Transformacja bakteryjna: metoda szoku termicznego

Transformacja bakteryjna jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania obcego DNA do bakterii, która może następnie amplifikować lub klonować ten materiał genetyczny. Komórki posiadające zdolność do łatwego pobierania DNA nazywane są komórkami kompetentnymi. Choć transformacja występuje naturalnie u wielu rodzajów bakterii, naukowcy opracowali metody sztucznego indukowania i zwiększania kompetencji komórek bakteryjnych. W tym filmie omówimy jedną z tych metod – transformację za pomocą szoku termicznego.

Zanim omówimy technikę szoku termicznego, przyjrzyjmy się najczęściej stosowanemu w transformacji bakteryjnej rodzajowi DNA: plazmidowi. Plazmid to mała, kolista, dwuniciowa cząsteczka DNA, która może zmniejszyć swój rozmiar poprzez superzwinięcie, dzięki czemu może łatwo przenikać przez pory w błonie komórkowej.

Plazmid zawiera kilka istotnych regionów, o których warto wspomnieć. Plazmidy dostępne komercyjnie zawierają miejsce wielokrotnego klonowania, czyli MCS. Region ten zawiera specyficzne sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne, które przecinają DNA. Fragmenty DNA interesujące badacza mogą zostać wstawione do miejsca wielokrotnego klonowania, gdy plazmid i fragment DNA zostaną przecięte tymi samymi endonukleazami.

Plazmidy zawierają również miejsce inicjacji replikacji, czyli ORI, które dostarcza komórce informacji o tym, gdzie powinna rozpocząć się replikacja plazmidu.

Oprócz miejsca inicjacji replikacji i miejsca wielokrotnego klonowania, większość plazmidów zawiera gen oporności na antybiotyki. Gen ten nadaje oporność na antybiotyki wszystkim komórkom zawierającym plazmid, umożliwiając im przetrwanie w pożywkach zawierających antybiotyk.

Po omówieniu plazmidów porozmawiajmy o komórkach, do których zostaną one wprowadzone: komórkach kompetentnych. Najczęściej stosowanym w badaniach biologii molekularnej i transformacji rodzajem bakterii jest E. coli, która występuje również w dolnym odcinku jelit człowieka. Komórki stają się zazwyczaj kompetentne poprzez poddanie ich działaniu środowiska bogatego w wapń.

Dodatnie ładunki jonów wapnia neutralizują ujemne ładunki zarówno plazmidu, jak i bakteryjnej ściany komórkowej, co niweluje odpychanie elektrostatyczne i osłabia ścianę komórkową.

Poprzez poddanie komórek gwałtownemu wzrostowi temperatury, czyli szokowi termicznemu, powstaje różnica ciśnień między wnętrzem a zewnętrzem komórki, co indukuje tworzenie się porów, przez które może wniknąć superzwinięte DNA plazmidowe. Po przywróceniu komórek do normalnej temperatury, ściana komórkowa ulega samoregeneracji.

Gdy komórki pobiorą plazmid, będą one w stanie rosnąć na płytkach z agarem z dodatkiem antybiotyku.

Przed rozpoczęciem transformacji metodą szoku termicznego należy oczyścić obszar roboczy i upewnić się, że cały sprzęt został wysterylizowany.

Należy upewnić się, że przygotowano wystarczającą ilość pożywek i agaru, które zapewnią odżywienie bakterii poddawanych procesowi czynienia kompetentnymi. Należy również wysterylizować wszystkie roztwory w autoklawie. Przed użyciem należy pozwolić pożywkom w płynie ostygnąć do temperatury pokojowej, a agarowi schłodzić do 50-55˚C – jest to temperatura, w której można dodać antybiotyk i zalać szalki. Następnie należy pozostawić szalki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej w celu zastygnięcia agaru.

Podczas pracy z bakteriami należy zawsze stosować techniki aseptyczne w celu zachowania sterylności. Technika aseptyczna zazwyczaj obejmuje użycie palnika Bunsena do sterylizacji narzędzi i odczynników oraz wytworzenie prądu konwekcyjnego, który zapobiega przedostawaniu się zanieczyszczeń z powietrza do obszaru roboczego.

Bezpośrednio przed reakcją szoku termicznego należy ogrzać pożywki do temperatury pokojowej, a szalki z agarem LB zawierającym antybiotyk do 37°C. Należy również upewnić się, że łaźnia wodna jest nagrzana do 42°C.

Następnie należy rozmrozić chemicznie kompetentne komórki na lodzie.

Do komórek bakteryjnych należy dodać 1-5uL zimnego plazmidu o stężeniu 1ng/μL, delikatnie wymieszać, a następnie przenieść mieszaninę komórek i plazmidu z powrotem na lód na 30 minut.

Po upływie tego czasu należy poddać mieszaninę komórek i plazmidu szokowi termicznemu, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 42˚C na 30 sekund.

