+Care%22%5BJournal%5D)">BPH: epidemiology and comorbidities.</a> Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).</li>
<li>Nicholson, T. M., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+and+estrogens+in+benign+prostatic+hyperplasia%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future.</a> Differentiation. 82, 184-199 (2011).</li>
<li>Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormones+and+carcinogenesis+of+the+prostate%3A+the+role+of+estrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens.</a> Differentiation. 75, 871-882 (2007).</li>
<li>Ricke, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormones+stimulate+human+prostate+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis.</a> Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).</li>
<li>Belanger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+concentrations+of+conjugated+and+unconjugated+steroids+in+40-+to+80-year-old+men%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men.</a> J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).</li>
<li>Nicholson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+and+17beta-estradiol+induce+glandular+prostatic+growth%2C+bladder+outlet+obstruction%2C+and+voiding+dysfunction+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice.</a> Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).</li>
<li>Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomy+and+17%CE%B2-estradiol+Replacement+in+Rats+and+Mice%3A+A+Visual+Demonstration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration.</a> J. Vis. Exp. (64), e4013(2012).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Pancreatic+Islets+Into+the+Kidney+Capsule+of+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+tumour+xenografts+transplanted+under+the+renal+capsule+of+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice.</a> Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).</li>
<li>Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+epithelial+induction+by+embryonic+mesenchyme+in+adult+bladder+epithelium+of+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+urology%22%5BJournal%5D)">Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice.</a> Investigative urology. 17, 302-304 (1980).</li>
<li>Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+new+ductal+growth+in+adult+prostatic+epithelium+in+response+to+an+embryonic+prostatic+inductor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor.</a> The Prostate. 8, 209-220 (1986).</li>
<li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+adult+human+prostatic+epithelium+and+rat+urogenital+sinus+mesenchyme+in+a+tissue+recombination+model%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model.</a> Differentiation. 63, 131-140 (1998).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+prostatic+epithelial+model+of+hormonal+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis.</a> Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).</li>
<li>Ricke, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+hormone+action+in+prostatic+carcinogenesis%3A+stromal+androgen+receptors+mediate+prostate+cancer+progression%2C+malignant+transformation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis.</a> Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+efficient+xenograft+models+for+benign+and+malignant+human+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue.</a> The Prostate. 64, 149-159 (2005).</li>
<li>Goto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+prostatic+stem+cells+are+programmed+to+regenerate+a+proximal-distal+ductal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis.</a> Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).</li>
<li>Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regeneration+of+murine+prostate+from+dissociated+cell+populations+of+postnatal+epithelia+and+urogenital+sinus+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).</li>
<li>Priolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genomic+characterization+of+mouse+xenografts+of+human+primary+prostate+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors.</a> Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niniejszy artykuł i przedstawiony w nim protokół opisują wytwarzanie skompresowanych granulek hormonu i / lub leków oraz procedurę chirurgiczną podskórnego implantacji osadów myszom. W zależności od pytania badawczego, które ma być poruszone, technika ta może być wykonywana pojedynczo lub w połączeniu z ksenoprzeszczepem torebki nerkowej rekombinowanych komórek gruczołu krokowego lub ksenoprzeszczepów tkanki prostaty, które są technikami szeroko stosowanymi w badaniach nad prostatą 17-19. Podsumowując, technik...

