Transformacja bakteryjna jest szeroko stosowaną metodą, w której obce DNA jest wprowadzane do bakterii, która może następnie amplifikować lub klonować DNA. Komórki, które mają zdolność łatwego wchłaniania tego DNA, nazywane są komórkami kompetentnymi. Chociaż transformacja zachodzi naturalnie w wielu typach bakterii, naukowcy znaleźli sposoby na sztuczne wywołanie i zwiększenie kompetencji komórki bakteryjnej. W tym filmie porozmawiamy o jednym z tych sposobów, transformacji szoku cieplnego.
Zanim porozmawiamy o technice szoku cieplnego, omówmy najpierw rodzaj DNA najczęściej używany w transformacji bakteryjnej: plazmid. Plazmid to mały, okrągły, dwuniciowy DNA, który może zmniejszyć swój rozmiar poprzez superzwijanie, dzięki czemu może łatwo przejść przez pory w błonie komórkowej.
Plazmid zawiera kilka ważnych regionów, o których warto wspomnieć. Dostępne na rynku plazmidy zawierają wiele miejsc klonowania lub MCS. Region ten zawiera specyficzne sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne, które rozszczepiają DNA. Fragmenty DNA interesujące badacza mogą zostać wprowadzone do miejsca klonowania wielokrotnego, gdy plazmid i fragment DNA zostaną przecięte tymi samymi endonukleazami.
Plazmidy zawierają również początek replikacji lub ORI, który dostarcza komórce informacji o tym, gdzie powinna rozpocząć się replikacja plazmidu.
Oprócz pochodzenia replikacji i miejsca wielokrotnego klonowania, większość plazmidów będzie zawierać gen oporności na antybiotyki. Gen ten nadaje oporność na antybiotyki wszystkim komórkom zawierającym plazmid, umożliwiając tym komórkom przetrwanie w pożywce zawierającej antybiotyki.
Teraz, gdy omówiliśmy plazmidy, porozmawiajmy o komórkach, do których zostaną wprowadzone: kompetentne komórki. Najczęściej stosowanym typem bakterii w badaniach i transformacji biologii molekularnej jest E. coli, która zamieszkuje również dolne jelito. Komórki są zazwyczaj kompetentne poprzez wystawienie na działanie środowiska bogatego w wapń.
Dodatnie ładunki jonów wapnia neutralizują ładunki ujemne zarówno plazmidu, jak i ściany komórkowej bakterii, rozpraszając odpychanie elektrostatyczne i osłabiając ścianę komórkową.
Wystawiając komórki na nagły wzrost temperatury lub szok cieplny, powstaje różnica ciśnień między zewnętrzem a wnętrzem komórki, która indukuje tworzenie się porów, przez które może dostać się superskręcone plazmidowe DNA. Po przywróceniu komórek do bardziej normalnej temperatury, ściana komórkowa samosię naprawi.
Gdy komórki wchłoną plazmid, będą mogły rosnąć na płytkach agarowych z dodatkiem antybiotyku.
Przed rozpoczęciem transformacji szoku cieplnego oczyść obszar roboczy i upewnij się, że cały sprzęt jest wysterylizowany.
Upewnij się, że masz przygotowaną wystarczającą ilość pożywki i agaru, które zapewniają pożywienie bakteriom, które sprawisz, że będą kompetentne. Pamiętaj również, aby wysterylizować wszystkie roztwory za pomocą autoklawowania. Przed użyciem pozwól płynnemu pożywce ostygnąć do temperatury pokojowej i pozwól agarowi ostygnąć do 50-55°C, temperatury, w której można dodać antybiotyk i wlać płytki. Pozwól płytkom ostygnąć do temperatury pokojowej w celu zestalenia się.
Podczas pracy z bakteriami należy zawsze stosować technikę aseptyczną, aby zachować sterylność. Technika aseptyczna zazwyczaj polega na użyciu palnika Bunsena do sterylizacji narzędzi i odczynników oraz wytworzenia prądu konwekcyjnego, który utrzymuje zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu z dala od miejsca pracy.
Bezpośrednio przed reakcją szoku cieplnego należy podgrzać pożywkę do temperatury pokojowej, a płytki agarowe LB zawierające antybiotyki do 37°C. Upewnij się również, że kąpiel wodna ma temperaturę 42°C.
