Obrazowanie tkanek biologicznych metodą spektrometrii mas z desorpcją i jonizacją metodą elektrorozpylania
12 lipca 2013
Spektrometria mas z jonizacją metodą desorpcji (DESI-MS) to metoda otoczenia, za pomocą której próbki, w tym tkanki biologiczne, mogą być obrazowane przy minimalnym przygotowaniu próbki. Poprzez rasterowanie próbki poniżej sondy jonizacyjnej, ta technika oparta na rozpylaniu zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, aby dostrzec interesujące cechy molekularne w obrębie skrawków tkanki.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest mapowanie przestrzennego rozkładu substancji chemicznych w tkance biologicznej przy użyciu techniki spektrometrii mas otoczenia. Osiąga się to poprzez użycie pneumatycznie wspomaganego sprayu DESI do dysorowania i jonizacji cząsteczek obecnych w tkance. W drugim etapie źródło jonów DESI jest skanowane w kontrolowany sposób na całej powierzchni próbki.
Następnie informacje o widmie masowym są korelowane z ruchem przestrzennym stolika próbki w celu wykreślenia intensywności jonów w funkcji położenia X i Y. Ostatecznie tworząc obraz chemiczny. Wyniki pokazują, że istnieje wyraźny rozkład lipidów w owiniętych tkankach mózgowych między istotą szarą i białą na podstawie obrazów spektrometrii mas wybranych jonów lipidowych.
Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w rozkład chemiczny w tkankach biologicznych. Może być również stosowany w wielu innych systemach, w tym płytkach chromatografii cienkowarstwowej, mineralnych reakcjach powierzchniowych i algach morskich. Przed rozpoczęciem tej procedury zamontuj tkankę na szkiełku mikroskopowym za pomocą próby ACEDONITE z 1% kwasem octowym, gdy rozpuszczalnik DESI włączy pompę strzykawkową o natężeniu przepływu pięciu mikrolitrów na minutę.
Gdy rozpuszczalnik zacznie kapać z końcówki źródła DESI, włącz gaz do nebulizacji azotu pod ciśnieniem 160 PS. Następnie włączam zasilacz wysokiego napięcia podłączony do źródła jonów, stosując napięcie 3 600 woltów w celu optymalnego przenoszenia jonów. Dostosuj wysokość stolika tak, aby kapilara interfejsu MS unosiła się nad powierzchnią próbki. Kapilara powinna znajdować się mniej niż jeden milimetr od powierzchni i mieć kąt zbierania około 15 stopni.
Po zamontowaniu szkiełka na stoliku ruchu, umieść końcówkę trzy milimetry od powierzchni próbki i pięć milimetrów od wlotu kapilary MS z sondą pod kątem 55 stopni w stosunku do powierzchni próbki. Następnie ustaw sondę DESI w wymiarze X w stosunku do wlotu kapilary MS, tak aby znajdowały się bezpośrednio w linii. Korzystanie z dodatkowej sekcji tkankowej.
Ustaw separację Y między końcówką źródła a wlotem kapilary na około cztery milimetry, a separację Z między końcówką a powierzchnią próbki na około 1,5 milimetra. Następnie dostosuj odległość, na jaką wewnętrzna kapilara wystaje z zewnętrznej kapilary źródła, aby uzyskać maksymalną czułość i minimalny rozmiar plamki uderzenia. Blask światła w pomieszczeniu na szkiełku mikroskopowym można wykorzystać do lepszego zobaczenia miejsca uderzenia w celu poprawy czułości podczas procesu jonizacji.
Podgrzej kapilarę transferową za pomocą grzałki linowej lub bloku grzewczego do programu 100 stopni Celsjusza. Oprogramowanie sterujące lab view VI dla pożądanych warunków obrazowania w oparciu o rozmiar pióropusza uderzeniowego DESI i optymalną czułość. Użyj prędkości skanowania stołu montażowego 160 mikrometrów na sekundę i wyrównaj odstępy między rzędami 200 mikrometrów.
Podaj ścieżkę do katalogu i nazwę pliku dla plików pozycji i czasu, które mają być rejestrowane podczas obrazów w widoku laboratoryjnym vi. Przygotowując się do akwizycji danych widma masowego, oprogramowanie automatycznie oblicza całkowity czas potrzebny na wprowadzenie obrazowania do spektrometru mas w minutach przed rozpoczęciem akwizycji danych. Następnie umieść miejsce uderzenia sprayu w lewym górnym rogu obszaru, który ma być sfotografowany.
Rozpocznij jednocześnie akwizycję danych MS i ruchu scenicznego. Po zakończeniu zbierania danych przywróć spektrometr masowy w tryb czuwania, wyłącz wysokie napięcie źródła DESI, wyłącz gazowy azot i pompę strzykawkową za pomocą menedżera danych w centrum masy. Przekonwertuj uzyskane dane na dane TED, a następnie wyeksportuj je w formacie CDF.
Na koniec prześlij surowe dane spektralne mas CDF i dwa pliki tekstowe dotyczące pozycji i czasu na stronę internetową Omnis SPECT lub użyj mapy biologicznej, aby zobrazować dane przetworzone w Firefly. Pokazano tutaj reprezentatywne widmo uzyskane w trybie dodatnim z nieleczonego wycinka mózgu szczura. W trybie dodatnim widmo masowe jest zdominowane przez fosfatydylocholinę ze względu na ich wysoką skuteczność żelaza i jonizacji, które przypisuje się dodatnio naładowanej czwartorzędowej grupie amonowej.
Ponadto całkowity obraz jonowy sekcji tkankowej wykazuje obfity sygnał w całym wycinku mózgu. Rozkład przestrzenny przykładowych lipidów pokazuje, jak zmienia się względna obfitość różnych gatunków fosfatydylocholiny między istotą szarą i białą mózgu. Na przykład gatunek potasu fosfatydylocholiny 34 do jednego o stosunku ładunku masowego 7 98 0,5364 wykazuje zwiększoną intensywność w korze móżdżku lub istocie szarej.
Natomiast gatunek potass fosfatydylocholiny 36 do jednego o stosunku ładunku masto 8 26 0,5558 wykazuje zwiększoną intensywność w szypułce móżdżku lub istocie białej. Złożony obraz uzyskany dla dwóch jonów podkreśla kontrast w rozmieszczeniu lipidów w całym przekroju tkanki. Podczas wykonywania tego typu eksperymentu ważne jest, aby dokładnie zoptymalizować stopień próbki źródła DSI i geometrię wlotu.
Zmienne te mają kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania dsi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano spektrometrię mas z desorpcyjną jonizacją elektrosprayową (DESI-MS) do mapowania przestrzennego rozkładu substancji chemicznych w tkankach biologicznych. Dzięki zastosowaniu techniki opartej na rozpylaniu metoda ta umożliwia obrazowanie przy minimalnym przygotowaniu próbek i zapewnia rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do rozróżnienia cech molekularnych w przekrojach tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektrometria mas
- Obrazowanie biologiczne
- Analiza tkanek
Wstęp
- DESI-MS jest techniką jonizacji w warunkach otoczenia.
- Umożliwia ona analizę tkanek biologicznych bez konieczności rozbudowanego przygotowania próbek.
- Metoda ta pozwala na rozróżnienie różnych rozkładów molekularnych.
- Jest ona szczególnie przydatna do badania złożonych struktur tkankowych.
Cel badania
- Mapowanie rozkładu przestrzennego substancji chemicznych w tkankach biologicznych.
- Analiza rozkładu lipidów w tkankach mózgu.
- Tworzenie obrazów chemicznych na podstawie danych ze spektrometrii mas.
Zastosowane metody
- Natrysk wspomagany pneumatycznie w celu desorpcji i jonizacji.
- Skanowanie źródła jonów DESI w obrębie obszaru próbki.
- Korelacja informacji ze spektru masowego z ruchem przestrzennym.