Rak prostaty (PrCa) i łagodny przerost gruczołu krokowego (BPH) są znaczącymi obciążeniami zdrowotnymi. PrCa jest drugim najczęściej występującym nowotworem narządów litych u mężczyzn i główną przyczyną zgonów związanych z rakiem 1. BPH jest również bardzo rozpowszechniony wśród starszych mężczyzn i szacuje się, że kliniczna manifestacja BPH, objawów ze strony dolnych dróg moczowych (LUTS), dotyczy 50-90% mężczyzn 2. Chociaż wiadomo, że androgeny i estrogeny są ważne w PrCa i BPH, nasze zrozumienie mechanizmów hormonalnych, które leżą u podstaw kancerogenezy i wzrostu, pozostaje niepełne 3,4. Proste i genetycznie wykonalne modele zwierzęce stanowią podstawę badań, które zajmą się tymi priorytetami w badaniach nad prostatą. W chorobach reagujących na hormony, takich jak PrCa i BPH, stosowanie podskórnych granulek hormonu o powolnym uwalnianiu, w izolacji lub w połączeniu z ksenografacją torebki nerkowej (transfer komórek, tkanek lub narządów z jednego gatunku do drugiego) do gospodarza myszy z obniżoną odpornością, zapewnia prostą i powtarzalną metodę badania hormonalnej regulacji wzrostu i kancerogenezy.
Podskórna implantacja granulek hormonalnych jest prostą i powtarzalną techniką badania hormonalnej regulacji kancerogenezy i łagodnego wzrostu prostaty 5. Podskórne wszczepienie dorosłym samcom myszy 25 mg testosteronu (T) i 2,5 mg 17β-estradiolu (E2) powoduje wzrost stężenia E2 w surowicy i stopniowy spadek T, odtwarzając dynamiczne środowisko hormonalne starzejących się mężczyzn 5,6. Ponadto model ten podsumowuje wiele cech klinicznych BPH-LUTS 5,7. Alternatywne metody podawania hormonów obejmują podawanie doustne/przez zgłębnik lub wstrzyknięcie dootrzewnowe, które powodują niepokój u gryzonia, są mniej konsekwentne w dostarczaniu tej samej ilości leku w czasie i są bardziej pracochłonne niż jednorazowa implantacja chirurgiczna. Inne podskórne sposoby dostarczania hormonów i/lub leków obejmują kapsułki Silastic 8. Chociaż mamy również doświadczenie w stosowaniu kapsułek Silastic, sprasowane granulki są preferowane ze względu na ich łatwość użycia i powtarzalność. Co więcej, szybkość uwalniania skompresowanych granulek hormonu lepiej naśladuje dynamiczne proporcje steroidowych hormonów płciowych obserwowane u starzejących się mężczyzn 5,7.
Od czasu rozwoju genetycznie obniżonych ciśnień immunologicznych, opracowano liczne systemy modelowe in vivo wykorzystujące techniki ksenoprzeszczepu do badania szerokiej gamy normalnych i chorych tkanek. Istnieje kilka podstawowych kategorii ksenoprzeszczepów. Ksenoprzeszczepy tkankowe składają się z małego fragmentu nienaruszonej tkanki, która może być normalną strukturą, złośliwym guzem lub łagodnym wzrostem. Szot i wsp. (2007) niedawno naświetlili ksenoprzeszczep torebki nerkowej wysp trzustkowych 9. Aamdal i in. (1985) opisali ksenoprzeszczep torebki nerkowej 27 ludzkich linii komórek rakowych u myszy z obniżoną odpornością 10. Przeszczepy mogą również składać się z pojedynczej unieśmiertelnionej linii komórkowej (rakowej lub nienowotworowej) lub mogą składać się z unieśmiertelnionej linii komórkowej połączonej z komórkami wyizolowanymi z mezenchymy (przeszczep rekombinowany komórek).
