Name: Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę wymiany genów w szczepach Δku80 Toxoplasma gondii z wykorzystaniem rekombinacji homologicznej i markera HXGPRT. Protokół umożliwia precyzyjną analizę genomową i tworzenie szczepów genetycznie zdefiniowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z NIH dla DJB (AI041930, AI073142, AI075931 i AI091461).

<ol><li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5%27-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li>
<li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+model+apicomplexan%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li>
<li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToxoDB%3A+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+research%22%5BJournal%5D)">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma%3A+the+next+100+years%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li>
<li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).</li>
<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
<li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li>
<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
<li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li>
<li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li>
<li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+%27intracellular%27+buffer+increases+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li>
<li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+%28TgAMA1%29+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznego celowania w geny w szczepach pasożytów Δku80 , aby umożliwić skuteczne odzyskiwanie genetycznie zmodyfikowanego potomstwa, które posiada docelowe delecje genów, wymianę genów i/lub oznakowane geny. Sekwencyjne wykonywanie tych metod zapewnia wiarygodne podejście do izolacji mutantów pasożytów, które zawierają jedną lub wiele ukierunkowanych manipulacji genetycznych1-3. Podczas gdy generowanie docelowej delecji zależy od wielu czynników, zastosowanie szczepu Δku80 z przedstawioną strategią i protokołem znacznie zwiększa wydajność i łatwość tworzenia precyzyjnie zdefiniowanych zmutowanych szczepów T. gondii do funkcjonalnych badań genomicznych.
Genom T. gondii w stadiach bezpłciowych jest haploidalny. W związku z tym planując usunięcie genu, należy wziąć pod uwagę, że gen nie może być niezbędny in vitro. Niemniej jednak skuteczność celowania w nokauty genów w szczepach Δku80 jest niezwykle wysoka, co umożliwia izolację zmutowanych szczepów o znacznie upośledzonych szybkościach replikacji. Jeśli docelowy gen jest niezbędny, pasożyty często przestają się replikować podczas selekcji. Innym krytycznym czynnikiem w ukierunkowanej manipulacji genetycznej jest to, że do uzyskania wykrywalnych celowanych integracji wymaganych jest doskonała homologia z co najmniej 620 pz genomowego bokucelowania2. Dłuższe obszary homologii zapewniają wyższą skuteczność celowania, a użycie docelowych boków DNA o długości około 1000 pz jest niezawodnym i wydajnym podejściem1-4. Z tego powodu ważne jest, aby boki ukierunkowane genomowo były generowane z tego samego szczepu T. gondii (RH, Pru), co szczep, który jest poddawany manipulacji genetycznej. Brak wystarczającej homologii może często prowadzić do ukierunkowanej integracji jednej flanki genomowej, ale nie drugiej. Niepełna integracja lub niepowodzenie w uzyskaniu nokautu może być również spowodowane utrzymywaniem się epizodycznie. Bezpośrednio po transfekcji wszystkie cząsteczki docelowe są niezintegrowanymi episomami, a czasami cząsteczki celujące mogą utrzymywać się jako episomy przez wiele pokoleń. Użycie docelowych boków DNA o wartości ~1 Kbp i kontynuowanie przenoszenia pasożytów podczas selekcji przed ponownym subklonowaniem często rozwiązuje problemy związane z trwałością episomalną.
Po walidacji nokautu i usunięciu markera HXGPRT, strategię celowania w gen można powtórzyć na drugim GOI, aby wygenerować wiele delecji genów w jednym szczepie pasożyta1-3. Generowanie delecji, zamienników lub znakowanych genów można również osiągnąć przy użyciu różnych selektywnych markerów (bleomycyna, CAT, DHFR oporny na pirymetaminę itp.). Chociaż marker selektywny CAT jest obecnie obecny w genomie1 typu II Δku80 Pru, marker ten można usunąć za pomocą opisanego tutaj protokołu selekcji HXGPRT. W naszych rękach selekcja HXGPRT jest najbezpieczniejszym i najbardziej wydajnym markerem o najwyższej skuteczności celowania, w którym ukierunkowana insercja z pojedynczą kopią jest wystarczająca do solidnej selekcji w pożywce MPA + X. HXGPRT zapewnia również jedyne obecnie użyteczne podejście do celowanej delecji wybieralnego markera (Figura 3) przy użyciu selekcji 6-tioksantyny (6TX)2,3. W związku z tym protokół ten stanowi jedyne aktualne podejście do opracowywania zdefiniowanych zmutowanych szczepów z kilkoma ukierunkowanymi manipulacjami genetycznymi.
