Rozdział białek metodą SDS-PAGE
SDS-PAGE to technika stosowana przez wielu badaczy do rozdzielania mieszanin białek ze względu na ich wielkość. Prawidłowe przeprowadzenie tej procedury jest niezbędnym pierwszym krokiem dla wielu metod analizy białek, takich jak immunoblotting. Sama w sobie stanowi użyteczne narzędzie do oceny wielkości i czystości białka.
Aby zrozumieć technikę SDS-PAGE, należy najpierw zapoznać się z jej głównymi komponentami. SDS-PAGE to skrót od elektroforezy żelowej w poliakrylamidzie z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu. Dodecylosiarczan sodu, czyli pierwsza część tej nazwy („SDS”), jest detergentem anionowym. Oznacza to, że składa się on z grupy hydrofilowej o ładunku netto ujemnym oraz długiego łańcucha hydrofobowego o ładunku neutralnym.
Łańcuch hydrofobowy otacza białka proporcjonalnie do ich masy, w stosunku 1,4 g SDS na gram białka. Zapewnia to białkom siłę napędową niezbędną do rozdziału zależnego od wielkości w polu elektrycznym.
Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie wykorzystuje hydrożel wykonany z poliakrylamidu. Poliakrylamid jest polimerem, który tworzy bardzo regularną macierz, przez którą mogą przemieszczać się białka. Im bardziej stężony jest żel, tym wolniej białka będą przez niego migrować pod wpływem pola elektrycznego. Proces wykorzystywania przestrzennie jednorodnego pola elektrycznego do wpływania na ruch obiektów nazywa się elektroforezą.
Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadza się na białkach izolowanych z wielu różnych źródeł, w tym z hodowli komórkowych, tkanek, krwi, moczu oraz drożdży.
Białka z tych różnorodnych źródeł muszą zostać najpierw oddzielone od innych składników komórkowych przy użyciu technik takich jak homogenizacja i wirowanie, którym często towarzyszy zastosowanie buforów lizujących.
Po izolacji białka często mierzy się jego stężenie, aby zapewnić równomierne nałożenie próbek, porównując ilość białka w próbce ze standardami albuminy w kolorymetrycznym teście kwasem bicinchoninowym (BCA).
Ważnym krokiem, o którym należy pamiętać, jest dodanie buforu do nakładania próbek. Bufor ten pełni trzy główne funkcje. Po pierwsze, dzięki SDS i dodatkowym czynnikom redukującym, denaturuje on białka, co w praktyce oznacza przekształcenie złożonych struktur białkowych w liniowy łańcuch aminokwasów. Po drugie, zawiera glicerynę, która zapobiega wypływaniu próbki podczas nakładania jej do studzienek żelu. I wreszcie, większość komercyjnych buforów do nakładania zawiera barwnik, taki jak błękit bromofenolowy, który pozwala monitorować postęp etapu elektroforezy.
Po dodaniu buforu do nakładania próbki należy wymieszać, a następnie gotować przez 5 minut. Pozwala to na rozerwanie silnych wiązań dwusiarczkowych w białkach przy pomocy czynnika redukującego, takiego jak beta-merkaptoetanol. Po rozerwaniu wszystkich wiązań dwusiarczkowych SDS może równomiernie otoczyć białka.
Następnie próbki są szybko wirowane, po czym są gotowe do nałożenia do układu żelowego w celu przeprowadzenia elektroforezy.
Przed nałożeniem próbek należy najpierw złożyć system żelowy. Proces ten rozpoczyna się od zakupu lub przygotowania żelu poliakrylamidowego. Gotowe żele stają się coraz popularniejsze, ponieważ akrylamid jest neurotoksyczny i może powodować uszkodzenia mózgu. Kaseta żelowa zawiera dołki służące do nakładania próbek.
Po umocowaniu żeli komory wewnętrzna i zewnętrzna są wypełniane buforem o takim samym stężeniu jonów, jaki zastosowano do przygotowania żeli. Tworzy to obwód elektryczny, który przechodzi niezakłóconym strumieniem od katody, przez żel, aż do anody.