Popieramy ksenoprzeszczepy rekombinantów komórkowych w celu zbadania odpowiednich ról zrębu i nabłonka w rozwoju PrCa i BPH. Cunha i in. (1980) jako pierwsi donieśli, że gdy nabłonek dorosłego mysiego pęcherza moczowego jest połączony z embrionalną mezenchymą zatoki moczowo-płciowej (UGM) i ksenografowany pod torebką nerkową samców myszy gospodarzy, tkanka rozwija się w struktury przypominające prostatę acini 11. Norman i in. (1986) wykazali, że nabłonek przewodowy gruczołu krokowego dorosłej myszy i UGM, gdy są połączone w rekombinantach tkankowych, ulegają przewodowemu wzrostowi i morfogenezie rozgałęzień 12. Hayward i in. (1988) wykazali, że ludzki nabłonek prostaty reaguje na indukcyjną mezenchymę płodu w podobny sposób 13. Hormonalny model kancerogenezy gruczołu krokowego, poprzez połączenie unieśmiertelnionej ludzkiej linii komórek nabłonka prostaty BPH-1 z UGM, został po raz pierwszy opisany przez Wang i wsp. 14 (2001) i był szeroko stosowany w naszym laboratorium 15. Model ten dobrze nadaje się do zrozumienia progresji PrCa, ponieważ łagodny nabłonek gruczołu krokowego przekształca się w chorobę przerzutową, modelując zaawansowaną PrCa u ludzi 5. Ponieważ określone składniki mogą być manipulowane genetycznie, przeszczep rekombinowany komórek jest szczególnie przydatny jako podejście do oceny interakcji zrębu i nabłonka.
Inne miejsca odpowiednie do ksenoprzeszczepu to miejsca śródskórne, podskórne i ortotopowe 16. W zależności od interesującej tkanki i procesu chorobowego, mogą to być odpowiednie alternatywne podejścia. Do badania hormonalnej kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnej regulacji wzrostu wybieramy miejsce torebki nerkowej do ksenoprzeszczepu ze względu na wyższy wskaźnik pobierania przeszczepów, obfity dopływ krwi i zdolność do wszczepienia większej liczby ksenoprzeszczepów w jednym zamkniętym miejscu 16. Co więcej, manipulacja hormonalna myszy gospodarza, która prowadzi do atrofii gruczołu krokowego, ogranicza stosowanie ortotopowego przeszczepu prostaty 16.
Ten protokół przedstawia techniki produkcji skompresowanych granulek hormonów/leków i chirurgicznej implantacji, a także ksenoprzeszczep ludzkich komórek prostaty i tkanek za pomocą torebki nerkowej. Razem techniki te zapewniają czuły test w celu określenia, czy genetycznie zmodyfikowana mysz jest bardziej podatna na inicjację PrCa i/lub BPH niż szczepy kontrolne. Ksenografia jest potężną techniką oceny in vivo potencjału komórek eksperymentalnych do rozwoju histologicznych i molekularnych cech nowotworu, a także testem dla nowych strategii leczenia szerokiej gamy łagodnych i złośliwych chorób.