Następnie rozmrozić chemicznie kompetentne komórki na lodzie.
Dodaj 1-5 uL zimnego plazmidu 1ng / μL do komórek bakteryjnych, delikatnie wymieszaj i zwróć mieszaninę komórek i plazmidów do lodu na 30 minut.
Po upływie czasu należy poddać szok cieplny mieszaninie komórek i plazmidów, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 42°C na 30 sekund.
Natychmiast po wyjęciu probówki z łaźni wodnej należy wyłożyć ją na lód i dodać 450 μl pożywki. Umieść go w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C na 1 godzinę z prędkością ponad 225 obr./min, aby komórki mogły się zregenerować.
Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, dodaj 20-200 uL bakterii do płytki agarowej LB i rozprowadź podłoże za pomocą rozsiewacza bakteryjnego. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37°C do góry nogami, aby zapobiec narażeniu bakterii na kondensację.
Następnego dnia bakterie, które przyjęły plazmid, tworzą kolonie.
Następnie policz kolonie, aby obliczyć wydajność transformacji, czyli liczbę udanych transformantów podzieloną przez całkowitą ilość platerowanego DNA.
Teraz kolonie można wybrać do dalszych eksperymentów.
Przed uzyskaniem kompetencji bakterie użyte w transformacji są przechowywane w zamrażarce. Muszą być rozmrożone na lodzie, rozprowadzone na płycie agarowej – bez antybiotyków i pozostawione do wzrostu przez noc w temperaturze 37°C.
Stosując technikę aseptyczną, wybierz kolonię bakteryjną z płytki agarowej i hoduj ją w dużej kulturze o pojemności 500 ml przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem – urządzeniu, które zapobiega sedymentacji bakterii, a nawet rozprzestrzenianiu się składników odżywczych w pożywce.
Podczas wzrostu komórek przygotuj 0,1 molowego chlorku wapnia i 0,1 molowego chlorku wapnia plus 15% roztworów glicerolu, autoklaw i ostudź.
Pomiary absorbancji służą do określenia, czy bakterie znajdują się w środkowej fazie wzrostu, co oznacza, że łatwo wchłoną DNA. Gdy komórki osiągną tę fazę, umieść je na lodzie i trzymaj tam przez cały zabieg.
Następnie rozdzielić komórki bakteryjne do dwóch dużych probówek wirówkowych i odwirować w temperaturze 4°C. Odlać supernatant i ponownie zawiesić w około 100 ml 0,1 mola zimnego chlorku wapnia. Następnie inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut. Ten krok jest powtarzany co najmniej jeszcze raz. Cykle wirowania i ponownego zawieszania komórek są często określane jako mycie komórek.
Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w zimnym 50 ml 0,1 molowego roztworu chlorku wapnia plus 15% roztworu glicerolu. Komórki te są teraz kompetentne chemicznie.
Rozprowadź 50 μl bakterii w wielu probówkach do mikrofuge i przechowuj w temperaturze -80°C, aż będziesz gotowy na szok termiczny.
Istnieje wiele zastosowań i wariantów transformacji bakteryjnej.
Oprócz szoku cieplnego, eletroporacja jest inną powszechną techniką transformacji. Jak sama nazwa wskazuje, elektroporacja polega na wykorzystaniu energii elektrycznej do tworzenia porów w błonie komórkowej bakterii, przez które może przejść DNA.
Jeśli chodzi o badania przesiewowe w kierunku transformowanych bakterii, plazmidy często zawierają gen kodujący enzym beta-galaktozydazę, który pomaga w badaniach przesiewowych. Gdy substrat dla tego enzymu jest zawarty w płytkach agarowych, bakterie, które zostały przekształcone za pomocą plazmidów zawierających wkładkę, dają białe kolonie, podczas gdy te, które tego nie robią, dają niebieskie kolonie. Ta metoda jest określana jako niebieskie i białe przesiewanie.
W większości eksperymentów transformacyjnych celem jest uzyskanie szybko dzielących się bakterii do wytworzenia dużych ilości plazmidu, który obejmuje gen docelowy. Po transformacji bakteryjnej kolejnym krokiem jest wyhodowanie dużych ilości bakterii w płynnym pożywce zawierającej antybiotyk i przeprowadzenie oczyszczania plazmidu, które, jak sama nazwa wskazuje, polega na oczyszczeniu plazmidów z bakterii. W tym celu dostępnych jest wiele zestawów komercyjnych.