Natychmiast po wyjęciu probówki z łaźni wodnej należy umieścić ją na lodzie i dodać 450μL pożywki. Następnie probówkę należy umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C na 1 godzinę przy prędkości powyżej 225 rpm, aby komórki mogły przejść regenerację.

Stosując właściwą technikę aseptyczną, należy nanieść 20-200uL bakterii na szalkę z agarem LB i rozprowadzić pożywkę za pomocą rozsypacza do bakterii. Szalki należy inkubować przez noc w temperaturze 37˚C w pozycji odwróconej, aby zapobiec kontaktowi bakterii z kondensatem.

Następnego dnia bakterie, które pobrały plazmid, tworzą kolonie.

Następnie należy policzyć kolonie, aby obliczyć wydajność transformacji, która jest stosunkiem liczby udanych transformantów do całkowitej ilości DNA naniesionego na szalkę.

Teraz można wyselekcjonować kolonie do dalszych eksperymentów.

Przed uczynieniem ich kompetentnymi, bakterie wykorzystywane w transformacji są przechowywane w zamrażarce. Należy je rozmrozić na lodzie, wysiać na płytkę z agarem – bez antybiotyków – i inkubować przez noc w temperaturze 37˚C.

Stosując technikę aseptyczną, należy wybrać kolonię bakterii z płytki z agarem i namnożyć ją w dużej kulturze 500 ml przez noc w temperaturze 37˚C w inkubatorze z wytrząsaniem – urządzeniu, które zapobiega sedymentacji bakterii i zapewnia równomierne rozprowadzenie składników odżywczych w pożywce.

Podczas wzrostu komórek należy przygotować roztwory 0.1 M chlorku wapnia oraz 0.1 M chlorku wapnia z dodatkiem 15% glicerolu, wysterylizować je w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia.

Pomiary absorbancji służą do określenia, czy bakterie znajdują się w średniej fazie logarytmicznej wzrostu, w której łatwo pobierają DNA. Po osiągnięciu tej fazy przez komórki, należy umieścić je na lodzie i utrzymywać w tej temperaturze przez cały czas trwania procedury.

Następnie komórki bakteryjne należy rozdzielić do dwóch dużych probówek do wirowania i wirować w temperaturze 4°C. Należy odlać nadsącz i zawiesić komórki w około 100 ml zimnego 0.1 M chlorku wapnia. Następnie komórki inkubuje się na lodzie przez 30 minut. Krok ten powtarza się co najmniej raz. Cykle wirowania i ponownego zawieszenia komórek są często określane jako przemywanie komórek.

Po ostatnim przemyciu komórki zawiesza się w zimnym 50 mL 0.1 M roztworze chlorku wapnia z 15% glicerolem. Komórki te są teraz chemicznie kompetentne.

Należy rozdzielić po 50μL bakterii do wielu probówek do mikrowirowania i przechowywać w temperaturze -80˚C do momentu przeprowadzenia szoku termicznego.

Istnieje wiele zastosowań i wariantów transformacji bakteryjnej.

Oprócz szoku termicznego, inną powszechnie stosowaną techniką transformacji jest elektroporacja. Jak wynika z nazwy, elektroporacja polega na wykorzystaniu prądu elektrycznego do tworzenia w błonie komórkowej bakterii porów, przez które może przeniknąć DNA.

W odniesieniu do selekcji transformowanych bakterii, plazmidy często zawierają gen kodujący enzym beta-galaktozydazę, aby ułatwić ten proces. Gdy podłoże dla tego enzymu znajduje się w płytkach z agarem, bakterie transformowane plazmidami zawierającymi insert tworzą białe kolonie, natomiast te, które go nie posiadają, tworzą kolonie niebieskie. Metoda ta nazywana jest selekcją niebiesko-białą.

W większości eksperymentów z transformacją celem jest uzyskanie szybko dzielących się bakterii, aby wyprodukować duże ilości plazmidu zawierającego gen docelowy. Po transformacji bakteryjnej kolejnym krokiem jest namnożenie dużej ilości bakterii w płynnym medium zawierającym antybiotyk i przeprowadzenie oczyszczania plazmidów, co, zgodnie z nazwą, polega na wyizolowaniu plazmidów z bakterii. W tym celu dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów.

Czasami celem transformacji jest zmuszenie bakterii do wytworzenia dużych ilości białka kodowanego przez plazmid. Tutaj widzimy homogenizację i lizę komórek bakteryjnych przed przeprowadzeniem techniki zwanej oczyszczaniem powinowactwa w celu izolacji białka docelowego. Po oczyszczeniu dużych ilości białka można je skrystalizować, co pozwala na zidentyfikowanie struktury konkretnego białka będącego przedmiotem badań.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE Wprowadzenie do transformacji metodą szoku termicznego. W tym materiale omówiliśmy: czym jest transformacja metodą szoku termicznego i jak ona przebiega, zasadę jej działania oraz sposób skutecznej transformacji bakterii. Dziękujemy za uwagę!