Rozdział białek metodą SDS-PAGE

SDS-PAGE to technika stosowana przez wielu badaczy do rozdzielania mieszanin białek ze względu na ich wielkość. Prawidłowe przeprowadzenie tej procedury jest niezbędnym pierwszym krokiem dla wielu metod analizy białek, takich jak immunoblotting. Sama w sobie stanowi użyteczne narzędzie do oceny wielkości i czystości białka.

Aby zrozumieć technikę SDS-PAGE, należy najpierw zapoznać się z jej głównymi komponentami. SDS-PAGE to skrót od elektroforezy żelowej w poliakrylamidzie z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu. Dodecylosiarczan sodu, czyli pierwsza część tej nazwy („SDS”), jest detergentem anionowym. Oznacza to, że składa się on z grupy hydrofilowej o ładunku netto ujemnym oraz długiego łańcucha hydrofobowego o ładunku neutralnym.

Łańcuch hydrofobowy otacza białka proporcjonalnie do ich masy, w stosunku 1,4 g SDS na gram białka. Zapewnia to białkom siłę napędową niezbędną do rozdziału zależnego od wielkości w polu elektrycznym.

Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie wykorzystuje hydrożel wykonany z poliakrylamidu. Poliakrylamid jest polimerem, który tworzy bardzo regularną macierz, przez którą mogą przemieszczać się białka. Im bardziej stężony jest żel, tym wolniej białka będą przez niego migrować pod wpływem pola elektrycznego. Proces wykorzystywania przestrzennie jednorodnego pola elektrycznego do wpływania na ruch obiektów nazywa się elektroforezą.

Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadza się na białkach izolowanych z wielu różnych źródeł, w tym z hodowli komórkowych, tkanek, krwi, moczu oraz drożdży.

Białka z tych różnorodnych źródeł muszą zostać najpierw oddzielone od innych składników komórkowych przy użyciu technik takich jak homogenizacja i wirowanie, którym często towarzyszy zastosowanie buforów lizujących.

Po izolacji białka często mierzy się jego stężenie, aby zapewnić równomierne nałożenie próbek, porównując ilość białka w próbce ze standardami albuminy w kolorymetrycznym teście kwasem bicinchoninowym (BCA).

Ważnym krokiem, o którym należy pamiętać, jest dodanie buforu do nakładania próbek. Bufor ten pełni trzy główne funkcje. Po pierwsze, dzięki SDS i dodatkowym czynnikom redukującym, denaturuje on białka, co w praktyce oznacza przekształcenie złożonych struktur białkowych w liniowy łańcuch aminokwasów. Po drugie, zawiera glicerynę, która zapobiega wypływaniu próbki podczas nakładania jej do studzienek żelu. I wreszcie, większość komercyjnych buforów do nakładania zawiera barwnik, taki jak błękit bromofenolowy, który pozwala monitorować postęp etapu elektroforezy.

Po dodaniu buforu do nakładania próbki należy wymieszać, a następnie gotować przez 5 minut. Pozwala to na rozerwanie silnych wiązań dwusiarczkowych w białkach przy pomocy czynnika redukującego, takiego jak beta-merkaptoetanol. Po rozerwaniu wszystkich wiązań dwusiarczkowych SDS może równomiernie otoczyć białka.

Następnie próbki są szybko wirowane, po czym są gotowe do nałożenia do układu żelowego w celu przeprowadzenia elektroforezy.

Przed nałożeniem próbek należy najpierw złożyć system żelowy. Proces ten rozpoczyna się od zakupu lub przygotowania żelu poliakrylamidowego. Gotowe żele stają się coraz popularniejsze, ponieważ akrylamid jest neurotoksyczny i może powodować uszkodzenia mózgu. Kaseta żelowa zawiera dołki służące do nakładania próbek.

Po umocowaniu żeli komory wewnętrzna i zewnętrzna są wypełniane buforem o takim samym stężeniu jonów, jaki zastosowano do przygotowania żeli. Tworzy to obwód elektryczny, który przechodzi niezakłóconym strumieniem od katody, przez żel, aż do anody.

Następnie do żelu nakłada się zazwyczaj markery masy cząsteczkowej, a po nich próbki. W miarę prowadzenia elektroforezy marker będzie się rozdzielać, tworząc widoczne prążki białkowe o znanych rozmiarach. W końcowych etapach prążki te mogą posłużyć do obliczenia wielkości każdego białka.

Po nałożeniu wszystkich próbek zaciski dodatni i ujemny na komorze elektroforetycznej zostają podłączone do źródła zasilania zdolnego do utrzymania stałego napięcia przez dłuższy czas. Elektroforezę zazwyczaj rozpoczyna się od napięcia około 60V, aż cała próbka przedostanie się do obszaru żelu zwanego „żelem startowym” (stacking gel). Następnie napięcie zwiększa się do około 200V na 30 minut do 1 godziny, w zależności od rozmiaru i stężenia żelu oraz wielkości analizowanego białka.

Po zakończeniu elektroforezy kasetę wyjmuje się i otwiera, aby odsłonić żel. Następnie żel można zabarwić typowym barwnikiem do białek, takim jak błękit Coomassie lub barwnik srebrowy, w celu wizualizacji prążków białkowych wewnątrz żelu. Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków zawierających już 50 nanogramów białka, podczas gdy barwienie srebrowe może wykryć prążki o masie zaledwie 1 nanograma białka.

W dwuwymiarowej elektroforezie żelowej próbki są rozdzielane na żelach według dwóch różnych właściwości, kolejno w każdym wymiarze. Najpierw próbki są naniesione i rozmieszczone zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi na paskach z lokalnym gradientem pH. Następnie białka w pasku ulegają denaturacji i są umieszczane na powierzchni typowego żelu poliakrylamidowego, gdzie zostają unieruchomione za pomocą świeżego roztworu żelu. Następnie przeprowadzane jest rozdzielanie w drugim wymiarzie metodą SDS-PAGE.

Choć ogniskowanie izoelektryczne nie jest jedyną opcją w dwuwymiarowej elektroforezie żelowej, jest ono najczęściej stosowane. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa to nieocenione narzędzie, które dostarcza informacji o kompleksach białkowych i organizacji podorganellarnej.

Po przeprowadzeniu elektroforezy żelowej bardzo powszechnym kolejnym krokiem jest transfer białek z żelu na membranę wykonaną z PVDF lub nylonu w celu analizy. Można następnie użyć specyficznych przeciwciał do sondowania membrany i poszukiwania białek będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiono tutaj typowe wyniki immunoblottingu, w którym badacz zastosował trzy różne techniki wzmocnienia sygnału, aby ustalić, która z nich najlepiej wykazuje obecność białka Pit-1 w serii rozcieńczeń.

Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat rozdziału białek metodą SDS-PAGE. Powinni Państwo teraz rozumieć etapy rozdzielania białek ze względu na ich wielkość przy użyciu tej skutecznej techniki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!