Następnie do żelu nakłada się zazwyczaj markery masy cząsteczkowej, a po nich próbki. W miarę prowadzenia elektroforezy marker będzie się rozdzielać, tworząc widoczne prążki białkowe o znanych rozmiarach. W końcowych etapach prążki te mogą posłużyć do obliczenia wielkości każdego białka.
Po nałożeniu wszystkich próbek zaciski dodatni i ujemny na komorze elektroforetycznej zostają podłączone do źródła zasilania zdolnego do utrzymania stałego napięcia przez dłuższy czas. Elektroforezę zazwyczaj rozpoczyna się od napięcia około 60V, aż cała próbka przedostanie się do obszaru żelu zwanego „żelem startowym” (stacking gel). Następnie napięcie zwiększa się do około 200V na 30 minut do 1 godziny, w zależności od rozmiaru i stężenia żelu oraz wielkości analizowanego białka.
Po zakończeniu elektroforezy kasetę wyjmuje się i otwiera, aby odsłonić żel. Następnie żel można zabarwić typowym barwnikiem do białek, takim jak błękit Coomassie lub barwnik srebrowy, w celu wizualizacji prążków białkowych wewnątrz żelu. Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków zawierających już 50 nanogramów białka, podczas gdy barwienie srebrowe może wykryć prążki o masie zaledwie 1 nanograma białka.
W dwuwymiarowej elektroforezie żelowej próbki są rozdzielane na żelach według dwóch różnych właściwości, kolejno w każdym wymiarze. Najpierw próbki są naniesione i rozmieszczone zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi na paskach z lokalnym gradientem pH. Następnie białka w pasku ulegają denaturacji i są umieszczane na powierzchni typowego żelu poliakrylamidowego, gdzie zostają unieruchomione za pomocą świeżego roztworu żelu. Następnie przeprowadzane jest rozdzielanie w drugim wymiarzie metodą SDS-PAGE.
Choć ogniskowanie izoelektryczne nie jest jedyną opcją w dwuwymiarowej elektroforezie żelowej, jest ono najczęściej stosowane. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa to nieocenione narzędzie, które dostarcza informacji o kompleksach białkowych i organizacji podorganellarnej.
Po przeprowadzeniu elektroforezy żelowej bardzo powszechnym kolejnym krokiem jest transfer białek z żelu na membranę wykonaną z PVDF lub nylonu w celu analizy. Można następnie użyć specyficznych przeciwciał do sondowania membrany i poszukiwania białek będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiono tutaj typowe wyniki immunoblottingu, w którym badacz zastosował trzy różne techniki wzmocnienia sygnału, aby ustalić, która z nich najlepiej wykazuje obecność białka Pit-1 w serii rozcieńczeń.
Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat rozdziału białek metodą SDS-PAGE. Powinni Państwo teraz rozumieć etapy rozdzielania białek ze względu na ich wielkość przy użyciu tej skutecznej techniki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, czyli SDS-PAGE, jest powszechnie stosowaną techniką rozdzielania mieszanin białek wy…
SDS-PAGE to technika stosowana przez wielu badaczy do rozdzielania mieszanin białek ze względu na ich wielkość. Prawidłowe przeprowadzenie tej procedury jest niezbędnym pierwszym krokiem dla wielu metod analizy białek, takich jak immunoblotting. Sama w sobie stanowi użyteczne narzędzie do oceny wielkości i czystości białka.
Aby zrozumieć technikę SDS-PAGE, należy najpierw zapoznać się z jej głównymi komponentami. SDS-PAGE to skrót od elektroforezy żelowej w poliakrylamidzie z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu. Dodecylosiarczan sodu, czyli pierwsza część tej nazwy („SDS”), jest detergentem anionowym. Oznacza to, że składa się on z grupy hydrofilowej o ładunku netto ujemnym oraz długiego łańcucha hydrofobowego o ładunku neutralnym.