Czasami celem transformacji jest to, aby bakterie wytworzyły duże ilości białka kodowanego przez plazmid. Tutaj widzisz, jak komórki bakteryjne są homogenizowane i poddawane lizie, zanim będzie można przeprowadzić technikę zwaną oczyszczaniem powinowactwa w celu wyizolowania docelowego białka. Po oczyszczeniu dużych ilości białka można je następnie skrystalizować i zidentyfikować strukturę konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Właśnie obejrzałeś JoVE Wprowadzenie do transformacji szoku cieplnego. W tym filmie omówiliśmy: czym jest transformacja szoku cieplnego i jak działa, jaka jest jej zasada i jak skutecznie przekształcić bakterie. Dzięki za oglądanie!
Transformacja to proces, który zachodzi, gdy komórka połyka obce DNA z otoczenia. Przemiana może zachodzić w naturze w niektórych typach bakterii. W biologii molekularnej transformacja jest sztucznie odtwarzana w laboratorium poprzez tworzenie porów w błonach komórkowych bakterii. Komórki bakteryjne, które są w stanie pobierać DNA ze środowiska, nazywane są komórkami kompetentnymi. W laboratorium komórki bakteryjne mogą być kompetentne, a następnie wprowadzone DNA za pomocą procedury zwanej metodą szoku cieplnego.
Transformacja szoku cieplnego wykorzystuje bogate w wapń środowisko dostarczane przez chlorek wapnia, aby przeciwdziałać odpychaniu elektrostatycznemu między plazmidowym DNA a błoną komórkową bakterii. Nagły wzrost temperatury tworzy pory w błonie plazmatycznej bakterii i pozwala plazmidowemu DNA dostać się do komórki bakteryjnej. W tym filmie omówiono krok po kroku, jak stworzyć chemicznie kompetentne bakterie, przeprowadzić transformację szoku cieplnego, pokryć przekształcone bakterie i obliczyć wydajność transformacji.
Transformacja bakteryjna jest szeroko stosowaną metodą, w której obce DNA jest wprowadzane do bakterii, która może następnie amplifikować lub klonować DNA. Komórki, które mają zdolność łatwego wchłaniania tego DNA, nazywane są komórkami kompetentnymi. Chociaż transformacja zachodzi naturalnie w wielu typach bakterii, naukowcy znaleźli sposoby na sztuczne wywołanie i zwiększenie kompetencji komórki bakteryjnej. W tym filmie porozmawiamy o jednym z tych sposobów, transformacji szoku cieplnego.
Zanim porozmawiamy o technice szoku cieplnego, omówmy najpierw rodzaj DNA najczęściej używany w transformacji bakteryjnej: plazmid. Plazmid to mały, okrągły, dwuniciowy DNA, który może zmniejszyć swój rozmiar poprzez superzwijanie, dzięki czemu może łatwo przejść przez pory w błonie komórkowej.
Plazmid zawiera kilka ważnych regionów, o których warto wspomnieć. Dostępne na rynku plazmidy zawierają wiele miejsc klonowania lub MCS. Region ten zawiera specyficzne sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne, które rozszczepiają DNA. Fragmenty DNA interesujące badacza mogą zostać wprowadzone do miejsca klonowania wielokrotnego, gdy plazmid i fragment DNA zostaną przecięte tymi samymi endonukleazami.
Plazmidy zawierają również początek replikacji lub ORI, który dostarcza komórce informacji o tym, gdzie powinna rozpocząć się replikacja plazmidu.
Oprócz pochodzenia replikacji i miejsca wielokrotnego klonowania, większość plazmidów będzie zawierać gen oporności na antybiotyki. Gen ten nadaje oporność na antybiotyki wszystkim komórkom zawierającym plazmid, umożliwiając tym komórkom przetrwanie w pożywce zawierającej antybiotyki.
Teraz, gdy omówiliśmy plazmidy, porozmawiajmy o komórkach, do których zostaną wprowadzone: kompetentne komórki. Najczęściej stosowanym typem bakterii w badaniach i transformacji biologii molekularnej jest E. coli, która zamieszkuje również dolne jelito. Komórki są zazwyczaj kompetentne poprzez wystawienie na działanie środowiska bogatego w wapń.