Protokół ten stanowi cenną i skuteczną metodę ukierunkowanej manipulacji genetycznej w szczepach Δku80 Toxoplasma gondii i ma zastosowanie do analizy pojedynczego genu, rodziny genów lub funkcjonalnych badań genomowych całego genomu. Przed udostępnieniem szczepów Δku80 1,2 podejścia te nie były powszechnie wykonalne ze względu na nieskuteczność tych metod. W związku z tym protokół ten ma szerokie zastosowanie w ukierunkowanej manipulacji genetycznej Toxoplasma gondii i jest dostępny dla wszystkich badaczy zainteresowanych odpowiedzią na szereg pytań dotyczących biologii pasożytów, odpowiedzi gospodarza i genomiki funkcjonalnej.

Toxoplasma gondii to powszechny wewnątrzkomórkowy pasożyt pierwotniakowy, który często i chronicznie infekuje szeroką gamę zwierząt i ludzi5. Szacuje się, że ponad 1 miliard ludzi jest obecnie i przewlekle zarażonych tym patogenem. Oprócz znaczenia choroby wywoływanej przez zakażenie T. gondii, rosnąca dostępność narzędzi eksperymentalnych, potężne zasoby genomiczne6, łatwość hodowli in vitro i doskonałe modele myszy sprawiły, że T. gondii stał się wiodącym systemem modelowym do szerszego badania wewnątrzkomórkowych patogenów eukariotycznych i innych znaczących pasożytów apikompleksanowych, które powodują wyniszczające choroby, takie jak malaria (Plasmodium sp.) i kryptosporydioza (Cryptosporidium)5,7. Istotnym ograniczeniem Toxoplasma gondii jako organizmu modelowego jest nieefektywne odzyskiwanie potomstwa, które jest nosicielem ukierunkowanych manipulacji genetycznych. Ten problem w celowaniu genów wynika z niskiej częstości rekombinacji homologicznej w porównaniu z bardzo wysoką częstością rekombinacji niehomologicznej w dzikich szczepach T. gondii, nawet gdy w docelowych cząsteczkach DNA stosowanych w badaniach genetycznych zapewniona jest rozległa homologia DNA2.
Niedawno genetycznie zablokowaliśmy główny szlak niehomologicznej rekombinacji w szczepach Toxoplasma gondii typu I i II, usuwając gen kodujący białko KU801,2. Powstałe szczepy Δku80 typu I i typu II wykazują normalne tempo wzrostu, wielkość i zachowanie zarówno in vitro, jak i in vivo podczas etapów tachyzoitu i bradyzoitu in vitro i in vivo, jednak szczepy te wykazują zasadniczo 100% częstość rekombinacji homologicznej, a ten fenotyp zwiększa prawdopodobieństwo szybkiego wyizolowania pożądanego potomstwa ukierunkowanych manipulacji genetycznych o kilkaset do kilku tysięcy razy1,2,4. Niedawne zastosowanie w całej społeczności szczepów Δku80 typu I i II znacznie zwiększyło tempo, różnorodność, a także wskaźnik sukcesu ukierunkowanych podejść genetycznych u T. gondii1-4,8-13. Tutaj opisujemy kompleksowy protokół celowanej delecji genów, wymiany genów i znakowania genów w szczepach Δku80 T. gondii. Pokazujemy, jak projektować i niezawodnie kierować manipulacje genetyczne do określonych genów lub loci genetycznych w szczepach Δku80 Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>Overlap Primers</td><td>Zintegrowane technologie DNA 4</td><td></td><td>nmole Ultramer DNA oligonukleoty</td></tr><tr><td>Walidacja Startery</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>100 nmole DNA Oligo</td></tr><tr><td>Szczep drożdży #90845</td><td>Oznaczenie ATCC</td><td></td><td>FY834</td></tr><tr><td>Shuttle Vector pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>Rosół SOC w zestawie z E. coli</td></tr> <tr><td>Bufor do resuspensji</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Bufor P1 w QIAprep Spin Miniprep</td></tr><tr><td>Kit Zestaw miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep Spin Miniprep</td></tr><tr><td>Kit Szklane koraliki</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-BG05</td><td>0,5 mm myta kwasem</td></tr><tr><td>zautomatyzowana zrobotyzowana stacja robocza Qiacube</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator BTX600</td> z odstępem 2 mm <td>Zestaw BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>25 