<table><tbody><tr><td>Prasa do peletów</td><td>PARR Industries</td><td>2815</td><td>3mm Punch & Zestaw matryc</td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Ohaus</td><td>1918302</td><td>Voyager lub inny</td></tr><tr><td>palnik Bunsena</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-962Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>L2</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase Pad Kit (wosk do podgrzewania)</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td>Alternatywa dla elektrycznej poduszki grzewczej</td></tr><tr><td>Sterylizator hot bead</td> <td>FST.18000-45</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parownik izofluranowy</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>VAP3000</td><td></td></tr><tr><td>Komora indukcyjna</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>RES644</td><td></td></tr><tr><td>F/AIR Canister</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>4-portowy kolektor</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>RES536</td><td></td></tr><tr><td>Obwody ponownego oddychania</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>CIR529</td><td></td></tr><tr><td>Armatura wlotowo-wylotowa</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>VAP203/4</td><td></td></tr><tr><td>Regulator/Manometr</td><td>ciśnienia Supera Anesthesia Innov</td><td>OXY508</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz tlenu</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>OXY660</td><td></td></tr><tr><td>21mm Przezroczysta rurka</td><td>Supera Anesthesia Innov</td><td>301-150</td><td></td></tr><tr><td>Stożek nosowy małych myszy</td><td>Supera Anestezjolizacja Innov</td><td>ACC526</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny fartuch chirurgiczny</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>350.79866.2</td><td></td></tr><tr><td>Maska chirurgiczna</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>350.50111.2</td><td>2-warstwowa z zaczepami na uszy</td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>001.14100.2</td><td>2 x 2 cale</td></tr><tr><td>Sterylne rękawiczki</td><td>Kimberly Clark</td><td>55092</td><td></td></tr><tr><td>Bouffant</td><td>Midwest Weterynarz</td><td>001.27100.2</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>001.06220.2</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczne mycie peelingów</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>733.80010.3</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pola (fenested)</td><td>General Econopak, Inc</td><td>88VCSTF</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3292</td><td></td></tr><tr><td>Propronian testosteronu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1875</td><td></td></tr><tr><td>17&#946;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2758</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>193.33161.3</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>193.70200.3</td><td>Do wstrzykiwań (Rimadyl)</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-836-3379</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny</td><td>sól fizjologiczna Midwest Vet Dostawa</td><td>193.74504.3</td><td>NaCl 0,9%, do wstrzykiwań</td></tr><tr><td colspan="4"><mocne>NARZĘDZIA CHIRURGICZNE</td></tr><tr><td>Proste ostre/nożyczki</td><td>Fine Scientific Tools (F.S.T.)</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe (ząbkowane, ząbkowane, zakrzywione)</td><td>F.S.T.</td><td>11055-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki</td><td>F.S.T.</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Skalpel</td><td>F.S.T.</td><td>10071-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67050</td> Kleszcze Graefe <td>o długości 5"</td></tr><tr><td>(ząbkowane, zakrzywione)</td> <td>FST</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe (ząbkowane, proste)</td><td>F.S.T.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl Suture</td><td>Midwest Vet Supply</td><td>295-92100.2</td><td>4-0, FS-2, Wchłanialny</td></tr><tr><td>uchwyt igły z działaniem nożycowym</td><td>FST</td><td></td><td></td>12002012</tr><tr><td>Klipsy do ran</td><td>Braintree Scientific</td><td>ACS CS</td><td>Może używać klipsów 7 mm lub 9 mm</td></tr><tr><td>Reflex Wound Clipper</td><td>F.S.T.</td><td>12031-09</td><td>Odpowiada rozmiarowi klipsa</td></tr><tr><td>do ran Will Clip Remover</td><td>FST</td><td>12033-00</td><td>Uniwersalny</td></tr><tr><td>pojemnik do sterylizacji</td><td>FST</td><td>20810-01</td><td>Każdy pojemnik do sterylizacji w autoklawie wystarczy</td></tr><tr><td>Strzykawka z igłą</td><td>BD</td><td>148292C</td><td>1cc, 25Gx1</td></tr><tr><td>Aplikator kolczyków</td><td>National Band Tag Co.</td><td>1005s1</td><td>Alternatywa dla kolczyków do uszu z nacięciami na uszy</td></tr><tr><td>dla małych zwierząt</td><td>National Band Tag Co.</td><td>1005-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ksenograf torebki nerkowej i podskórna implantacja osadu w celu oceny kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnego przerostu gruczołu krokowego

