Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie rzetelnego badania organizacji przestrzennej konkretnych loci genomowych w pojedynczych komórkach. Cel ten jest osiągany poprzez wstępne wytworzenie sond znakowanych fluorescencyjnie, które docelowo zwiążą i uwydatnią interesujący region genomowy. Kolejne kroki polegają na przytwierdzeniu, utrwaleniu i permeabilizacji wybranych komórek na szkiełku w celu umożliwienia dostępu sondom.

Następnie przeprowadza się jednoczesną denaturację termiczną sondy i DNA komórkowego, po której następują nocne etapy przemywania w celu usunięcia niespecyficznie związanej sondy oraz przeciwbarwienie za pomocą dpi. W celu wizualizacji jąder komórkowych wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ostatecznie ujawnią pozycję jądrową zajmowaną przez specyficzne regiony genomiczne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu organizacji jądra komórkowego, takie jak określanie interakcji funkcjonalnych między genami.

Główną zaletą tego konkretnego protokołu DNA FISH jest to, że jest on szybki, niezawodny i wszechstronny. Chociaż prezentujemy tę metodę na przykładzie komórek E Es, można ją zastosować również do wielu innych typów komórek. Sondy znakowane bezpośrednio, wykonane z fragmentów o długości od 100 do 250 kb, konsekwentnie dają jasne sygnały, jeśli wymagane są mniejsze sondy.

Należy użyć smid o wielkości od 40 do 50 kilobaz lub nawet plazmidów zawierających inserty o wielkości od pięciu do 10 kilobaz. Klonów BAC lub smid odpowiadających konkretnym genom należy zidentyfikować za pomocą przeglądarek genomu Ensemble lub UCSC. Aby przygotować wysokiej jakości DNA BAC, należy zastosować wielokrotne wytrącanie lub dostępny komercyjnie zestaw; czystość preparatu jest odwrotnie proporcjonalna do objętości wymaganej sondy.

Oznakowanie należy przeprowadzić w dwóch etapach. W pierwszym kroku należy wykorzystać translację NIC w celu wprowadzenia allelu aminokwasowego, DUTP. W drugim kroku należy zastosować sprzęganie chemiczne, aby przyłączyć średnio reaktywny barwnik AM.

Warto poświęcić czas na przygotowanie jasnych sond, ponieważ są one kluczowe dla uzyskania silnych sygnałów FISH. Procedurę tę można przeprowadzić równolegle z opracowywaniem komórek i nie musi ona być wykonana na początku dnia. Najpierw zmieszaj od 10 do 20 nanogramów bezpośrednio znakowanej sondy z sześcioma mikrolitrami CO 1D NA dla sześciu mikrogramów.

Następnie dodać 1 µL jednoniciowego DNA z jąder łososia, aby uzyskać 9,7 µg. Dopełnić objętość mieszaniny wodą do 100 µL. Następnie dodać 10 µL 3 M octanu sodu oraz 275 µL etanolu i wymieszać za pomocą wortexa.

Pozostaw mieszaninę do wytrącenia na co najmniej jedną godzinę w temperaturze -20 °C. Następnie wirowarką mikrocentryfugą odwirowuj osad z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Potem przemyj pellet 70% ethanol i ponownie odwirowuj go przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Następnie wysusz osad na powietrzu. Potem go resuspenduj. Zawieś go w pięciu 5 µL wody dejonizowanej.

Inkubuj w 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 1000 RPM, zabezpieczając próbkę folią przed światłem. Po 30 minutach dodaj 5 µL mieszaniny siarczanu dekstryny i kontynuuj inkubację z wytrząsaniem. Proces ten trwa kolejne 10 minut. Zdolność komórek do przylegania do preparatu do slajdów znacznie różni się w zależności od typu komórek.

Dla każdego typu komórek należy empirycznie określić optymalny czas sedymentacji oraz gęstość komórek. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, komórki powinny znajdować się w formie pojedynczej zawiesiny komórkowej. W celu przytwierdzenia mysich komórek ES do szkiełka, należy zacząć od obrysowania na szkiełku obszaru, w którym zostaną naniesione komórki.

