Name: Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Poznaj solidną metodę 3D DNA FISH z bezpośrednio znakowanymi sondami fluorescencyjnymi do analizy architektury jądra komórkowego. Technika ta umożliwia wizualizację przestrzennej organizacji lokusów genomowych w pojedynczych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez BBSRC i Wellcome Trust. Chcielibyśmy podziękować Simonowi Walkerowi za pomoc w obrazowaniu oraz Felixowi Kruegerowi za pomoc w analizie bioinformatycznej.

1. Generowanie bezpośrednio znakowanych sond DNA przez Nicka Tłumaczenie
Uwaga: Bezpośrednio oznaczone sondy wykonane z BAC (100-250 kb) konsekwentnie wytwarzają jasne sygnały. Jeśli wymagane są mniejsze sondy, użyj fosmidów (40-50 kb) lub nawet plazmidów zawierających wstawki 5-10 kb. Zidentyfikuj klony BAC lub fosmid odpowiadające określonym genomom za pomocą przeglądarek genomów Ensemble lub UCSC. Przygotuj wysokiej jakości DNA BAC przez wielokrotne wytrącanie lub użyj dostępnych na rynku zestawów. Im mniej preparat jest zanieczyszczony bakteryjnym genomowym DNA, tym mniej sondy jest wymagane na szkiełko. Znakowanie należy wykonać w dwóch etapach: translacja nicków wprowadzająca aminoallil-dUTP oraz chemiczne sprzężenie barwnika reagującego aminie.
1.1. Tłumaczenie Nicka
Podczas translacji nicków, DNase I jest używana do tworzenia jednoniciowych podziałów. Polimeraza DNA I wydłuża 3' końce tych "nacięć", zastępując istniejące nukleotydy nowymi, "translując" w ten sposób nacięcie, a tym samym dając możliwość włączenia znakowanych nukleotydów. Aminoallyl-dUTP jest wybierany ze względu na efektywną inkorporację przez polimerazę DNA I i jej potencjał do późniejszego sprzężenia chemicznego z barwnikami lub haptenami reagującymi z aminami. Kluczowe znaczenie ma osiągnięcie właściwej równowagi między nacinaniem DNazy I a translacją polimerazy DNA I; zbyt duża ilość DNazy I spowoduje nadmierne trawienie DNA, dając niską wydajność i krótkie rozmiary fragmentów, zbyt mała nie wytworzy wystarczającej ilości nacięć, aby polimeraza mogła zainicjować translację, dając duży rozmiar fragmentu i słabe włączenie aminoallilo-dUTP. Poniższy protokół działa dobrze, ale może być konieczne miareczkowanie DNAzy I z różnych partii lub różnych producentów.
<ol>
	<li>Ustawić reakcję etykietowania na lodzie i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 16 °C. Powinno to wytworzyć 0,5-1 μg DNA z translacją nicków i można je skalować. Rozcieńczyć DNazę I w stosunku 1:30 w buforze DNazy I (tj. 0,3 U/μl).</li>
</ol>
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>składnik </td>
			<td>Koncentracja zapasów</td>
			<td>Objętość lub ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA BAC (komórka BAC)</td>
			<td> </td>
			<td>5-10 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor NTB</td>
			<td>10x</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naziemna telewizja</td> cyfrowa
			<td>0,1 mln</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanie dNTP</td>
			<td>10x</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminoallil-dUTP</td>
			<td>0,5 mM</td>
			<td>6 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza DNA I</td>
			<td>10 U/μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza I</td>
			<td>10 U/μl</td>
			<td>1 μl (w rozcieńczeniu 1:30)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td> </td>
			<td>do 50 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="2">
	<li>Uruchom 1 μl na 2% żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość oznaczonych fragmentów. Podczas uruchamiania żelu utrzymuj reakcję na lodzie. Udana translacja nicków spowoduje rozmazanie z większością fragmentów o długości od 150 do 700 pz z niektórymi większymi fragmentami o wielkości ~1 kb (KROK KRYTYCZNY: patrz Reprezentatywne wyniki). W razie potrzeby dodać kolejny 1 μl świeżego rozcieńczenia DNazy I w stosunku 1:30 i inkubować w temperaturze 16 °C przez 15-30 minut. Czas inkubacji będzie się różnił w zależności od ilości i jakości DNA BAC.</li>
	<li>Dezaktywować DNazę I przez ogrzewanie do 75 °C przez 10 min.</li>
	<li>Oczyść DNA zmodyfikowane aminami za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Eluować w 100 μl H2O.</li>
	<li>Etanol wytrąca DNA przez dodanie 10 μl 3 M NaOAc (pH 5,2) i 275 μl etanolu. Pozostawić w temperaturze -20 °C na co najmniej 1 godzinę lub na noc. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umyć granulat 500 μl 70% etanolu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Ten krok usuwa aminy śladowe, które będą zakłócać reakcję znakowania. Zawiesić osad w 6 μl H2O na 1x początkowa reakcja.</li>
	<li>Użyj 1 μl, aby oznaczyć stężenie DNA zmodyfikowanego aminami za pomocą mikroobjętościowej spektroskopii UV.</li>
</ol>
1.2. Sprzężenie barwnika fluorescencyjnego
Fluorescencyjne oznakowanie sondy odbywa się poprzez chemiczne sprzężenie barwnika. Barwniki estrowe sukcynimidylowe Alexa Fluor reagują z aminami zmodyfikowanego DNA amino-allildUTP, tworząc wiązanie kowalencyjne, wytwarzając w ten sposób bezpośrednio znakowane sondy. Barwniki Alexa Fluor 488, 555 i 647 okazały się skuteczne w tym procesie.
<ol>
	<li>Dodać 4 μg DNA zmodyfikowanego aminoallilem do objętości 5 μl, podgrzać do 95 °C przez 5 minut, schłodzić na lodzie i dodać 3 μl 0,2 M NaHCO3.</li>
	<li>Rozpuścić jedną podwielokrotność barwnika reagującego z aminami w 2 μl bezwodnego DMSO w temperaturze pokojowej. Dodać 8 μl zmodyfikowanego DNA z NaHCO3, wirować, wirować pulsacyjnie i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.</li>
</ol>
Uwaga: Barwniki reagujące aminami mogą być używane do oznaczania więcej niż jednej sondy w oparciu o następujący schemat. Ponieważ na etykietowanie szkiełek używa się tylko 10-20 ng sondy, 1 μg wystarcza na 50-100 szkiełek. Możliwe jest również przechowywanie DNA modyfikowanego aminami do przyszłych reakcji znakowania w temperaturze -20 °C.