Dodatnie ładunki jonów wapnia neutralizują ładunki ujemne zarówno plazmidu, jak i ściany komórkowej bakterii, rozpraszając odpychanie elektrostatyczne i osłabiając ścianę komórkową.
Wystawiając komórki na nagły wzrost temperatury lub szok cieplny, powstaje różnica ciśnień między zewnętrzem a wnętrzem komórki, która indukuje tworzenie się porów, przez które może dostać się superskręcone plazmidowe DNA. Po przywróceniu komórek do bardziej normalnej temperatury, ściana komórkowa samosię naprawi.
Gdy komórki wchłoną plazmid, będą mogły rosnąć na płytkach agarowych z dodatkiem antybiotyku.
Przed rozpoczęciem transformacji szoku cieplnego oczyść obszar roboczy i upewnij się, że cały sprzęt jest wysterylizowany.
Upewnij się, że masz przygotowaną wystarczającą ilość pożywki i agaru, które zapewniają pożywienie bakteriom, które sprawisz, że będą kompetentne. Pamiętaj również, aby wysterylizować wszystkie roztwory za pomocą autoklawowania. Przed użyciem pozwól płynnemu pożywce ostygnąć do temperatury pokojowej i pozwól agarowi ostygnąć do 50-55°C, temperatury, w której można dodać antybiotyk i wlać płytki. Pozwól płytkom ostygnąć do temperatury pokojowej w celu zestalenia się.
Podczas pracy z bakteriami należy zawsze stosować technikę aseptyczną, aby zachować sterylność. Technika aseptyczna zazwyczaj polega na użyciu palnika Bunsena do sterylizacji narzędzi i odczynników oraz wytworzenia prądu konwekcyjnego, który utrzymuje zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu z dala od miejsca pracy.
Bezpośrednio przed reakcją szoku cieplnego należy podgrzać pożywkę do temperatury pokojowej, a płytki agarowe LB zawierające antybiotyki do 37°C. Upewnij się również, że kąpiel wodna ma temperaturę 42°C.
Następnie rozmrozić chemicznie kompetentne komórki na lodzie.
Dodaj 1-5 uL zimnego plazmidu 1ng / μL do komórek bakteryjnych, delikatnie wymieszaj i zwróć mieszaninę komórek i plazmidów do lodu na 30 minut.
Po upływie czasu należy poddać szok cieplny mieszaninie komórek i plazmidów, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 42°C na 30 sekund.
Natychmiast po wyjęciu probówki z łaźni wodnej należy wyłożyć ją na lód i dodać 450 μl pożywki. Umieść go w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C na 1 godzinę z prędkością ponad 225 obr./min, aby komórki mogły się zregenerować.
Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, dodaj 20-200 uL bakterii do płytki agarowej LB i rozprowadź podłoże za pomocą rozsiewacza bakteryjnego. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37°C do góry nogami, aby zapobiec narażeniu bakterii na kondensację.
Następnego dnia bakterie, które przyjęły plazmid, tworzą kolonie.
Następnie policz kolonie, aby obliczyć wydajność transformacji, czyli liczbę udanych transformantów podzieloną przez całkowitą ilość platerowanego DNA.
Teraz kolonie można wybrać do dalszych eksperymentów.
Przed uzyskaniem kompetencji bakterie użyte w transformacji są przechowywane w zamrażarce. Muszą być rozmrożone na lodzie, rozprowadzone na płycie agarowej – bez antybiotyków i pozostawione do wzrostu przez noc w temperaturze 37°C.
Stosując technikę aseptyczną, wybierz kolonię bakteryjną z płytki agarowej i hoduj ją w dużej kulturze o pojemności 500 ml przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem – urządzeniu, które zapobiega sedymentacji bakterii, a nawet rozprzestrzenianiu się składników odżywczych w pożywce.
Podczas wzrostu komórek przygotuj 0,1 molowego chlorku wapnia i 0,1 molowego chlorku wapnia plus 15% roztworów glicerolu, autoklaw i ostudź.