- Wykreślanie intensywności jonów jako funkcji pozycji X i Y.
Główne wyniki
- Zaobserwowano odmienne rozkłady lipidów w istocie szarej i białej.
- Obrazy z spektrometrii mas ujawniły specyficzne wzorce jonów lipidowych.
- Technika ta pozwoliła na stworzenie szczegółowych obrazów chemicznych tkanek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia składu i organizacji tkanek.
Wnioski
- Technika DESI-MS jest skuteczna w obrazowaniu tkanek biologicznych.
- Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o rozmieszczeniu lipidów w tkankach mózgu.
- Może ona stanowić wartościowe narzędzie w dalszych badaniach nad analizą tkanek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Spektrometria mas z obrazowaniem molekularnym z wykorzystaniem desorpcyjnej jonizacji elektrosprayowej (DESI-MSI) umożliwia niespecyficzne, wysoce precyzyjne obrazowanie molekularne tkanek biologicznych w warunkach otoczenia, eliminując konieczność czasochłonnego przygotowania próbek. Możliwość ta wspiera wczesne etapy odkrywania leków oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie rozdzielczych przestrzennie informacji chemicznych, które są kluczowe dla walidacji celu terapeutycznego i poszukiwania biomarkerów w tkankach. Integracja DESI-MSI z procesami odkrywania zwiększa pewność prognostyczną i pozwala na podejmowanie decyzji dotyczących portfela projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mapowanie przestrzenne gatunków molekularnych w celu wyjaśnienia tkankowo specyficznych szlaków biochemicznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ujawnienie wzorców rozmieszczenia kluczowych biomolekuł.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezpośredniej wizualizacji heterogeniczności molekularnej.
- Dostarcza danych o wysokiej zawartości (high-content data) służących do priorytetyzacji celów na podstawie lokalizacji tkankowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ilościowe, rozdzielone przestrzennie wyniki w celu standaryzacji i powtarzalności analizy.
- Przygotowuje zwalidowane przekroje tkankowe do późniejszego przesiewu i oceny związków.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych typów tkanek i warunków eksperymentalnych.
- Wspiera wiarygodne porównywanie wpływu związków na chemię tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia uzgodnienie wyników obrazowania molekularnego z modelami tkankowymi istotnymi dla danej choroby w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Pozwala na identyfikację biomarkerów przestrzennych do walidacji przedklinicznej.
- Wspiera rozwój projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez powiązanie wyników z etapu odkryć z efektami na poziomie tkankowym.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy, co pomaga w wyborze odpowiedniego modelu przedklinicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
DESI-MSI wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, łącząc odkrycia molekularne z walidacją na poziomie tkanki i wspierając decyzje dotyczące identyfikacji wiodących kandydatów na leki.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i mapowanie szlaków poprzez wykorzystanie danych molekularnych o rozdzielczości przestrzennej.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do rozwoju testów i przesiewania związków.
- Analityka: Generuje wielowymiarowe zestawy danych do statystycznego porównywania obszarów tkankowych i gatunków molekularnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z architekturą tkanki istotną dla choroby oraz lokalizacją biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można dostosować do wielu typów tkanek i pytań badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na tkankach.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy dzięki obrazowaniu w warunkach otoczenia, bez konieczności przygotowania próbek, oraz poprzez zestandaryzowane protokoły.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz alokację kapitału dzięki dostarczeniu wiarygodnych danych na poziomie tkankowym we wczesnej fazie odkryć.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów o potwierdzonej istotności tkankowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie obrazowania spektrometrią mas oraz analizy danych przestrzennych.
- Wymaga precyzyjnej kontroli geometrii źródła DESI oraz wyrównania stolika z próbką.
- Wymagane jest kompatybilne instrumentarium oraz oprogramowanie do akwizycji i wizualizacji danych.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest standaryzacja pomiędzy różnymi typami tkanek i układami doświadczalnymi.
- Optymalizacja parametrów źródła jest kluczowa dla wierności obrazu i czułości pomiaru.