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ilość DNA</td>
			<td>Objętość DNA</td>
			<td>0,2 mln NaHCO3</td>
			<td>Objętość barwnika</td>
			<td>łączny</td>
			<td>Wystarcza na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 x 1 μg</td>
			<td>1,25 μl każdy</td>
			<td>0,75 μl każdy</td>
			<td>0,5 μl każdy</td>
			<td>2,5 μl (1/4)</td>
			<td>50-100 slajdów każdy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 1,35 μg</td>
			<td>1,67 μl każdy</td>
			<td>1 μl każdy</td>
			<td>0,67 μl każdy</td>
			<td>3,34 μl (1/3)</td>
			<td>65-130 zjeżdżalni każdy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 2 μg</td>
			<td>2,5 μl każdy</td>
			<td>1,5 μl każdy</td>
			<td>1 μl każdy</td>
			<td>5 μl (1/2)</td>
			<td>100-200 slajdów każdy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x 4 μg</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>3 μl</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>10 μl (pełny)</td>
			<td>200-400 slajdów</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="3">
	<li>Dodać 90 μlH2Oi oczyścić znakowaną sondę za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Elutować w 100 μl 10 mMTris-Cl (pH 8,5).</li>
	<li>Określ stężenie sondy i skuteczność etykietowania za pomocą mikroobjętościowej spektroskopii pełnego spektroskopii (patrz rysunek 2) przy użyciu równań Beera-Lamberta (instrukcje znajdują się w karcie katalogowej dołączonej do barwników reaktywnych Alexa Fluor lub można je znaleźć w Internecie). Dobrze sprawdzają się sondy zawierające 3-6 barwników na 100 pz. Sondy o niższym stopniu wbudowania mogą dawać słabe sygnały FISH. Alternatywnie, przelej 5 μl na 2% żel agarozowy bez barwienia DNA i sprawdź zawartość barwnika fluorescencyjnego za pomocą fosfoimagera. Po wybarwieniu żelu bromkiem etydyny lub alternatywami do barwienia DNA i porównać znakowane DNA z całkowitym DNA.</li>
</ol>
2. DNA RYBA
Poprzez następujące kroki, interesujące komórki są przytwierdzane do slajdów i przenikane. DNA komórkowe i bezpośrednio znakowane sondy są następnie denaturowane razem na gorącej płycie i hybrydyzowane przez noc w szczelnej, wilgotnej komorze.
2.1. Dzień 1
<ol>
	<li>Sonda Opady 
	nuta: Wytrącić sondy w pewnym momencie dnia 1. Można to wygodnie przeprowadzić równolegle z leczeniem komórek i nie trzeba tego robić na początku dnia.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 10-20 ng bezpośrednio znakowaną sondę, 6 μl C0t-1 DNA (6 μg), 1 μl jednoniciowego DNA z jąder łososia (9,7 μg) i dostosuj objętość do 100 μl wodą.</li>
		<li>Dodać 10 μl 3 M NaOAc i 275 μl EtOH i wymieszać przez wirowanie. Wytrącać się przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wirować w mikrofugach z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć granulat 70 % EtOH i ponownie odwirować. Suchy osad i ponownie zawiesić w 5 μl dejonizowanego formamidu. Zawiesić ponownie na 30 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 1000 obr./min, chronić przed światłem (umieścić folię na termomikserze).</li>
		<li>Dodać 5 μl mieszaniny siarczanu dekstranu i wstrząsać przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C, ponownie chroniąc przed światłem. Pipetować w górę i w dół tuż przed pipetowaniem na szkiełko nakrywkowe. 
		nuta: Do malowania chromosomów w połączeniu z sondami BAC wygodną opcją są sondy do malowania całych chromosomów, które są dostarczane w postaci gotowej do użycia mieszanki hybrydyzacyjnej. Zawiesić wytrąconą sondę BAC (z DNA C, 0t1 i jednoniciowym DNA z jąder łososia) w mieszance farb chromosomowych o objętości 10 μl, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 300–500 obr./min przez 10 minut. Użyj 10 μl farby chromosomowej / mieszanki sondy BAC na miejsce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dołączanie komórek do slajdów 
	nuta: Skłonność komórek do przylegania do szkiełek znacznie różni się w zależności od typu komórki. Dla każdego typu ogniwa należy empirycznie określić optymalny czas osiadania i gęstość komórek. Aby uzyskać spójne wyniki, komórki powinny znajdować się w zawiesinie pojedynczej komórki. 
	Dla ułatwienia użycia zakreśl obszar, na którym komórki zostaną namierzone hydrofobowym pisakiem, chociaż w przypadku komórek ponownie zawieszonych w PBS nie jest to absolutnie konieczne. Bariera hydrofobowa zapobiega rozprzestrzenianiu się zawiesiny na szkiełku, utrzymuje do trzech próbek na szkiełku w stanie ładnie oddzielonych i pozwala na stosowanie bardzo małych objętości roztworu przeciwciał w immuno-FISH. Ponadto obszar wykrywania można ograniczyć do minimum, jeśli liczba komórek jest niska.</li>
	<li>Komórki wątroby płodu myszy
	<ol>
		<li>Zebrać każdą wątrobę płodu myszy E13,5 w około 1,5 ml PBS i ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół. Wirowanie w mikrofugach z prędkością 3 000 obr./min przez 2 min. Powtórz pranie trzy razy. Przy ostatnim myciu przecedź komórki przez sito o grubości 70 μm. Zawieś komórki z jednej wątroby w 160 μl PBS i użyj 50 μ na miejsce. Pozostaw komórki na 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mysz ES Komórki 
	 1. Komórki ES myszy nie przyklejają się łatwo do szkiełka. Na szkiełku zakreśl obszar, na którym zostaną wykryte komórki, za pomocą hydrofobowego pisaka. Przygotować zawiesinę 20 000-50 000 komórek na 80-100 μl w normalnej pożywce hodowlanej, pipetować do kółka i pozostawić na około 3 godziny w wilgotnym inkubatorze. nuta: Alternatywnie, komórki ES mogą być hodowane na szkiełkach, ale wtedy będą tworzyć kolonie, które mogą utrudniać automatyczne obrazowanie.</li>
	<li>Stałe komórki 
	 1. Niektóre eksperymenty wymagają użycia stałych komórek, które same nie przyczepiają się do szkiełek. Delikatne wirowanie z prędkością 300 obr./min przez 3 minuty przy użyciu cytowirówki zachowuje trójwymiarową strukturę komórek i zapewnia, że komórki nie odpadają.</li>
</ol>
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ komórki</td>
			<td>Zawieszenie w</td>
			<td>Czas ustalania</td>
			<td>komentarz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wątroba płodu myszy</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>Czas trwania: 2 min</td>
			<td>Na ławce</td> rezerwowych
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz ES</td>
			<td>DMEM z suplementami</td>
			<td>4 godz</td>
			<td>37 °C w nawilżanym inkubatorze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limfocyty myszy</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>Czas trwania: 2 min</td>
			<td>Na ławce</td> rezerwowych
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki rozrodcze myszy P20</td>
			<td>Napraw w rozwiązaniu</td>
			<td>Cytospin (Cytospin</td>)
			<td>Na ławce</td> rezerwowych
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="3">
	<li>Aby utrwalić komórki, delikatnie zanurz szkiełko w 4% PFA (UWAGA: wykonaj w dygestorium) na 10 minut. Zamocuj komórki za pomocą szkiełka płasko na tacy, aby uzyskać najlepsze zatrzymanie komórek (np. 50 ml 4% PFA w pokrywie pojemnika na końcówki). nuta: Ten krok nie ma zastosowania do komórek ustalonych przed dołączeniem do slajdów.</li>
</ol>
Do wszystkich kolejnych kroków używaj słoików Coplin o pojemności 50 ml lub 100 ml. Uważaj, aby nie zeskrobać komórek podczas przesuwania szkiełek między słoikami.