Łańcuch hydrofobowy otacza białka proporcjonalnie do ich masy, w stosunku 1,4 g SDS na gram białka. Zapewnia to białkom siłę napędową niezbędną do rozdziału zależnego od wielkości w polu elektrycznym.
Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie wykorzystuje hydrożel wykonany z poliakrylamidu. Poliakrylamid jest polimerem, który tworzy bardzo regularną macierz, przez którą mogą przemieszczać się białka. Im bardziej stężony jest żel, tym wolniej białka będą przez niego migrować pod wpływem pola elektrycznego. Proces wykorzystywania przestrzennie jednorodnego pola elektrycznego do wpływania na ruch obiektów nazywa się elektroforezą.
Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadza się na białkach izolowanych z wielu różnych źródeł, w tym z hodowli komórkowych, tkanek, krwi, moczu oraz drożdży.
Białka z tych różnorodnych źródeł muszą zostać najpierw oddzielone od innych składników komórkowych przy użyciu technik takich jak homogenizacja i wirowanie, którym często towarzyszy zastosowanie buforów lizujących.
Po izolacji białka często mierzy się jego stężenie, aby zapewnić równomierne nałożenie próbek, porównując ilość białka w próbce ze standardami albuminy w kolorymetrycznym teście kwasem bicinchoninowym (BCA).
Ważnym krokiem, o którym należy pamiętać, jest dodanie buforu do nakładania próbek. Bufor ten pełni trzy główne funkcje. Po pierwsze, dzięki SDS i dodatkowym czynnikom redukującym, denaturuje on białka, co w praktyce oznacza przekształcenie złożonych struktur białkowych w liniowy łańcuch aminokwasów. Po drugie, zawiera glicerynę, która zapobiega wypływaniu próbki podczas nakładania jej do studzienek żelu. I wreszcie, większość komercyjnych buforów do nakładania zawiera barwnik, taki jak błękit bromofenolowy, który pozwala monitorować postęp etapu elektroforezy.
Po dodaniu buforu do nakładania próbki należy wymieszać, a następnie gotować przez 5 minut. Pozwala to na rozerwanie silnych wiązań dwusiarczkowych w białkach przy pomocy czynnika redukującego, takiego jak beta-merkaptoetanol. Po rozerwaniu wszystkich wiązań dwusiarczkowych SDS może równomiernie otoczyć białka.
Następnie próbki są szybko wirowane, po czym są gotowe do nałożenia do układu żelowego w celu przeprowadzenia elektroforezy.
Przed nałożeniem próbek należy najpierw złożyć system żelowy. Proces ten rozpoczyna się od zakupu lub przygotowania żelu poliakrylamidowego. Gotowe żele stają się coraz popularniejsze, ponieważ akrylamid jest neurotoksyczny i może powodować uszkodzenia mózgu. Kaseta żelowa zawiera dołki służące do nakładania próbek.
Po umocowaniu żeli komory wewnętrzna i zewnętrzna są wypełniane buforem o takim samym stężeniu jonów, jaki zastosowano do przygotowania żeli. Tworzy to obwód elektryczny, który przechodzi niezakłóconym strumieniem od katody, przez żel, aż do anody.
Następnie do żelu nakłada się zazwyczaj markery masy cząsteczkowej, a po nich próbki. W miarę prowadzenia elektroforezy marker będzie się rozdzielać, tworząc widoczne prążki białkowe o znanych rozmiarach. W końcowych etapach prążki te mogą posłużyć do obliczenia wielkości każdego białka.
Po nałożeniu wszystkich próbek zaciski dodatni i ujemny na komorze elektroforetycznej zostają podłączone do źródła zasilania zdolnego do utrzymania stałego napięcia przez dłuższy czas. Elektroforezę zazwyczaj rozpoczyna się od napięcia około 60V, aż cała próbka przedostanie się do obszaru żelu zwanego „żelem startowym” (stacking gel). Następnie napięcie zwiększa się do około 200V na 30 minut do 1 godziny, w zależności od rozmiaru i stężenia żelu oraz wielkości analizowanego białka.