Pomiary absorbancji służą do określenia, czy bakterie znajdują się w środkowej fazie wzrostu, co oznacza, że łatwo wchłoną DNA. Gdy komórki osiągną tę fazę, umieść je na lodzie i trzymaj tam przez cały zabieg.
Następnie rozdzielić komórki bakteryjne do dwóch dużych probówek wirówkowych i odwirować w temperaturze 4°C. Odlać supernatant i ponownie zawiesić w około 100 ml 0,1 mola zimnego chlorku wapnia. Następnie inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut. Ten krok jest powtarzany co najmniej jeszcze raz. Cykle wirowania i ponownego zawieszania komórek są często określane jako mycie komórek.
Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w zimnym 50 ml 0,1 molowego roztworu chlorku wapnia plus 15% roztworu glicerolu. Komórki te są teraz kompetentne chemicznie.
Rozprowadź 50 μl bakterii w wielu probówkach do mikrofuge i przechowuj w temperaturze -80°C, aż będziesz gotowy na szok termiczny.
Istnieje wiele zastosowań i wariantów transformacji bakteryjnej.
Oprócz szoku cieplnego, eletroporacja jest inną powszechną techniką transformacji. Jak sama nazwa wskazuje, elektroporacja polega na wykorzystaniu energii elektrycznej do tworzenia porów w błonie komórkowej bakterii, przez które może przejść DNA.
Jeśli chodzi o badania przesiewowe w kierunku transformowanych bakterii, plazmidy często zawierają gen kodujący enzym beta-galaktozydazę, który pomaga w badaniach przesiewowych. Gdy substrat dla tego enzymu jest zawarty w płytkach agarowych, bakterie, które zostały przekształcone za pomocą plazmidów zawierających wkładkę, dają białe kolonie, podczas gdy te, które tego nie robią, dają niebieskie kolonie. Ta metoda jest określana jako niebieskie i białe przesiewanie.
W większości eksperymentów transformacyjnych celem jest uzyskanie szybko dzielących się bakterii do wytworzenia dużych ilości plazmidu, który obejmuje gen docelowy. Po transformacji bakteryjnej kolejnym krokiem jest wyhodowanie dużych ilości bakterii w płynnym pożywce zawierającej antybiotyk i przeprowadzenie oczyszczania plazmidu, które, jak sama nazwa wskazuje, polega na oczyszczeniu plazmidów z bakterii. W tym celu dostępnych jest wiele zestawów komercyjnych.
Czasami celem transformacji jest to, aby bakterie wytworzyły duże ilości białka kodowanego przez plazmid. Tutaj widzisz, jak komórki bakteryjne są homogenizowane i poddawane lizie, zanim będzie można przeprowadzić technikę zwaną oczyszczaniem powinowactwa w celu wyizolowania docelowego białka. Po oczyszczeniu dużych ilości białka można je następnie skrystalizować i zidentyfikować strukturę konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Właśnie obejrzałeś JoVE Wprowadzenie do transformacji szoku cieplnego. W tym filmie omówiliśmy: czym jest transformacja szoku cieplnego i jak działa, jaka jest jej zasada i jak skutecznie przekształcić bakterie. Dzięki za oglądanie!
Transformacja bakteryjna jest szeroko stosowaną metodą, w której obce DNA jest wprowadzane do bakterii, która może następnie amplifikować lub klonować DNA. Komórki, które mają zdolność łatwego wchłaniania tego DNA, nazywane są komórkami kompetentnymi. Chociaż transformacja zachodzi naturalnie w wielu typach bakterii, naukowcy znaleźli sposoby na sztuczne wywołanie i zwiększenie kompetencji komórki bakteryjnej. W tym filmie porozmawiamy o jednym z tych sposobów, transformacji szoku cieplnego.
Zanim porozmawiamy o technice szoku cieplnego, omówmy najpierw rodzaj DNA najczęściej używany w transformacji bakteryjnej: plazmid. Plazmid to mały, okrągły, dwuniciowy DNA, który może zmniejszyć swój rozmiar poprzez superzwijanie, dzięki czemu może łatwo przejść przez pory w błonie komórkowej.