<ol start="4">
	<li>Hartować w 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek w 0,1% saponinie/0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować przez co najmniej 20 minut w 20% glicerolu/PBS w temperaturze pokojowej. Uwaga: W tym momencie szkiełka można przechowywać w 50% glicerolu/PBS w temperaturze -20 °C przez co najmniej kilka tygodni. Zaobserwowano, że przechowywanie przez co najmniej jeden dzień powoduje wzrost siły sygnału9. Przed kontynuowaniem należy ponownie skalibrować w temperaturze pokojowej 20% glicerol/PBS. nuta: Jest to dogodny punkt do rozpoczęcia wytrącania sond (patrz 2.1.1).</li>
	<li>3x zamrażanie/rozmrażanie w ciekłym azocie. Zanurzaj jedno szkiełko na raz w ciekłym azocie za pomocą małego dewara. Wyjmij po kilku sekundach i charakterystycznym trzaskającym dźwięku i połóż na ręczniku papierowym do rozmrożenia. Poczekaj, aż nieprzezroczysty zamrożony glicerol zniknie, a następnie ponownie zamroź. Wygodnie można wykonać do 15 slajdów w rotacji przez trzy cykle zamrażania/rozmrażania.</li>
	<li>Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować w 0,1 M HCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepuszczalność w 0,5% saponinie/0,5% Triton X-100/PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Równoważyć w 50% formamidzie/2x SSC przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pipetę nanieść na szkiełko nakrywkowe. Wyjmij szkiełko ze słoika i osusz nadmiar płynu wokół miejsca (miejsc) komórek ręcznikiem papierowym. Ponieważ formamid szybko wysycha, należy uważać, aby nie wysuszyć komórek. W przypadku szkiełek z dwu- lub trzykomórkowymi plamkami, należy nałożyć 10 μl sondy na plamkę na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm odpowiadające lokalizacji plamki na szkiełku. Odwróć szkiełko nakrywkowe na miejsce (miejsca) szkiełka. Uszczelnij cementem gumowym i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Chronić przed światłem na wszystkich kolejnych etapach.</li>
	<li>Podgrzewanie przesuwa się do 78 °C dokładnie przez 2 minuty na płycie grzejnej (np. odwrócony blok grzewczy, KROK KRYTYCZNY: patrz Dyskusja). Umieść pokrywę (kartonowe pudełko lub podobne) na płycie grzejnej, aby chronić przed światłem podczas denaturacji.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w szczelnie nawilżonej komorze. Aby nawilżyć, umieść ręczniki papierowe w światłoszczelnym pudełku i zwilż wodą.</li>
</ol>
2.2 Dzień 2
<ol>
	<li>Przygotuj słoiki Coplin z roztworami o odpowiedniej temperaturze do kolejnych etapów mycia. Chroń slajdy przed światłem w jak największym stopniu podczas wszystkich kolejnych kroków. Puszka po kawie stanowi dobrą, światłoszczelną pokrywę dla słoików Coplin.</li>
	<li>Oderwij cement gumowy i umieść szkiełko w 2x SSC, aż szkiełka nakrywkowe poluzują się i zsuną.</li>
	<li>Prać w 50% formamidzie/2x SSC przez 15 minut w temperaturze 45 °C. Przykryć łaźnią wodną pod przykryciem w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Prać w 0,2x SSC przez 15 min w temperaturze 63 °C.</li>
	<li>Prać w 2x SSC przez 5 min w temperaturze 45 °C.</li>
	<li>Prać w 2x SSC przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Barwieć DAPI (5 μg/ml w 2x SSC) przez 2 minuty w słoiku Coplin w temperaturze RT.</li>
</ol>
Uwaga: Roztwór DAPI może być przechowywany w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2 miesiące.
<ol start="9">
	<li>Odplamić w PBS przez 5 minut w RT.</li>
	<li>Aby zamontować szkiełko nakrywkowe, należy odpipetować podłoże mocujące do szkiełka nakrywkowego. Użyć 10 μl na plamkę komórki, używając szkiełek nakrywkowych 22 mm x 22 mm dla jednego miejsca i szkiełek nakrywkowych 22 mm x 50 mm dla dwóch lub trzech plamek. Wysusz PBS wokół miejsca komórkowego tak bardzo, jak to możliwe, ale uważaj, aby nie wysuszyć komórek. Odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe i uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
</ol>

<ol><li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+transcription%3A+shaping+the+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. (2000).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li>
<li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li>
<li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+%283D-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li>
<li>Solovei, I. FISH on three-dimensionally preserved nuclei. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22FISH%3A+A+Practical+Approach%22">FISH: A Practical Approach</a>. Beatty, B., Mai, S., Squire, J. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).</li>
<li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983(2012).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. Bridger, J. M., Volpi, E. V. , Humana Press. New York, New York, USA. (2010).</li>
</ol>

Produkcja tego artykułu była częściowo sponsorowana przez Carl Zeiss i MetaSystems.

3D DNA FISH stało się powszechnie uznanym narzędziem do analizy układów przestrzennych w jądrze. Chociaż FISH zapewnia wizualne i bezpośrednie rezultaty, jak w przypadku każdej techniki, należy zdawać sobie sprawę z jej ograniczeń. DNA FISH boryka się z nieodłącznym problemem, jakim jest to, że potrzebne są stosunkowo surowe zabiegi, aby chromatyna była dostępna dla sond FISH, co ostatecznie zaburza strukturę jądrową – dokładnie to, co ma być analizowane. Podjęto kilka strategii mających na celu pogodzenie dostępności z zachowaniem struktury. W opisanym tutaj protokole chromosomalne DNA jest dostępne poprzez przenikanie komórek przez zamrażanie i rozmrażanie oraz denaturację cieplną przed hybrydyzacją sondy. Solovei i wsp., (2002) przeanalizowali zmiany strukturalne po podobnym leczeniu i stwierdzili, że średnie przemieszczenie domen chromatyny wynosiło 300 nm, co ogranicza rozdzielczość analizy strukturalnej do około 1 Mb regionów w genomie8. Chociaż nie jest to wysoka rozdzielczość, jest to rozsądna skala do analizy pozycji jądra.	
Bardziej praktycznym aspektem analizy FISH jest to, że pozyskiwanie obrazów i pomiary odległości jądrowych są czasochłonnymi procesami, które ograniczają liczbę jąder, które można analizować. Aby zbadać rzadkie zdarzenia, naszym celem było przeprowadzenie wysokoprzepustowego zautomatyzowanego obrazowania. Następnie, przy zastosowaniu odpowiednich kontroli, można porównać wystarczającą liczbę danych, aby umożliwić solidną analizę statystyczną relacji przestrzennych. Rutynowo analizujemy 600 jąder w każdym punkcie danych, dla których określamy współrzędne 3D wszystkich sygnałów FISH w objętości jądrowej. Dane te zajmują bardzo mało miejsca w pamięci masowej i pozwalają na analizę odległości między- i wewnątrzallelicznych lub pozycji radialnych w dowolnym późniejszym momencie. Co więcej, zautomatyzowane przetwarzanie może odbywać się w sposób ślepy badacza, co znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo nieświadomych uprzedzeń.	
Aby umożliwić tego rodzaju wysokoprzepustową analizę, naszym celem było opracowanie szybkiego i wydajnego sposobu wykonywania DNA FISH. Stwierdziliśmy, że opisany tutaj protokół jest niezwykle solidny, konsekwentnie wytwarzając jasne sygnały o niskim tle. Zadziałało to dla wszystkich typów komórek, które wypróbowaliśmy, pod warunkiem, że dostosowaliśmy etap mocowania komórek do szkiełka. Co więcej, z jednym wyjątkiem, wszystkie BAC, których używaliśmy, można było przekształcić w jasne sondy. Udało nam się również wykryć szereg białek jądrowych poprzez barwienie przeciwciałami po DNA FISH. Chociaż w przypadku niektórych białek działa to dobrze, zalecamy porównanie z tradycyjną immunofluorescencją (IF), aby zapewnić spójność wzorca barwienia przeciwciał między IF a DNA immuno FISH (porównaj 11).	