Po zakończeniu elektroforezy kasetę wyjmuje się i otwiera, aby odsłonić żel. Następnie żel można zabarwić typowym barwnikiem do białek, takim jak błękit Coomassie lub barwnik srebrowy, w celu wizualizacji prążków białkowych wewnątrz żelu. Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków zawierających już 50 nanogramów białka, podczas gdy barwienie srebrowe może wykryć prążki o masie zaledwie 1 nanograma białka.
W dwuwymiarowej elektroforezie żelowej próbki są rozdzielane na żelach według dwóch różnych właściwości, kolejno w każdym wymiarze. Najpierw próbki są naniesione i rozmieszczone zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi na paskach z lokalnym gradientem pH. Następnie białka w pasku ulegają denaturacji i są umieszczane na powierzchni typowego żelu poliakrylamidowego, gdzie zostają unieruchomione za pomocą świeżego roztworu żelu. Następnie przeprowadzane jest rozdzielanie w drugim wymiarzie metodą SDS-PAGE.
Choć ogniskowanie izoelektryczne nie jest jedyną opcją w dwuwymiarowej elektroforezie żelowej, jest ono najczęściej stosowane. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa to nieocenione narzędzie, które dostarcza informacji o kompleksach białkowych i organizacji podorganellarnej.
Po przeprowadzeniu elektroforezy żelowej bardzo powszechnym kolejnym krokiem jest transfer białek z żelu na membranę wykonaną z PVDF lub nylonu w celu analizy. Można następnie użyć specyficznych przeciwciał do sondowania membrany i poszukiwania białek będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiono tutaj typowe wyniki immunoblottingu, w którym badacz zastosował trzy różne techniki wzmocnienia sygnału, aby ustalić, która z nich najlepiej wykazuje obecność białka Pit-1 w serii rozcieńczeń.
Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat rozdziału białek metodą SDS-PAGE. Powinni Państwo teraz rozumieć etapy rozdzielania białek ze względu na ich wielkość przy użyciu tej skutecznej techniki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
SDS-PAGE to technika stosowana przez wielu badaczy do rozdzielania mieszanin białek ze względu na ich wielkość. Prawidłowe przeprowadzenie tej procedury jest niezbędnym pierwszym krokiem dla wielu metod analizy białek, takich jak immunoblotting. Sama w sobie stanowi użyteczne narzędzie do oceny wielkości i czystości białka.
Aby zrozumieć technikę SDS-PAGE, należy najpierw zapoznać się z jej głównymi komponentami. SDS-PAGE to skrót od elektroforezy żelowej w poliakrylamidzie z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu. Dodecylosiarczan sodu, czyli pierwsza część tej nazwy („SDS”), jest detergentem anionowym. Oznacza to, że składa się on z grupy hydrofilowej o ładunku netto ujemnym oraz długiego łańcucha hydrofobowego o ładunku neutralnym.
Łańcuch hydrofobowy otacza białka proporcjonalnie do ich masy, w stosunku 1,4 g SDS na gram białka. Zapewnia to białkom siłę napędową niezbędną do rozdziału zależnego od wielkości w polu elektrycznym.
Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie wykorzystuje hydrożel wykonany z poliakrylamidu. Poliakrylamid jest polimerem, który tworzy bardzo regularną macierz, przez którą mogą przemieszczać się białka. Im bardziej stężony jest żel, tym wolniej białka będą przez niego migrować pod wpływem pola elektrycznego. Proces wykorzystywania przestrzennie jednorodnego pola elektrycznego do wpływania na ruch obiektów nazywa się elektroforezą.
Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadza się na białkach izolowanych z wielu różnych źródeł, w tym z hodowli komórkowych, tkanek, krwi, moczu oraz drożdży.