Używając pisaka hydrofobowego, należy przygotować zawiesinę od 20 do 50 000 komórek w 80 do 100 µL standardowej pożywki hodowlanej, nanieść zawiesinę komórkową do zaznaczonego okręgu i pozostawić komórki do przytwierdzenia przez około trzy godziny w inkubatorze z nawilżaniem. Po przytwierdzeniu do szkiełka, należy utrwalić komórki, delikatnie zanurzając szkiełko w 4% PFA na 10 minut. Szkiełko powinno leżeć płasko w tackach, takich jak pudełko na końcówki.

Wykorzystanie odczynników w temperaturze pokojowej w naczyniach Coplan. Najpierw należy przeprowadzić quenching komórek za pomocą chlorku trisu przez 10 minut. Następnie należy przeprowadzić permeabilizację komórek, używając mieszaniny saponiny i Triton X 100 przez 10 minut.

Następnie należy dwukrotnie przemyć komórki w PBS, przez pięć minut podczas każdego płukania. Po przemyciu komórki należy inkubować w 20% glicerolu przez co najmniej 20 minut. Na tym etapie preparaty można przechowywać w 50% glicerolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka tygodni.

Przechowywanie przez jeden dzień lub dłużej powinno zwiększyć siłę sygnału. Przed kontynuowaniem należy upewnić się, że komórki zostały doprowadzone do temperatury pokojowej w 20% glicerolu w PBS. Następnie zamrozić i rozmrozić preparat trzy razy, używając ciekłego azotu.

Przystępuj do pracy z jednym preparatem na raz, gdy ustanie dźwięk trzaskania. Po kilku sekundach przenieś preparat na ręcznik papierowy w celu rozmrożenia; poczekaj, aż mętny, zamrożony glicerol zniknie, zanim ponownie zamrozisz preparat. W rotacji można w ten sposób wygodnie przetworzyć do 15 preparatów w ciągu trzech cykli zamrażania i rozmrażania. Następnie przemyj preparaty dwukrotnie w PBS przez pięć minut na każde mycie.

Następnie inkubuj preparaty na szkiełkach w 0,1 molarnym kwasie solnym przez 30 minut. Po obróbce kwasem solnym przeprowadź kolejne pięciominutowe płukanie w PBS. Teraz ponownie permeabilizuj komórki, stosując silniejszą mieszaninę sapin i Triton X 100 przez 30 minut; aby usunąć surfaktanty ze szkiełeczek, wykonaj dwa pięciominutowe płukania w PBS.

Preparaty są teraz gotowe do równoważenia w 50% formamidzie w XSSC. Proces ten powinien trwać co najmniej 10 minut; podczas równoważenia należy pipetować sondę w górę i w dół kilka razy, a następnie przenieść 10 µL na każdą plamkę komórkową na szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze. Należy wyjąć preparat z formamidu i osuszyć nadmiar cieczy wokół komórek ręcznikiem papierowym, uważając jednak, aby plamka komórkowa nie wyschła.

Teraz odwróć szkiełko nakrywkę. Nasuń je na preparat nad komórki. Przyklej szkiełko nakrywkę do przedmiotu szkiełka za pomocą cementu gumowego.

Pozostaw cement do całkowitego wyschnięcia i przechowuj preparat w ciemności. Następnie podgrzewaj preparaty do 78 °C przez dokładnie dwie minuty na płycie grzejnej. Prawidłowe wykonanie tego kroku jest krytyczne.

W tym kroku komórki muszą być osłonięte przed światłem, aby w jak największym stopniu zachować morfologię jąder. Krytyczne jest niedopuszczenie do wyschnięcia komórek oraz zapewnienie odpowiedniej temperatury bloku grzewczego. Następnie należy umieścić preparaty w szczelnym, nieprzepuszczającym światła pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi w celu zapewnienia wilgotności i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

Rozpocznij procedurę od odklejenia cementu gumowego z obrzeży szkiełek nakrywkowych. Następnie umieść każde preparat w nadmiarze buforu SC, aż szkiełka nakrywkowe poluzują się i zsuną. W kolejnym kroku przemyj preparaty w 50% formamidzie w dwukrotnym nadmiarze buforu SC przez 15 minut w temperaturze 45 °C.