Ogólnie rzecz biorąc, stwierdziliśmy, że sondy oznaczone różnymi kolorami dawały te same wyniki. Jednak przy wyborze barwnika do etykietowania należy wziąć pod uwagę następujące aspekty. Po pierwsze, kolor fluoroforu musi być dobrze wykrywalny przez użyty mikroskop. Po drugie, długość fali światła emitowanego przez fluorofory powinna być na tyle różna, aby uniknąć przenikania do drugiego kanału. Będzie to zależeć od filtrów w mikroskopie. I po trzecie, przynajmniej w naszych rękach, niektóre kolory wytwarzają jasne sygnały bardziej konsekwentnie niż inne. Zawsze używaliśmy DAPI (niebieski) jako przeciwbarwienia, co sprawia, że Alexa Fluor 555 (czerwony), 488 (zielony) i 647 (dalece czerwony) są dobrym wyborem do etykietowania sond. Dzięki naszemu systemowi obrazowania stwierdziliśmy, że Alexa Fluor 555 (czerwona) wytwarza najjaśniejsze sygnały, a następnie Alexa Fluor 488 (zielona). Alexa Fluor 647 (daleko czerwony) ma tę wadę, że nie może być wykryty przez ludzkie oko i dlatego nie widać żadnych sygnałów podczas patrzenia w dół mikroskopu. Tak więc, jeśli robisz dwukolorowe RYBY, zalecamy połączenie czerwonych i zielonych barwników.	
Mogą pojawić się dwa zasadnicze problemy: wypłukiwanie komórek ze szkiełek i słabe sygnały. To, jak dobrze komórki przylegają do szkiełka, jest bardzo zróżnicowane w zależności od typu komórek i należy określić najlepszy protokół osadzania/zasiewania komórek. Z powodzeniem używaliśmy szkiełek z ładunkiem dodatnim lub pokrytych poli-L-lizyną (kupionych w postaci gotowej do użycia), ale stwierdziliśmy, że ogniwa ogólnie lepiej przylegają do szkiełek pokrytych poli-L-lizyną. Odkryliśmy również, że gdy komórki były zbyt gęste, całe obszary odklejały się jako arkusz, podczas gdy automatyczne obrazowanie było utrudnione, jeśli komórki były zbyt rzadkie. Tak więc, jeśli próbka nie jest zbyt cenna, należy rozsiać różne liczby komórek, aby określić idealną gęstość. Jeśli komórki są szczególnie podatne na zmywanie, można użyć hydrofobowego pisaka barierowego, a etapy FISH można wykonać, ostrożnie pipetując roztwory bezpośrednio na szkiełko. Pipetowanie również drastycznie zmniejsza ilość potrzebnych odczynników, ale trwa znacznie dłużej w przypadku wykonywania wielu szkiełek.	
Słabe sygnały są zwykle spowodowane słabymi sondami i warto zainwestować czas w tworzenie dobrych. Jako materiał wyjściowy należy stosować czyste DNA BAC, który można uzyskać przez wielokrotne wytrącanie lub za pomocą dostępnych w handlu zestawów. Zanieczyszczenie bakteryjnym genomowym DNA negatywnie wpływa na jakość sondy i wymagane jest ostrożne obchodzenie się z nią podczas lizy komórek i filtrowanie lizatu komórkowego, aby ograniczyć je do minimum. Nie jest jednak konieczne stosowanie etapu egzonukleazy do trawienia liniowego DNA, ponieważ znacznie zmniejsza to wydajność. Wydajne etykietowanie sondy ma kluczowe znaczenie. Najważniejszą kontrolą jakości na tym etapie jest sprawdzenie rozmiaru fragmentu po translacji nicka (patrz Reprezentatywne wyniki). "Dobry" rozmaz prawie zawsze skutkuje jaskrawym kolorem sondy. Odkryliśmy jednak, że czasami pewien BAC nie może zostać przetworzony na dobrą sondę i trzeba wybrać inny BAC. Kolejnym ważnym krokiem jest denaturacja cieplna. Jeśli temperatura jest zbyt niska, DNA zostanie tylko częściowo zdenaturowane, a hybrydyzacja sondy zostanie upośledzona. Jeśli temperatura jest zbyt wysoka, struktura jądrowa zostanie zaburzona bardziej niż to konieczne. W naszych rękach 78 °C na odwróconym gorącym bloku jest idealnym kompromisem, ale może się to różnić w zależności od użytego gorącego bloku.	
Uzyskaliśmy dobre wyniki przy użyciu podłoża montażowego Vectashield, ale stwierdziliśmy, że SlowFade Gold ma mniej tła i dłużej zachowuje sygnał fluorescencyjny. Nie zalecamy stosowania twardego medium montażowego, ponieważ stwierdziliśmy, że wpływa to na strukturę 3D i z czasem tworzy pęcherzyki powietrza.	
Podsumowując, jaskrawo fluorescencyjne, bezpośrednio znakowane sondy wraz z opisanym tutaj protokołem DNA FISH oferują skuteczne rozwiązanie do solidnej i szybkiej analizy architektury jądrowej, które ma zastosowanie w szerokiej gamie zagadnień biologicznych.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (DNA FISH) pozwala na trójwymiarową wizualizację pojedynczych loci genów, domen subchromosomalnych, a nawet całych chromosomów na wszystkich etapach cyklu komórkowego. 2D FISH jest używany do badań metafazowych, podczas gdy 3D FISH jest szeroko stosowany do badania związku między organizacją przestrzenną genomu a jego funkcją podczas interfazy (1,2 i zawarte w nich odniesienia). Historycznie rzecz biorąc, badania koasocjacyjne prowadzono poprzez badanie dziesiątek do setek indywidualnych loci za pomocą FISH. Niedawnoopracowano potężne, wysokoprzepustowe techniki oparte na 3C, takie jak 4C i Hi-C3, które pozwalają na badanie wzajemnych przesłuchów molekularnych między wieloma tysiącami różnych loci. Chociaż techniki oparte na 3C i DNA FISH mogą być metodami uzupełniającymi, niekoniecznie odpowiadają na te same pytania. Metody oparte na 3C zapewniają całościowy odczyt mieszanych populacji komórek, co skutkuje prawdopodobieństwem koasocjacji. W przeciwieństwie do tego, mimo niskiej przepustowości, techniki oparte na projekcie FISH oferują możliwość analizy przestrzennego rozmieszczenia loci lub chromosomów w poszczególnych komórkach zgodnie z ich etapami rozwoju lub cyklu komórkowego. W związku z tym FISH będzie nadal ważnym narzędziem do badania zależności między strukturą jądrową a funkcją.