Plazmid zawiera kilka ważnych regionów, o których warto wspomnieć. Dostępne na rynku plazmidy zawierają wiele miejsc klonowania lub MCS. Region ten zawiera specyficzne sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne, które rozszczepiają DNA. Fragmenty DNA interesujące badacza mogą zostać wprowadzone do miejsca klonowania wielokrotnego, gdy plazmid i fragment DNA zostaną przecięte tymi samymi endonukleazami.
Plazmidy zawierają również początek replikacji lub ORI, który dostarcza komórce informacji o tym, gdzie powinna rozpocząć się replikacja plazmidu.
Oprócz pochodzenia replikacji i miejsca wielokrotnego klonowania, większość plazmidów będzie zawierać gen oporności na antybiotyki. Gen ten nadaje oporność na antybiotyki wszystkim komórkom zawierającym plazmid, umożliwiając tym komórkom przetrwanie w pożywce zawierającej antybiotyki.
Teraz, gdy omówiliśmy plazmidy, porozmawiajmy o komórkach, do których zostaną wprowadzone: kompetentne komórki. Najczęściej stosowanym typem bakterii w badaniach i transformacji biologii molekularnej jest E. coli, która zamieszkuje również dolne jelito. Komórki są zazwyczaj kompetentne poprzez wystawienie na działanie środowiska bogatego w wapń.
Dodatnie ładunki jonów wapnia neutralizują ładunki ujemne zarówno plazmidu, jak i ściany komórkowej bakterii, rozpraszając odpychanie elektrostatyczne i osłabiając ścianę komórkową.
Wystawiając komórki na nagły wzrost temperatury lub szok cieplny, powstaje różnica ciśnień między zewnętrzem a wnętrzem komórki, która indukuje tworzenie się porów, przez które może dostać się superskręcone plazmidowe DNA. Po przywróceniu komórek do bardziej normalnej temperatury, ściana komórkowa samosię naprawi.
Gdy komórki wchłoną plazmid, będą mogły rosnąć na płytkach agarowych z dodatkiem antybiotyku.
Przed rozpoczęciem transformacji szoku cieplnego oczyść obszar roboczy i upewnij się, że cały sprzęt jest wysterylizowany.
Upewnij się, że masz przygotowaną wystarczającą ilość pożywki i agaru, które zapewniają pożywienie bakteriom, które sprawisz, że będą kompetentne. Pamiętaj również, aby wysterylizować wszystkie roztwory za pomocą autoklawowania. Przed użyciem pozwól płynnemu pożywce ostygnąć do temperatury pokojowej i pozwól agarowi ostygnąć do 50-55°C, temperatury, w której można dodać antybiotyk i wlać płytki. Pozwól płytkom ostygnąć do temperatury pokojowej w celu zestalenia się.
Podczas pracy z bakteriami należy zawsze stosować technikę aseptyczną, aby zachować sterylność. Technika aseptyczna zazwyczaj polega na użyciu palnika Bunsena do sterylizacji narzędzi i odczynników oraz wytworzenia prądu konwekcyjnego, który utrzymuje zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu z dala od miejsca pracy.
Bezpośrednio przed reakcją szoku cieplnego należy podgrzać pożywkę do temperatury pokojowej, a płytki agarowe LB zawierające antybiotyki do 37°C. Upewnij się również, że kąpiel wodna ma temperaturę 42°C.
Następnie rozmrozić chemicznie kompetentne komórki na lodzie.
Dodaj 1-5 uL zimnego plazmidu 1ng / μL do komórek bakteryjnych, delikatnie wymieszaj i zwróć mieszaninę komórek i plazmidów do lodu na 30 minut.
Po upływie czasu należy poddać szok cieplny mieszaninie komórek i plazmidów, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 42°C na 30 sekund.
Natychmiast po wyjęciu probówki z łaźni wodnej należy wyłożyć ją na lód i dodać 450 μl pożywki. Umieść go w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C na 1 godzinę z prędkością ponad 225 obr./min, aby komórki mogły się zregenerować.
Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, dodaj 20-200 uL bakterii do płytki agarowej LB i rozprowadź podłoże za pomocą rozsiewacza bakteryjnego. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37°C do góry nogami, aby zapobiec narażeniu bakterii na kondensację.
Następnego dnia bakterie, które przyjęły plazmid, tworzą kolonie.
Następnie policz kolonie, aby obliczyć wydajność transformacji, czyli liczbę udanych transformantów podzieloną przez całkowitą ilość platerowanego DNA.