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

Nowe terapie dwóch powszechnych chorób prostaty, raka prostaty (PrCa) i łagodnego przerostu prostaty (BPH), zależą krytycznie od eksperymentów oceniających ich regulację hormonalną. Steroidowe hormony płciowe (zwłaszcza androgeny i estrogeny) są ważne w PrCa i BPH; Badamy ich rolę w indukowaniu wzrostu prostaty i kancerogenezy u myszy za pomocą eksperymentów z użyciem skompresowanych granulek hormonów. Granulki hormonów i / lub leków są łatwo wytwarzane za pomocą prasy do peletów i chirurgicznie wszczepiane do tkanki podskórnej samca myszy gospodarza. Opisano również protokół oceny kancerogenezy hormonalnej poprzez połączenie podskórnej implantacji osadów hormonalnych z ksenografacją rekombinantów komórek prostaty pod torebką nerkową myszy z obniżoną odpornością. Co więcej, podskórna implantacja osadów hormonalnych, w połączeniu z ksenografem tkanki BPH w torebki nerkowej, jest przydatna do lepszego zrozumienia regulacji hormonalnej łagodnego wzrostu prostaty i testowania nowych terapii ukierunkowanych na szlaki steroidowych hormonów płciowych.

W zależności od testowanej hipotezy, ksenoprzeszczep do torebki nerki tkanek lub rekombinantów komórkowych można przeprowadzić samodzielnie lub w połączeniu z podskórną implantacją peletów hormonalnych. Schemat hipotetycznego eksperymentu łączącego ksenoprzeszczep do torebki nerki z podskórną implantacją peletów hormonalnych przedstawiono na Rysunku 1. Do wytwarzania sprasowanych peletów za pomocą prasy do peletów można wykorzystać różne substancje w formie proszku i/lub kryształów. Na Rysunku 2<...

Opisujemy produkcję skompresowanych granulek hormonów, jak również podskórne chirurgiczne wszczepianie implantów myszom. Strategia ta może być połączona ze wzrostem ksenoprzeszczepów komórkowych i tkankowych pod torebką nerkową nagich myszy w celu oceny kancerogenezy hormonalnej i regulacji łagodnego wzrostu prostaty.

Ksenograf torebki nerkowej i podskórna implantacja osadu w celu oceny kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnego przerostu gruczołu krokowego

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Techniki przedstawione w tym filmie są przydatne w eksperymentach służących ocenie hormonalnej regulacji kancerogenezy oraz łagodnego przerostu prostaty. W pierwszej kolejności wykorzystuje się praski do przygotowania pelletów hormonalnych, które umożliwią ciągłe podawanie substancji. Następnie, po eksteryzacji nerki, przygotowywane są pipety szklane z zaokrąglonymi końcami.Końcówka do pipety służy jako pomoc przy wprowadzaniu przeszczepu. Następnie skompresowane pellety hormonalne są implantowane podskórnie. W efekcie uzyskuje się wyniki wykazujące wpływ terapii hormonalnej na wzrost łagodnych ksenoprzeszczepów tkankowych.Techniki przedstawione w tym filmie są proste do wykonania i powtarzalne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak rola hormonów w transformacji komórek łagodnych w nowotworowe, a także sposób regulacji łagodnego przerostu prostaty przez hormony. Zastosowania tej techniki obejmują potencjalne nowe terapie i strategie zapobiegawcze w leczeniu łagodnego przerostu prostaty oraz raka prostaty.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mają trudności z aspektem technicznym dotyczącym torebki nerkowej. Pellety ksenoprzes

renal-capsule-xenografting-subcutaneous-pellet-implantation-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeszczepianie torebki nerkowej i wszczepianie granulek podskórnych w celu oceny rakowiactwa prostaty i łagodnego wolakówkowego nadmiernego wzrostu prostaty

W tym filmie pokazujemy procedurę podawania komórek raka prostaty do modelu mysiego do wstrzykiwania dogruczołowo prostaty. Ortotopowe modele myszy mogą być wykorzystywane do badania pochodzenia choroby i odpowiedzi na terapie lecznicze w nieinwazyjnym i klinicznie istotnym środowisku.

Wstrzyknięcie komórek rakowych do gruczołu krokowego: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty

W tym filmie pokazujemy wszczepianie przeszczepów tkanek raka prostaty pochodzących od człowieka do torebki nerkowej myszy biorcy z obniżoną odpornością. Technika ta może być wykorzystana do oceny progresji guza i opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Ksenograf guza torebki nerkowej: technika generowania eksperymentalnego modelu zwierzęcego do oceny kancerogenezy prostaty

Aby zademonstrować obrazowanie molekularne raka MR za pomocą środka kontrastowego MRI z małym peptydem specyficznym dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza w modelu raka prostaty u myszy.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Tutaj prezentujemy protokół dosercowego wstrzykiwania ludzkich komórek raka prostaty w celu wygenerowania mysiego modelu ze zmianami przerzutowymi do kości.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

Poznaj technikę ksenografu torebki nerkowej i implantacji podskórnej pelletów hormonalnych w myszach. Ta metoda pozwala ocenić kancerogenezę hormonalną i łagodny przerost gruczołu krokowego.

Ksenograf torebki nerkowej i podskórna implantacja osadu w celu oceny kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnego przerostu gruczołu krokowego (Wideo) | JoVE Journal

Ksenograf torebki nerkowej i podskórna implantacja osadu w celu oceny kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnego przerostu gruczołu krokowego

Przeglądaj więcej filmów