Są dwie główne kwestie, które należy wziąć pod uwagę przy przeprowadzaniu udanych eksperymentów 3D FISH. To są; 1. Uzyskanie optymalnie oznakowanych sond i 2. wybór leczenia komórkowego, w tym utrwalanie, etapy przed i po hybrydyzacji, w celu zachowania morfologii jądrowej w jak największym stopniu, przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającej dostępności DNA do hybrydyzacji sondy. Wydajne etykietowanie sond ma kluczowe znaczenie dla FISH. Tradycyjnie, translacja nicków była używana do wprowadzania nukleotydów sprzężonych z haptenem lub fluoroforem4. Podobnie, dostępne są komercyjne zestawy do translacji nacięć do bezpośredniej indukcji haptenów lub fluoroforów, ale także do dwuetapowego znakowania przy użyciu nukleotydów aminoallilowych i barwników reagujących z aminami. To ostatnie sprawia, że wprowadzanie barwnika jest bardziej wydajne, dając polimerazie DNA mniej masywną cząsteczkę do pracy. Niedawno opracowano zestawy do nieenzymatycznego znakowania DNA, które wykorzystują koordynacyjne wiązanie platyny z kwasami nukleinowymi. Sondy FISH można nawet kupić już oznaczonejako 5. Chociaż zestawy i sondy produkowane komercyjnie bez wątpienia zapewniają łatwość użytkowania, są one znacznie droższe niż kupowanie pojedynczych komponentów i produkcja sond we własnym zakresie. Zoptymalizowaliśmy tani protokół translacji nicków, aby bezpośrednio oznaczyć wiele różnych sond BAC w wielu kolorach. Odkryliśmy, że uzyskanie wysoce czystego DNA BAC ma kluczowe znaczenie i skutkuje wymaganiem tylko 10-20 ng sondy na szkiełko FISH, w porównaniu do 10-20 razy więcej, gdy stosuje się zanieczyszczone matrycowe DNA, co skutkuje znacznymi oszczędnościami kosztów i czasu. Zastosowanie amino-allyldUTP pozwala na elastyczne znakowanie sond dostępnymi barwnikami aminowo-reaktywnymi (np. Alexa Fluor lub Cy-dyes) lub haptenami (np. biotyna, digoksygenina). Sondy znakowane haptenem są wykrywane przez przeciwciała sprzężone z fluoroforem lub streptawidynę w celu wzmocnienia i wizualizacji sygnału. Jasne, bezpośrednio znakowane sondy na ogół wykazują mniejsze zabarwienie tła i unikają nadmiernego wzmacniania sygnałów, co skutkuje dokładniejszym odwzorowaniem lokalizacji jądrowej i morfologii locus.
Istnieje kilka różnych technik FISH, które wykorzystują różne utrwalacze, obróbkę wstępną i płukanie po hybrydyzacji, ale zazwyczaj dzielą się one na następujące kategorie: utrwalanie aldehydu glutarowego z denaturacją NaOH, wiązanie formaldehydu z denaturacją HCl i wiązanie formaldehydu z denaturacją termiczną6-9. Każdy z nich ma zalety i wady. Wiązanie aldehydu glutarowego powoduje dobrą konserwację struktury jądrowej, ale wymaga traktowania środkami redukującymi w celu zminimalizowania powstałej autofluorescencji, a obróbka NaOH musi być dokładnie kontrolowana, aby zrównoważyć wystarczającą denaturację DNA i potencjalne uszkodzenie struktury jądrowej6. Wiązanie formaldehydu jest mniej silne, co zwiększa prawdopodobieństwo zaburzeń architektury jądrowej, ale także zazwyczaj daje silniejsze i bardziej wiarygodne sygnały oraz niższą autofluorescencję9. Leczenie HCl oczyszcza DNA i usuwa białka, zapewniając dobry dostęp do DNA dla sond, ale może również powodować pęknięcia DNA. Ogrzewanie fizycznie oddziela dwie nici DNA, co skutkuje dobrą hybrydyzacją docelową i silnymi sygnałami, ale może powodować pewne zaburzenia struktury jądrowej8. Stopień, w jakim każda z tych technik wpływa na epitopy białek, jest bardzo zróżnicowany6,9 , co powoduje konieczność eksperymentalnego określenia dla każdego białka optymalnego protokołu do zastosowania w eksperymentach immuno-FISH.
Chociaż nie ma 'idealnej' techniki DNA FISH, wszystkie mogą być użyteczne, jeśli są dobrze kontrolowane. Naszym celem była optymalizacja protokołu dla solidnego i powtarzalnego DNA FISH w celu zbadania przestrzennego pozycjonowania wielu loci w różnych typach komórek10, koncentrując się na metodzie ogrzewania w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych sygnałów. Dzięki temu oraz zastosowaniu zautomatyzowanego systemu obrazowania dążyliśmy do zwiększenia przepustowości analizy pojedynczych komórek w układach jądrowych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>bufor NTB</td><td></td><td></td><td>Krok 1.1.1 (Zobacz listę 'FISH i mieszanki reakcyjne' poniżej)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>Krok 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>Krok 1.1.1 (Patrz lista 'RYB i mieszanki reakcyjne' poniżej)</td></tr><tr><td>Aminoallil-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>Krok 1.1.1</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I</td><td>New England Biolabs</td><td>M02095</td><td>Krok 1.1.1</td></tr><tr><td>DNaza I rekombinowana bez RNazy</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Krok 1.1.1</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Krok 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>Krok 1.1.5, Krok 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Krok 1.2.1</td></tr><tr><td>Barwniki reaktywne Alexa Fluor Decapacks do zastosowań w mikromacierzach</td><td>Invitrogen (sondy molekularne)</td><td>A32750, A32756, A32757</td><td>Krok 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (bezwodny) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>Krok 1.2.2</td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Krok 1.2.4 (alternatywa dla bromku etydyny)</td></tr> <tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>Krok 2.1.1.1 (DNA Cot-1 może być wykonane w domu w dużych ilościach i działa równie dobrze)</td></tr> <tr><td>Jednoniciowe DNA z jąder łososia </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>Krok 2.1.1.1</td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>Krok 2.1.1.3 (Zagrożenie dla zdrowia)</td></tr> <tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>Krok 2.1.1.4 (Patrz lista "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)</td></tr> <tr><td>Sondy do malowania XMP</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>Krok 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>Prowadnice pokryte poli-L-lizyną</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>Krok 2.1.2</td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Krok 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &mu; m sito (Mysz f&#8211; Tylko komórki wątroby)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>Krok 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Etap 2.1.3 (Łatwopalne,, toksyczność ostra, zagrożenie dla zdrowia) (Patrz lista "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)</td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>Krok 2.1.3 (Patrz lista "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)</td></tr><tr><td>Saponina z kory Quillaja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>Etap 2.1.4, 2.1.11 (Toksyczność ostra), (Patrz wykaz "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Etap 2.1.4, 2.1.11 (Toksyczność ostra, stwarzająca zagrożenie dla środowiska)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>Krok 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650</td><td>Krok 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>Krok 2.1.9 (Toksyczność ostra, działanie)</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td>Krok 2.1.14, 2.2.3 (Zagrożenie dla zdrowia)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>Krok 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (Patrz wykaz "rybne i mieszaniny reakcyjne" poniżej)</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>Krok 2.1.15</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>Krok 2.1.15</td></tr><tr><td>Cement kauczukowy</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>Krok 2.1.15 (łatwopalny, zagrożenie dla zdrowia, zagrożenie dla środowiska)</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td> <td>DAPI</td> Invitrogen <td>D3571</td><td>Krok 2.2.8 (zagrożenie dla zdrowia)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Krok 2.2.10 (medium montażowe)</td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Krok 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Krok 1.1.6, 1.2.4 (spektroskopia mikroobjętościowa)</td></tr><tr><td>Tajfun FLA 7000 fosfoimager</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>Krok 1.2.4</td></tr><tr><td>Słoiki z kopiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)Krok</td> <td>2.1.3 i nowsze</td></tr><tr><td>Ciekły azot Dewar </td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Krok 2.1.7</td></tr><tr><td>Podstawa z czarną pokrywą (komora światłoszczelna)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Krok 2.1.17</td></tr><tr><td>Komfort termomiksera</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Krok 2.2.3 (lub użyj wytrząsarki w 37 & stopni; Pokój C)</td></tr><td colspan="4"><tr>Obrazowanie i przetwarzanie obrazów</td></tr><tr><td>Metafer - Platforma automatyzacji obrazowania</td><td>Oprogramowanie do automatycznego obrazowania</td><td>MetaSystems</td><td></td></tr><tr><td>MetaCyte - Zautomatyzowana analiza międzyfazowa FISH</td><td>Oprogramowanie do automatycznego obrazowania</td><td>MetaSystems</td><td></td></tr><tr>Pionowy <td>mikroskop epifluorescencyjny Zeiss</td><td></td><td></td> <td>Z2</td> używany z automatycznym obrazowaniem</tr><tr><td>Mikroskop konfokalny IX81 (FV1000)</td><td>Mikroskop konfokalny</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Bitplane, wersja 7.3</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu i modelowania 3D</td><td>Imaris</td><td></td></tr><tr><td>Objętość naukowa Obrazowanie, wersja 4.1</td><td>Oprogramowanie do analizy i dekonwolucji obrazu</td> <td>Huygens</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> i mieszanki reakcyjne FISH <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Nazwa</td> <td>Skład</td> <td>Komentarze</td> </tr> <tr> <td> 10 x bufor NTB</td> <td>0,5 M Tris-HCl, pH 7,5</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,05 M MgCl2</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mg/ml BSA</td> <td></td> </tr> <tr> <td>dNTP Mix</td> <td>0,5 mM dGTP</td> <td>Store 50 &mu; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mM dATP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mM dCTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,125 mM dTTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td>4 % PFA</td> <td>Odważyć 4 g/100 ml PFA w PBS i podgrzać do temperatury 62 °C. Dostosować pH za pomocą NaOH do 7,0, aby rozpuścić pozostałe PFA.</td> <td>Przechowywać 50 ml porcji w temperaturze -20 & stopni; C, nie zamrażać ponownie</td> </tr> <tr> <td>2 % roztwór saponin</td> <td>Rozpuść 2 g saponiny na 100 ml PBS przez przedłużone mieszanie. Rozpuść i dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH. Doprowadzić do 1 l za pomocą ddH20 i autoklawu. </td> <td>Przechowywać porcje 5 ml w temperaturze -20 & deg; C</td> </tr> <tr> <td>20 x SSC</td> <td>Odważyć 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu i dodać do 80 ml ddH20 . Rozpuść i dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH. Doprowadzić do 1 l za pomocą ddH20 i umieścić w autoklawie.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>mieszanka siarczanu dekstranu</td> <td>20 % siarczanu dekstranu w 2 x bufor SSC; Roztwór wirować i mieszać na bujaku przez noc.</td> <td>Przechowywać 500 &mu; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

solidna ryba dna 3d przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH stało się głównym narzędziem do analizy trójwymiarowej organizacji jądra, a kilka wariantów tej techniki zostało opublikowanych. W tym artykule opisujemy protokół, który został zoptymalizowany pod kątem solidności, powtarzalności i łatwości użycia. Jaskrawo fluorescencyjne, bezpośrednio znakowane sondy są generowane przez translację nacięcia z amino-allilUTP, a następnie chemiczne sprzężenie barwnika. 3D DNA FISH przeprowadza się przy użyciu etapu zamrażania i rozmrażania w celu przenikania komórek oraz etapu ogrzewania w celu jednoczesnej denaturacji sondy i jądrowego DNA. Protokół ma zastosowanie do wielu typów komórek i różnych sond (BAC, plazmidy, fosmidy lub farby całych chromosomów) i pozwala na automatyczne obrazowanie o wysokiej przepustowości. Za pomocą tej metody rutynowo badamy lokalizację jądrową do trzech regionów chromosomowych.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu (Rycina 1 – przegląd) był z dużym sukcesem stosowany do łączenia metody DNA FISH z wysokoprzepustowym obrazowaniem w celu analizy organizacji genomu. Kluczowym elementem warunkującym powodzenie badania jest przygotowanie sond wysokiej jakości (patrz sekcja Dyskusja). Rycina 2 przedstawia dwie istotne kontrole jakości sond FISH. Po translacji nacięć (nick-translation) powinna być widoczna smuga DNA, przy czym większość fragmentów powinna mieścić się w zakresie od 150 do 700 bp (Rycina 2A). Po sprzęganiu chemicznym stopień inkorporacji barwnika fluorescencyjnego można ocenić za pomocą analizy spektroskopowej sondy (Rycina 2B).
Stosowanie wysokiej jakości sond oraz przestrzeganie protokołu DNA FISH zazwyczaj pozwala na uzyskanie jasnych sygnałów DNA FISH przy niskim poziomie tła. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół w przypadku różnych typów komórek, wykorzystując mikroskopy epi-fluorescencyjne lub konfokalne. Zautomatyzowane obrazowanie z użyciem mikroskopu epi-fluorescencyjnego wymaga ostrych, łatwo identyfikowalnych sygnałów FISH przy niskim tle (Rysunek 3), natomiast mikroskopia konfokalna wymaga bardziej intensywnych sygnałów. Rysunek 4A przedstawia reprezentatywne obrazy po obróbce. Możliwe jest wyznaczenie współrzędnych jądrowych sygnałów FISH oraz obliczenie relacji przestrzennych regionów genomicznych (przykład przedstawiono na Rysunku 4B). Wykorzystaliśmy również stosy obrazów uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej do modelowania 3D sygnałów FISH w obrębie ich terytoriów chromosomowych (Film 1).
<img alt="Schemat procesu DNA FISH: przygotowanie sondy, fiksacja, hybrydyzacja, przeciwbarwienie, obrazowanie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat znakowania sond i procedury DNA FISH. Przygotowanie sondy przedstawiono na niebiesko. Procedurę DNA FISH przedstawiono na czarno, a szczegóły na zielono.
<img alt="Wyniki elektroforezy DNA wraz z wykresem widm absorbancji, pokazujące poziomy szczytowej absorbancji barwnika Alexa." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Znakowanie sond metodą nick-translation i kontrola jakości znakowanych sond. A) Żel pokazujący idealny rozmaz przed podgrzaniem w celu inaktywacji DNase I (ścieżka 1: drabinka DNA, ścieżki 2 i 3: BAC po nick-translation). Fragmenty powinny mieścić się w zakresie 150-700 bp. W przypadku udanych reakcji nick-translation często obserwuje się dodatkowy rozmaz przy ~1 kb. B) Mikrowolumetryczna analiza pełnego widma znakowanych sond. Obserwowany jest pik DNA przy 260 nm oraz drugi pik odpowiadający długości fali absorbancji fluoroforu, którym znakowano sondę: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Przedstawiono trzy sondy z dobrą inkorporacją: piki absorbancji fluoroforu mają podobną wysokość lub są wyższe niż piki DNA. Alexa Fluor 647 zazwyczaj wykazuje wyższą absorbancję niż Alexa Fluor 555, który z kolei wykazuje wyższą absorbancję niż Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorbuje również część światła przy 260 nm, dlatego pierwszy pik dla tej sondy jest wyższy niż dla pozostałych. Sondy ze słabą inkorporacją wykazują absorbancję fluoroforu 2-3 krotnie niższą niż absorbancję DNA. Sondy, w których pik fluoroforu jest ponad 2-krotnie wyższy niż pik DNA, zazwyczaj zawierają nie sprzężony barwnik, co może powodować tło w badaniu FISH.
<img alt="Analiza cytogenetyczna Metafer 4 z obrazowaniem komórek, identyfikacją plamek DNA, wynikami fluorescencji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Zrzut ekranu z oprogramowania do obrazowania FISH MetaCyte 3D przedstawiający typowy eksperyment FISH trójkolorowy. Ekran jest podzielony na kilka części. A) Surowy obraz pola widzenia (FOV) zarejestrowany przez system skanowania preparatów Metafer/MetaCyte. B) Galeria obrazów zidentyfikowanych jąder, które przeszły przetwarzanie obrazu i segmentację w celu wykrycia sygnałów FISH. Na każdym obrazie w galerii można wyświetlić różne typy danych. W tym przykładzie numer komórki jest pokazany w lewym górnym rogu, a różne odległości międzyalleliczne i międzyloci w prawym górnym rogu oraz po obu stronach pod każdym obrazem. C) Nazwa preparatu wraz z liczbą jąder zidentyfikowanych w analizie. D) Przedstawienie preparatu z obszarem zeskanowanym przez system. E) Powiększenie obszaru zeskanowanego. Białe plamki reprezentują zidentyfikowane jądra na FOV. F) Przetworzone dane. W tym przykładzie pokazano maksymalne odległości międzyalleliczne między sygnałami zielonymi (góra) i czerwonymi (dół). Przedstawione dane pochodzą z komórek rozrodczych myszy P20. Sondy znajdują się na różnych chromosomach, obejmując geny Hbb i Hba oraz klaster histonów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Analiza fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, bliskość genów, porównanie wykresów pudełkowych, wyniki eksperymentalne." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Przykłady przetworzonych obrazów i pochodnych danych pozycyjnych. A) Przetworzone obrazy komórek wątroby płodowej myszy w stadium E13.5, barwione sondami BAC zlokalizowanymi na różnych chromosomach, obejmującymi geny Myc i Kcnq1 (określone jako myc i KvDMR, odpowiednio w kolorze zielonym i czerwonym). B) Wykresy pudełkowe Tukeya przedstawiające rozkład odległości międzyallelicznych dla tych samych loci w 600 jądrach. Odległość międzyalleliczna jest przedstawiona jako ułamek promienia jądra (odległość/promień), aby uwzględnić zmienność wielkości jąder. Jądra komórek ES mają promień około 5 μm. Sondy czerwone znajdują się znacząco bliżej siebie niż sondy zielone (***: p&lt;0.01, nieparzysty test t). Dane z10.
Film 1. Modelowanie 3D dwóch loci w obrębie ich terytorium chromosomowego. Dwie sondy BAC zlokalizowane blisko obu końców chromosomu 7 myszy zostały znakowane (kolorem czerwonym i daleką czerwienią (pseudokolor biały)) i zhybrydyzowane wraz z barwnikiem do całego chromosomu (kolor zielony) w komórkach ES myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie rzetelnego badania organizacji przestrzennej konkretnych loci genomowych w pojedynczych komórkach. Cel ten jest osiągany poprzez wstępne wytworzenie sond znakowanych fluorescencyjnie, które docelowo zwiążą i uwydatnią interesujący region genomowy. Kolejne kroki polegają na przytwierdzeniu, utrwaleniu i permeabilizacji wybranych komórek na szkiełku w celu umożliwienia dostępu sondom.Następnie przeprowadza się jednoczesną denaturację termiczną sondy i DNA komórkowego, po której następują nocne etapy przemywania w celu usunięcia niespecyficznie związanej sondy oraz przeciwbarwienie za pomocą dpi. W celu wizualizacji jąder komórkowych wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ostatecznie ujawnią pozycję jądrową zajmowaną przez specyficzne regiony genomiczne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu organizacji jądra komórkowego, takie jak określanie interakcji funkcjonalnych między genami.Główną zaletą tego konkretnego protokołu DNA FISH jest to, że jest on szybki, niezawodny i wszechstronny. Chociaż prezentujemy tę metodę na przykładzie komórek E Es, można ją zastosować również do wielu innych typów komórek. Sondy znakowane bezpośrednio, wykonane z fragmentów o długości od 100 do 250 kb, konsekwentnie dają jasne sygnały, jeśli wymagane są mniejsze sondy.Należy użyć smid o wielkości od 40 do 50 kilobaz lub nawet plazmidów zawierających inserty o wielkości od pięciu do 10 kilobaz. Klonów BAC lub smid odpowiadających konkretnym genom należy zidentyfikować za pomocą przeglądarek genomu Ensemble lub UCSC. Aby przygotować wysokiej jakości DNA BAC, należy zastosować wielokrotne wytrącanie lub dostępny komercyjnie zestaw; czystość preparatu jest odwrotnie proporcjonalna do objętości wymaganej sondy.Oznakowanie należy przeprowadzić w dwóch etapach. W pierwszym kroku należy wykorzystać translację NIC w celu wprowadzenia allelu aminokwasowego, DUTP. W drugim kroku należy zastosować sprzęganie chemiczne, aby przyłączyć średnio reaktywny barwnik AM.Warto poświęcić czas na przygotowanie jasnych sond, ponieważ są one kluczowe dla uzyskania silnych sygnałów FISH. Procedurę tę można przeprowadzić równolegle z opracowywaniem komórek i nie musi ona być wykonana na początku dnia. Najpierw zmieszaj od 10 do 20 nanogramów bezpośrednio znakowanej sondy z sześcioma mikrolitrami CO 1D NA dla sześciu mikrogramów.Następnie dodać 1 µL jednoniciowego DNA z jąder łososia, aby uzyskać 9,7 µg. Dopełnić objętość mieszaniny wodą do 100 µL. Następnie dodać 10 µL 3 M octanu sodu oraz 275 µL etanolu i wymieszać za pomocą wortexa.Pozostaw mieszaninę do wytrącenia na co najmniej jedną godzinę w temperaturze -20 °C. Następnie wirowarką mikrocentryfugą odwirowuj osad z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Potem przemyj pellet 70% ethanol i ponownie odwirowuj go przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Następnie wysusz osad na powietrzu. Potem go resuspenduj. Zawieś go w pięciu 5 µL wody dejonizowanej.Inkubuj w 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 1000 RPM, zabezpieczając próbkę folią przed światłem. Po 30 minutach dodaj 5 µL mieszaniny siarczanu dekstryny i kontynuuj inkubację z wytrząsaniem. Proces ten trwa kolejne 10 minut. Zdolność komórek do przylegania do preparatu do slajdów znacznie różni się w zależności od typu komórek.Dla każdego typu komórek należy empirycznie określić optymalny czas sedymentacji oraz gęstość komórek. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, komórki powinny znajdować się w formie pojedynczej zawiesiny komórkowej. W celu przytwierdzenia mysich komórek ES do szkiełka, należy zacząć od obrysowania na szkiełku obszaru, w którym zostaną naniesione komórki.Używając pisaka hydrofobowego, należy przygotować zawiesinę od 20 do 50 000 komórek w 80 do 100 µL standardowej pożywki hodowlanej, nanieść zawiesinę komórkową do zaznaczonego okręgu i pozostawić komórki do przytwierdzenia przez około trzy godziny w inkubatorze z nawilżaniem. Po przytwierdzeniu do szkiełka, należy utrwalić komórki, delikatnie zanurzając szkiełko w 4% PFA na 10 minut. Szkiełko powinno leżeć płasko w tackach, takich jak pudełko na końcówki.Wykorzystanie odczynników w temperaturze pokojowej w naczyniach Coplan. Najpierw należy przeprowadzić quenching komórek za pomocą chlorku trisu przez 10 minut. Następnie należy przeprowadzić permeabilizację komórek, używając mieszaniny saponiny i Triton X 100 przez 10 minut.Następnie należy dwukrotnie przemyć komórki w PBS, przez pięć minut podczas każdego płukania. Po przemyciu komórki należy inkubować w 20% glicerolu przez co najmniej 20 minut. Na tym etapie preparaty można przechowywać w 50% glicerolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka tygodni.Przechowywanie przez jeden dzień lub dłużej powinno zwiększyć siłę sygnału. Przed kontynuowaniem należy upewnić się, że komórki zostały doprowadzone do temperatury pokojowej w 20% glicerolu w PBS. Następnie zamrozić i rozmrozić preparat trzy razy, używając ciekłego azotu.Przystępuj do pracy z jednym preparatem na raz, gdy ustanie dźwięk trzaskania. Po kilku sekundach przenieś preparat na ręcznik papierowy w celu rozmrożenia; poczekaj, aż mętny, zamrożony glicerol zniknie, zanim ponownie zamrozisz preparat. W rotacji można w ten sposób wygodnie przetworzyć do 15 preparatów w ciągu trzech cykli zamrażania i rozmrażania. Następnie przemyj preparaty dwukrotnie w PBS przez pięć minut na każde mycie.Następnie inkubuj preparaty na szkiełkach w 0,1 molarnym kwasie solnym przez 30 minut. Po obróbce kwasem solnym przeprowadź kolejne pięciominutowe płukanie w PBS. Teraz ponownie permeabilizuj komórki, stosując silniejszą mieszaninę sapin i Triton X 100 przez 30 minut; aby usunąć surfaktanty ze szkiełeczek, wykonaj dwa pięciominutowe płukania w PBS.Preparaty są teraz gotowe do równoważenia w 50% formamidzie w XSSC. Proces ten powinien trwać co najmniej 10 minut; podczas równoważenia należy pipetować sondę w górę i w dół kilka razy, a następnie przenieść 10 µL na każdą plamkę komórkową na szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze. Należy wyjąć preparat z formamidu i osuszyć nadmiar cieczy wokół komórek ręcznikiem papierowym, uważając jednak, aby plamka komórkowa nie wyschła.Teraz odwróć szkiełko nakrywkę. Nasuń je na preparat nad komórki. Przyklej szkiełko nakrywkę do przedmiotu szkiełka za pomocą cementu gumowego.Pozostaw cement do całkowitego wyschnięcia i przechowuj preparat w ciemności. Następnie podgrzewaj preparaty do 78 °C przez dokładnie dwie minuty na płycie grzejnej. Prawidłowe wykonanie tego kroku jest krytyczne.W tym kroku komórki muszą być osłonięte przed światłem, aby w jak największym stopniu zachować morfologię jąder. Krytyczne jest niedopuszczenie do wyschnięcia komórek oraz zapewnienie odpowiedniej temperatury bloku grzewczego. Następnie należy umieścić preparaty w szczelnym, nieprzepuszczającym światła pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi w celu zapewnienia wilgotności i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.Rozpocznij procedurę od odklejenia cementu gumowego z obrzeży szkiełek nakrywkowych. Następnie umieść każde preparat w nadmiarze buforu SC, aż szkiełka nakrywkowe poluzują się i zsuną. W kolejnym kroku przemyj preparaty w 50% formamidzie w dwukrotnym nadmiarze buforu SC przez 15 minut w temperaturze 45 °C.Kąpiel wodną należy pozostawić przykrytą, aby chronić preparaty przed światłem. Następnie szkiełka należy płukać w 0,2 XSSC przez 15 minut w temperaturze 63°C. Potem w 2X SSC przez pięć minut w temperaturze 45°C, a na koniec w nadmiarze SE w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Pozostałe kroki wykonuje się w temperaturze pokojowej, zaczynając od pięciominutowego płukania w PBS; następnie barwi się preparaty DAPI przez dwie minuty, a potem odbarwia w PBS przez pięć minut. Aby przymocować szkiełko nakrywkowe, nanosi się 10 µL medium montażowego na każdą plamkę komórkową na odpowiedniej wielkości szkiełku nakrywkowym. Następnie osusza się nadmiar PBS wokół plamki komórkowej, dbając o to, aby komórki nie wyschły.Odwrócić szkiełko nakrywkowe, nałożyć je na preparat i uszczelnić lakierem do paznokci zgodnie z protokołem przygotowania sondy FISH. Po translacji NIC powinien być widoczny rozmaz DNA, w którym większość fragmentów mieści się w zakresie od 150 do 700 par zasad. Po sprzężeniu chemicznym stopień wbudowania barwnika fluorescencyjnego można ocenić za pomocą analizy spektroskopowej przepływu sondy.Te kroki kontroli jakości służące do oceny jakości sondy są kluczowe przy wykorzystaniu takiej sondy. Możliwe było zastosowanie zautomatyzowanego obrazowania za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Wymaga to wyraźnych, łatwo identyfikowalnych sygnałów FISH przy minimalnym tle.Jest to surowy obraz pola widzenia. Kolejne obrazy przedstawiają jądra komórkowe, które zostały zidentyfikowane i przeanalizowane automatycznie. Różne odległości między allelami i między loci są pokazane w prawym górnym rogu oraz po obu stronach pod każdym jądrem.Na tym powiększeniu białe punkty reprezentują zidentyfikowane jądra na jedno pole widzenia. Te histogramy przedstawiają maksymalne odległości międzyalleliczne dla sygnałów zielonych (powyżej) i czerwonych (poniżej). Wszystkie dane pochodzą z komórek zarodkowych P 20 z sondami zlokalizowanymi na różnych chromosomach, obejmującymi geny HBB i HBA oraz klaster histonowy.Są to przykłady jąder komórek wątroby płodowej zabarwionych sondami tylnymi obejmującymi geny mic, KC oraz Q1. Na podstawie tych obrazów można wyznaczyć współrzędne jądrowe sygnałów ryb oraz obliczyć relacje przestrzenne regionów genomowych. Odległości między alleliczne przedstawiono jako ułamek promienia jądra.W tych danych sondy czerwone znajdowały się znacznie bliżej siebie niż sondy zielone. Możliwe było również zastosowanie mikroskopii konfokalnej, która wymaga silniejszych sygnałów. Stosy obrazów wykorzystano do modelowania 3D sygnałów ryb w obrębie ich terytoriów chromosomowych.Te dwie sondy w kolorze czerwonym i białym znajdują się blisko obu końców siódmego chromosomu myszy; cały malowany chromosom przedstawiono w kolorze zielonym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić hybrydyzację in situ fluorescencyjną (FISH) DNA w celu zbadania przestrzennego rozmieszczenia specyficznych loci genomicznych w pojedynczych komórkach. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, że wszelkie zabiegi mogą wpłynąć na architekturę jądra komórkowego, dlatego ważne jest zastosowanie odpowiednich kontroli po przeprowadzeniu tej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zależności przestrzenne między genami a białkami, można zastosować inne metody, np. immuno-FISH.

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oporne badanie FISH DNA 3D przy użyciu bezpośrednio oznaczonych sond

Niniejsza publikacja opisuje sposób wykorzystania systemu identyfikacji gatunków ryb Agilent Fish Species Identification System do określania gatunku ryby poprzez ekstrakcję DNA oraz przeprowadzenie analizy PCR i RFLP.

Protokół identyfikacji gatunków ryb w oparciu o DNA

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Izolacja i charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi pacjentów z rakiem jest rodzajem nieinwazyjnej płynnej biopsji i wiąże się z nawrotem choroby i progresją choroby. Ten film opisuje technikę fluorescencji-hybrydyzacji DNA in situ (DNA FISH) na CTC uchwyconych na przewodzie medycznym w celu zbadania konkretnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

3D DNA RYBY: technika lokalizacji określonego genu na chromosomie

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Poznaj solidną metodę 3D DNA FISH z bezpośrednio znakowanymi sondami fluorescencyjnymi do analizy architektury jądra komórkowego. Technika ta umożliwia wizualizację przestrzennej organizacji lokusów genomowych w pojedynczych komórkach.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Przeglądaj więcej filmów