Białka z tych różnorodnych źródeł muszą zostać najpierw oddzielone od innych składników komórkowych przy użyciu technik takich jak homogenizacja i wirowanie, którym często towarzyszy zastosowanie buforów lizujących.
Po izolacji białka często mierzy się jego stężenie, aby zapewnić równomierne nałożenie próbek, porównując ilość białka w próbce ze standardami albuminy w kolorymetrycznym teście kwasem bicinchoninowym (BCA).
Ważnym krokiem, o którym należy pamiętać, jest dodanie buforu do nakładania próbek. Bufor ten pełni trzy główne funkcje. Po pierwsze, dzięki SDS i dodatkowym czynnikom redukującym, denaturuje on białka, co w praktyce oznacza przekształcenie złożonych struktur białkowych w liniowy łańcuch aminokwasów. Po drugie, zawiera glicerynę, która zapobiega wypływaniu próbki podczas nakładania jej do studzienek żelu. I wreszcie, większość komercyjnych buforów do nakładania zawiera barwnik, taki jak błękit bromofenolowy, który pozwala monitorować postęp etapu elektroforezy.
Po dodaniu buforu do nakładania próbki należy wymieszać, a następnie gotować przez 5 minut. Pozwala to na rozerwanie silnych wiązań dwusiarczkowych w białkach przy pomocy czynnika redukującego, takiego jak beta-merkaptoetanol. Po rozerwaniu wszystkich wiązań dwusiarczkowych SDS może równomiernie otoczyć białka.
Następnie próbki są szybko wirowane, po czym są gotowe do nałożenia do układu żelowego w celu przeprowadzenia elektroforezy.
Przed nałożeniem próbek należy najpierw złożyć system żelowy. Proces ten rozpoczyna się od zakupu lub przygotowania żelu poliakrylamidowego. Gotowe żele stają się coraz popularniejsze, ponieważ akrylamid jest neurotoksyczny i może powodować uszkodzenia mózgu. Kaseta żelowa zawiera dołki służące do nakładania próbek.
Po umocowaniu żeli komory wewnętrzna i zewnętrzna są wypełniane buforem o takim samym stężeniu jonów, jaki zastosowano do przygotowania żeli. Tworzy to obwód elektryczny, który przechodzi niezakłóconym strumieniem od katody, przez żel, aż do anody.
Następnie do żelu nakłada się zazwyczaj markery masy cząsteczkowej, a po nich próbki. W miarę prowadzenia elektroforezy marker będzie się rozdzielać, tworząc widoczne prążki białkowe o znanych rozmiarach. W końcowych etapach prążki te mogą posłużyć do obliczenia wielkości każdego białka.
Po nałożeniu wszystkich próbek zaciski dodatni i ujemny na komorze elektroforetycznej zostają podłączone do źródła zasilania zdolnego do utrzymania stałego napięcia przez dłuższy czas. Elektroforezę zazwyczaj rozpoczyna się od napięcia około 60V, aż cała próbka przedostanie się do obszaru żelu zwanego „żelem startowym” (stacking gel). Następnie napięcie zwiększa się do około 200V na 30 minut do 1 godziny, w zależności od rozmiaru i stężenia żelu oraz wielkości analizowanego białka.
Po zakończeniu elektroforezy kasetę wyjmuje się i otwiera, aby odsłonić żel. Następnie żel można zabarwić typowym barwnikiem do białek, takim jak błękit Coomassie lub barwnik srebrowy, w celu wizualizacji prążków białkowych wewnątrz żelu. Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków zawierających już 50 nanogramów białka, podczas gdy barwienie srebrowe może wykryć prążki o masie zaledwie 1 nanograma białka.
W dwuwymiarowej elektroforezie żelowej próbki są rozdzielane na żelach według dwóch różnych właściwości, kolejno w każdym wymiarze. Najpierw próbki są naniesione i rozmieszczone zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi na paskach z lokalnym gradientem pH. Następnie białka w pasku ulegają denaturacji i są umieszczane na powierzchni typowego żelu poliakrylamidowego, gdzie zostają unieruchomione za pomocą świeżego roztworu żelu. Następnie przeprowadzane jest rozdzielanie w drugim wymiarzie metodą SDS-PAGE.