Teraz kolonie można wybrać do dalszych eksperymentów.
Przed uzyskaniem kompetencji bakterie użyte w transformacji są przechowywane w zamrażarce. Muszą być rozmrożone na lodzie, rozprowadzone na płycie agarowej – bez antybiotyków i pozostawione do wzrostu przez noc w temperaturze 37°C.
Stosując technikę aseptyczną, wybierz kolonię bakteryjną z płytki agarowej i hoduj ją w dużej kulturze o pojemności 500 ml przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem – urządzeniu, które zapobiega sedymentacji bakterii, a nawet rozprzestrzenianiu się składników odżywczych w pożywce.
Podczas wzrostu komórek przygotuj 0,1 molowego chlorku wapnia i 0,1 molowego chlorku wapnia plus 15% roztworów glicerolu, autoklaw i ostudź.
Pomiary absorbancji służą do określenia, czy bakterie znajdują się w środkowej fazie wzrostu, co oznacza, że łatwo wchłoną DNA. Gdy komórki osiągną tę fazę, umieść je na lodzie i trzymaj tam przez cały zabieg.
Następnie rozdzielić komórki bakteryjne do dwóch dużych probówek wirówkowych i odwirować w temperaturze 4°C. Odlać supernatant i ponownie zawiesić w około 100 ml 0,1 mola zimnego chlorku wapnia. Następnie inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut. Ten krok jest powtarzany co najmniej jeszcze raz. Cykle wirowania i ponownego zawieszania komórek są często określane jako mycie komórek.
Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w zimnym 50 ml 0,1 molowego roztworu chlorku wapnia plus 15% roztworu glicerolu. Komórki te są teraz kompetentne chemicznie.
Rozprowadź 50 μl bakterii w wielu probówkach do mikrofuge i przechowuj w temperaturze -80°C, aż będziesz gotowy na szok termiczny.
Istnieje wiele zastosowań i wariantów transformacji bakteryjnej.
Oprócz szoku cieplnego, eletroporacja jest inną powszechną techniką transformacji. Jak sama nazwa wskazuje, elektroporacja polega na wykorzystaniu energii elektrycznej do tworzenia porów w błonie komórkowej bakterii, przez które może przejść DNA.
Jeśli chodzi o badania przesiewowe w kierunku transformowanych bakterii, plazmidy często zawierają gen kodujący enzym beta-galaktozydazę, który pomaga w badaniach przesiewowych. Gdy substrat dla tego enzymu jest zawarty w płytkach agarowych, bakterie, które zostały przekształcone za pomocą plazmidów zawierających wkładkę, dają białe kolonie, podczas gdy te, które tego nie robią, dają niebieskie kolonie. Ta metoda jest określana jako niebieskie i białe przesiewanie.
W większości eksperymentów transformacyjnych celem jest uzyskanie szybko dzielących się bakterii do wytworzenia dużych ilości plazmidu, który obejmuje gen docelowy. Po transformacji bakteryjnej kolejnym krokiem jest wyhodowanie dużych ilości bakterii w płynnym pożywce zawierającej antybiotyk i przeprowadzenie oczyszczania plazmidu, które, jak sama nazwa wskazuje, polega na oczyszczeniu plazmidów z bakterii. W tym celu dostępnych jest wiele zestawów komercyjnych.
Czasami celem transformacji jest to, aby bakterie wytworzyły duże ilości białka kodowanego przez plazmid. Tutaj widzisz, jak komórki bakteryjne są homogenizowane i poddawane lizie, zanim będzie można przeprowadzić technikę zwaną oczyszczaniem powinowactwa w celu wyizolowania docelowego białka. Po oczyszczeniu dużych ilości białka można je następnie skrystalizować i zidentyfikować strukturę konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Właśnie obejrzałeś JoVE Wprowadzenie do transformacji szoku cieplnego. W tym filmie omówiliśmy: czym jest transformacja szoku cieplnego i jak działa, jaka jest jej zasada i jak skutecznie przekształcić bakterie. Dzięki za oglądanie!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:50
Basic Principles of Heat Shock Transformation
3:34
The Heat Shock Reaction
6:26
Preparing Competent Cells
8:38
Applications
10:36
Summary
Videos from this collection: