Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie przestrzennej organizacji określonych loci genomowych w pojedynczych komórkach w solidny sposób. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie sond znakowanych fluorescencyjnie, aby ostatecznie związać i podkreślić interesujący nas region genomu. Kolejne kroki to przyklejenie, zamocowanie i permowanie interesujących komórek na szkiełku, aby umożliwić dostęp do sondy.

Następnie po jednoczesnej denaturacji cieplnej sondy i komórkowego DNA następuje nocne etapy hybrydyzacji sondy w celu usunięcia niespecyficznie związanej sondy i przeciwdziałania dpi. Aby zobrazować jądro komórkowe, wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ostatecznie ujawnią pozycję jądrową zajmowaną przez określone regiony genomu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie organizacji jądrowej, takie jak określenie funkcjonalnych interakcji między genami.

Główną zaletą tego konkretnego protokołu DNA FISH jest to, że jest szybki, solidny i wszechstronny. Chociaż demonstrujemy tę metodę za pomocą komórek ES, można ją również zastosować do wielu innych typów komórek, Bezpośrednio znakowane sondy wykonane z tyłu od 100 do 250. Kilobazy konsekwentnie wytwarzają jasne sygnały, jeśli wymagane są mniejsze sondy.

Użyj 40 do 50 kilozasad smid, a nawet plazmidów zawierających od pięciu do 10 kilozasad insertów. Zidentyfikuj klony tylne lub smid odpowiadające określonym genomom za pomocą przeglądarek genomu ensemble lub UCSC. Aby przygotować wysokiej jakości DNA wsteczne, należy użyć wielokrotnego wytrącania lub dostępnego na rynku zestawu, czystość preparatu jest proporcjonalna do wymaganej objętości sondy.

Wykonaj etykietowanie w dwóch krokach. Po pierwsze, użyj translacji NIC, aby wprowadzić allel aminowy, DUTP. Po drugie, użyj sprzężenia chemicznego, aby przyłączyć średni reaktywny barwnik AM.

Warto zainwestować czas w wykonanie jasnych sond, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla silnych sygnałów ryb. Zabieg ten może być wykonywany równolegle z leczeniem komórek i nie musi być wykonywany na początku dnia. Najpierw zmieszać od 10 do 20 nanogramów bezpośrednio znakowanej sondy z sześcioma mikrolitrami CO 1D NA przez sześć mikrogramów.

Następnie dodaj jeden mikrolitr jednoniciowego DNA z jąder łososia na 9,7 mikrograma. Dostosuj objętość mieszanki do 100 mikrolitrów z wodą. Następnie dodaj 10 mikrolitrów trzech molowych octanu sodu i 275 mikrolitrów etanolu i wymieszaj przez wirowanie.

Pozostaw mieszaninę do wytrącenia się przez co najmniej godzinę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie wiruj opady w mikro fuge z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj granulat 70% etanolem i ponownie odwiruj go przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wysuszyć pelety na powietrzu. Następnie resus. Zawieś go w pięciu mikrolitrach postaci dejonizowanej.

Amid w temperaturze 37 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 1000 obr./min, foliujesz, aby chronić go przed światłem. Po 30 minutach dodać pięć mikrolitrów mieszanki siarczanu dekstryny i kontynuować inkubację z mieszaniem. Jeszcze przez 10 minut skłonność komórek do przylegania do szkiełka znacznie różni się w zależności od typu komórki.

Dla każdego typu ogniwa należy empirycznie określić optymalny czas ustalania i gęstość komórek. Aby uzyskać spójne wyniki, komórki powinny znajdować się w zawiesinie pojedynczej komórki, aby przylegać do komórek ES myszy na szkiełku. Zacznij od zakreślenia obszaru na slajdzie, w którym zostaną wykryte komórki.

Za pomocą wstrzykiwacza hydrofobowego przygotować zawiesinę od 20 do 50 000 komórek na 80 do 100 mikrolitrów w normalnej pożywce hodowlanej, dodać zawiesinę komórek do koła i pozostawić komórki na około trzy godziny w wilgotnym inkubatorze. Po nasadce szkiełka zamocuj komórki, delikatnie zanurzając szkiełko w 4% PFA na 10 minut. Szkiełko powinno być płaskie w tacy, takiej jak pudełko na końcówki.

Używanie odczynników o temperaturze pokojowej w słoikach coplan. Najpierw schładzaj komórki chlorkiem tris przez 10 minut. Po drugie, przesiąkaj komórki za pomocą mieszanki sapin i trytonu X 100 przez 10 minut.

Teraz umyj komórki dwa razy w PBS przez pięć minut na pranie. Po przepłukaniu inkubować komórki w 20% glicerolu przez co najmniej 20 minut. W tym momencie szkiełka można przechowywać w 50% glicerolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka tygodni.

Przechowywanie przez dzień lub dłużej powinno zwiększyć siłę sygnału. Przed kontynuowaniem należy zrównoważyć komórki do temperatury pokojowej w 20% glicerolu w PBS. Teraz trzykrotnie zamroź i rozmroź szkiełko za pomocą ciekłego azotu.

Jeden slajd po slajdzie, gdy trzaski ustają. Po kilku sekundach wyjmij szkiełko na ręcznik papierowy w celu rozmrożenia, poczekaj, aż nieprzezroczysty zamrożony glicerol zniknie przed ponownym zamrożeniem szkiełka, można wygodnie wykonać do 15 szkiełek w ruchu obrotowym przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Teraz umyj szkiełka dwa razy w PBS przez pięć minut na pranie.

Następnie inkubować szkiełka w 0,1-molowym kwasie solnym przez 30 minut. Po potraktowaniu kwasem solnym należy przemyć je przez kolejne pięć minut w PBS. Teraz ponownie przesiąknij komórki mocniejszą sapiną i mieszanką Triton X 100 przez 30 minut, aby zmyć środki powierzchniowo czynne ze szkiełek, użyj dwóch pięciominutowych płukań PBS.

Szkiełka są teraz gotowe do zrównoważenia w 50% formie amidu do XSSC. Powinno to trwać co najmniej 10 minut podczas wyrównywania, kilkakrotnie pobrać sondę pipetowaną w górę iw dół, a następnie przenieść 10 mikrolitrów na miejsce komórki na szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze. Usuń szkiełko z amidu formy i osusz nadmiar płynu wokół komórek ręcznikiem papierowym, ale nie pozwól, aby miejsce komórki wyschło.

Teraz odwróć okładkę. Wsuń się na zjeżdżalnię nad komórkami. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka cementem gumowym.

Poczekaj, aż cement całkowicie wyschnie i chroń szkiełko przed światłem. Następnie podgrzej szkiełka do 78 stopni Celsjusza dokładnie przez dwie minuty na gorącej płycie. Ma to kluczowe znaczenie dla prawidłowego działania.

Na tym etapie osłona musi chronić komórki przed światłem, aby w jak największym stopniu zachować morfologię jądrową. Bardzo ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia ogniw i upewnić się, że ciepło ma odpowiednią temperaturę. Następnie umieść szkiełka w lekkim, szczelnym pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi, aby zapewnić wilgotność i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Rozpocznij tę procedurę od oderwania cementu gumowego z okolic szkiełek nakrywkowych. Następnie umieść każde szkiełko w X nadmiarze SC, aż pokrywa zsunie się i zsunie. Następnie umyj szkiełka w 50% formie amidowej w dwóch x nadmiarze SC przez 15 minut w temperaturze 45 stopni Celsjusza.

Trzymaj pokrywkę na łaźni wodnej, aby chronić je przed światłem. Następnie myj szkiełka w 0,2 XSSC przez 15 minut w temperaturze 63 stopni Celsjusza. Następnie dwa XSSC przez pięć minut w temperaturze 45 stopni Celsjusza, a na koniec do nadmiaru SE w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Pozostałe kroki odbywają się w temperaturze pokojowej, zaczynając od pięciominutowego mycia, a PBS teraz plami szkiełka dappy przez dwie minuty, a następnie zatrzymuj szkiełka za pomocą PBS przez pięć minut. Aby zamontować szkiełko nakrywkowe, nałóż 10 mikrolitrów podłoża montażowego na miejsce ogniwa na szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze. Następnie wysusz nadmiar PBS z okolic miejsca komórkowego, nie dopuszczając do wyschnięcia komórek.

Odwróć pokrywę, wsuń ją na szkiełko i uszczelnij lakierem do paznokci zgodnie z protokołem przygotowania sondy do ryb. Po translacji NIC powinien być widoczny rozmaz DNA, przy czym większość fragmentów ma od 150 do 700 par zasad. Po sprzężeniu chemicznym włączenie barwnika fluorescencyjnego można ocenić za pomocą analizy spektroskopowej przejścia sondy.

Te kroki kontroli jakości w celu oceny jakości sondy mają kluczowe znaczenie przy użyciu takiej sondy. Możliwe było zautomatyzowane obrazowanie za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Wymaga to ostrych, łatwych do zidentyfikowania sygnałów ryb z niewielkim tłem.

To jest surowy obraz w polu widzenia. Poniższe obrazy przedstawiają jądra, które zostały zidentyfikowane i przeanalizowane automatycznie. Różne odległości między allelikami i między locus są pokazane w prawym górnym rogu i po obu stronach poniżej każdego jądra.

W tym powiększeniu białe plamki reprezentują zidentyfikowane jądra w każdym polu widzenia. Te histogramy pokazują maksymalne odległości między allelikami między zielonymi sygnałami powyżej i czerwonymi sygnałami poniżej. Wszystkie dane pochodzą z komórek rozrodczych P 20 z sondami umieszczonymi na różnych chromosomach obejmujących geny HBB i HBA oraz klaster histonów.

Są to przykłady jąder wątroby płodu barwionych tylnymi sondami obejmującymi geny mic oraz KC i Q1. Na podstawie tych obrazów można uzyskać współrzędne jądrowe sygnałów ryb i obliczyć relacje przestrzenne regionów genomu. Odległości międzyalleliczne są wykreślane jako ułamek promienia jądra.

W tym przypadku czerwone sondy znajdowały się znacznie bliżej siebie niż zielone sondy. Mikroskopia konfokalna, która wymaga bardziej intensywnych sygnałów, była również możliwa. Stosy obrazów wykorzystano do modelowania 3D sygnałów ryb w obrębie ich terytoriów chromosomowych.

Te dwie sondy w kolorze czerwonym i białym znajdują się blisko obu końców chromosomu siódmego myszy, farba całego chromosomu jest pokazana na zielono. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać DNA ryb, aby zbadać położenie przestrzenne określonych loci genomowych w pojedynczych komórkach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że każde leczenie może wpływać na architekturę jądrową i ważne jest, aby uwzględnić odpowiednie Postępowanie zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak immuno fish, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak relacje przestrzenne między genami a białkami.