Choć ogniskowanie izoelektryczne nie jest jedyną opcją w dwuwymiarowej elektroforezie żelowej, jest ono najczęściej stosowane. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa to nieocenione narzędzie, które dostarcza informacji o kompleksach białkowych i organizacji podorganellarnej.
Po przeprowadzeniu elektroforezy żelowej bardzo powszechnym kolejnym krokiem jest transfer białek z żelu na membranę wykonaną z PVDF lub nylonu w celu analizy. Można następnie użyć specyficznych przeciwciał do sondowania membrany i poszukiwania białek będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiono tutaj typowe wyniki immunoblottingu, w którym badacz zastosował trzy różne techniki wzmocnienia sygnału, aby ustalić, która z nich najlepiej wykazuje obecność białka Pit-1 w serii rozcieńczeń.
Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat rozdziału białek metodą SDS-PAGE. Powinni Państwo teraz rozumieć etapy rozdzielania białek ze względu na ich wielkość przy użyciu tej skutecznej techniki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What does SDS do to proteins in SDS-PAGE?
SDS is an anionic detergent that coats proteins uniformly at a rate of 1.4 grams per gram of protein. This coating provides a consistent negative charge across the protein's length, enabling size-driven separation in an electric field. The detergent essentially linearizes complex protein structures, allowing them to migrate based solely on their molecular weight.
Q2: Why is the loading buffer important in SDS-PAGE preparation?
The loading buffer serves three critical functions: it denatures proteins into linear amino acid chains using SDS and reducing agents, it contains glycerin to prevent samples from floating out of gel wells, and it includes a dye like bromophenol blue to track electrophoresis progress. Boiling samples for 5 minutes with the buffer breaks disulfide bonds, allowing SDS to coat proteins evenly.
Q3: How does polyacrylamide gel concentration affect protein separation?
The polyacrylamide gel forms a regular matrix through which proteins migrate when exposed to an electric field. Higher gel concentrations create denser matrices that slow protein movement, while lower concentrations allow faster migration. This property enables researchers to optimize separation conditions based on the size of proteins being analyzed.
Q4: What is the purpose of molecular weight ladders in SDS-PAGE?
Molecular weight ladders are protein standards of known sizes loaded alongside samples. As the gel runs, ladder proteins spread and create visible bands at predictable positions. These reference bands allow researchers to calculate the exact size of unknown proteins in their samples by comparing their migration distances.
Q5: How do Coomassie and silver stains differ in protein detection?
Both stains visualize protein bands after electrophoresis, but they differ in sensitivity. Coomassie blue can detect protein bands containing as little as 50 nanograms, while silver stain is more sensitive, detecting bands with as little as 1 nanogram. Silver stain provides greater detection capability for low-abundance proteins.
Q6: What is two-dimensional gel electrophoresis and how does it work?
Two-dimensional gel electrophoresis separates proteins by two distinct properties sequentially. First, samples are arranged by isoelectric point on pH gradient strips, then proteins are transferred to a polyacrylamide gel where SDS-PAGE separation occurs. This dual approach provides insights into protein complexes and sub-organelle organization that single-dimension methods cannot reveal.
Q7: What happens after SDS-PAGE gel electrophoresis is complete?
After electrophoresis, the gel cassette is opened and the gel is stained with protein stains like Coomassie blue or silver stain to visualize protein bands. A common next step is transferring proteins from the gel onto a PVDF or nylon membrane for western blotting western transfer antibody detection analysis using specific antibodies to identify proteins of interest.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:29
Principal Components of the SDS-PAGE System
1:55
SDS-PAGE Sample Preparation
3:40
Loading and Running the Gel
5:18
Applications
7:07
Summary