Kąpiel wodną należy pozostawić przykrytą, aby chronić preparaty przed światłem. Następnie szkiełka należy płukać w 0,2 XSSC przez 15 minut w temperaturze 63°C. Potem w 2X SSC przez pięć minut w temperaturze 45°C, a na koniec w nadmiarze SE w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Pozostałe kroki wykonuje się w temperaturze pokojowej, zaczynając od pięciominutowego płukania w PBS; następnie barwi się preparaty DAPI przez dwie minuty, a potem odbarwia w PBS przez pięć minut. Aby przymocować szkiełko nakrywkowe, nanosi się 10 µL medium montażowego na każdą plamkę komórkową na odpowiedniej wielkości szkiełku nakrywkowym. Następnie osusza się nadmiar PBS wokół plamki komórkowej, dbając o to, aby komórki nie wyschły.

Odwrócić szkiełko nakrywkowe, nałożyć je na preparat i uszczelnić lakierem do paznokci zgodnie z protokołem przygotowania sondy FISH. Po translacji NIC powinien być widoczny rozmaz DNA, w którym większość fragmentów mieści się w zakresie od 150 do 700 par zasad. Po sprzężeniu chemicznym stopień wbudowania barwnika fluorescencyjnego można ocenić za pomocą analizy spektroskopowej przepływu sondy.

Te kroki kontroli jakości służące do oceny jakości sondy są kluczowe przy wykorzystaniu takiej sondy. Możliwe było zastosowanie zautomatyzowanego obrazowania za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Wymaga to wyraźnych, łatwo identyfikowalnych sygnałów FISH przy minimalnym tle.

Jest to surowy obraz pola widzenia. Kolejne obrazy przedstawiają jądra komórkowe, które zostały zidentyfikowane i przeanalizowane automatycznie. Różne odległości między allelami i między loci są pokazane w prawym górnym rogu oraz po obu stronach pod każdym jądrem.

Na tym powiększeniu białe punkty reprezentują zidentyfikowane jądra na jedno pole widzenia. Te histogramy przedstawiają maksymalne odległości międzyalleliczne dla sygnałów zielonych (powyżej) i czerwonych (poniżej). Wszystkie dane pochodzą z komórek zarodkowych P 20 z sondami zlokalizowanymi na różnych chromosomach, obejmującymi geny HBB i HBA oraz klaster histonowy.

Są to przykłady jąder komórek wątroby płodowej zabarwionych sondami tylnymi obejmującymi geny mic, KC oraz Q1. Na podstawie tych obrazów można wyznaczyć współrzędne jądrowe sygnałów ryb oraz obliczyć relacje przestrzenne regionów genomowych. Odległości między alleliczne przedstawiono jako ułamek promienia jądra.

W tych danych sondy czerwone znajdowały się znacznie bliżej siebie niż sondy zielone. Możliwe było również zastosowanie mikroskopii konfokalnej, która wymaga silniejszych sygnałów. Stosy obrazów wykorzystano do modelowania 3D sygnałów ryb w obrębie ich terytoriów chromosomowych.

Te dwie sondy w kolorze czerwonym i białym znajdują się blisko obu końców siódmego chromosomu myszy; cały malowany chromosom przedstawiono w kolorze zielonym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić hybrydyzację in situ fluorescencyjną (FISH) DNA w celu zbadania przestrzennego rozmieszczenia specyficznych loci genomicznych w pojedynczych komórkach. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, że wszelkie zabiegi mogą wpłynąć na architekturę jądra komórkowego, dlatego ważne jest zastosowanie odpowiednich kontroli po przeprowadzeniu tej procedury.

W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zależności przestrzenne między genami a białkami, można zastosować inne metody, np. immuno-FISH.