cm2 Kolba uszczelniająca z zatyczką z przechyloną szyjką</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Kolba uszczelniająca z przechyloną szyjką</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki fibroblastów napletka (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt filtra Swin-lok Whatman</td><td></td><td>420200</td> Membrana o <td>średnicy 25 mm</td></tr><tr><td></td><td>Whatman</td><td>110612</td><td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm wielkość porów, średnica 25 mm</td></tr><tr><td>Kwas mykofenolowy (MPA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xanthine (X)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa taca do hodowli tkankowych</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa taca do hodowli tkankowych</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle Media</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicza (anty-anty)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wirująca</td><td>Primm Labs</td><td>PAE-100</td><td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-tioksantyna</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue DNA Minikit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td></tr><tr><td>Pożywka do zamrażania/odzyskiwania kultur komórkowych</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>Hycon</td> <td>soli fizjologicznej buforowany fosforanami</td><td>SH30028,02</td><td>minus wapń, minus magensium</td></tr></tbody></table>

manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Ukierunkowana manipulacja genetyczna za pomocą rekombinacji homologicznej jest metodą z wyboru do funkcjonalnej analizy genomowej w celu uzyskania szczegółowego obrazu funkcji genu i fenotypu. Rozwój zmutowanych szczepów z celowanymi delecjami genów, ukierunkowanymi mutacjami, uzupełnioną funkcją genów i/lub znakowanymi genami zapewnia potężne strategie radzenia sobie z funkcją genów, szczególnie jeśli te manipulacje genetyczne mogą być skutecznie ukierunkowane na locus genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą integracji, w której pośredniczy podwójna krzyżowa rekombinacja homologiczna.
Ze względu na bardzo wysokie wskaźniki rekombinacji niehomologicznej, funkcjonalna analiza genomowa Toxoplasma gondii była wcześniej ograniczona przez brak skutecznych metod celowania w delecje genów i zamianę genów na określone loci genetyczne. Niedawno znieśliśmy główny szlak rekombinacji niehomologicznej w szczepach T. gondii typu I i typu II poprzez usunięcie genu kodującego białkoKU80 1,2. Szczepy Δku80 zachowują się normalnie w stadiach tachyzoitu (ostrego) i bradyzoitu (przewlekłego) in vitro i in vivo i wykazują zasadniczo 100% częstość rekombinacji homologicznej. Szczepy Δku80 umożliwiają funkcjonalne badania genomiczne zarówno na pojedynczym genie, jak i w skaligenomu 1-4.
Tutaj opisujemy metody wykorzystania szczepów Δku80Δhxgprt typu I i II do rozwoju metod celowania genów u T. gondii. Przedstawiamy skuteczne metody generowania delecji genów, wymiany genów i znakowanych genów poprzez ukierunkowaną insercję lub delecję markera selekcji fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-ksantynowo-guaninowej (HXGPRT). Opisany protokół celowania genów może być stosowany na wiele sposobów w szczepach Δku80 w celu przyspieszenia analizy funkcjonalnej genomu pasożyta i opracowania pojedynczych szczepów, które są nosicielami wielu ukierunkowanych manipulacji genetycznych. Zastosowanie tej metody genetycznej i późniejszych testów fenotypowych ujawni fundamentalne i unikalne aspekty biologii T. gondii i powiązanych z nim istotnych ludzkich patogenów, które powodują malarię (Plasmodium sp.) i kryptosporydiozę (Cryptosporidium).

Przedstawiono szczegółowy szablon konstrukcji plazmidu celującego służącego do delecji genu, obejmujący rozmieszczenie miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych oraz projektowanie starterów ułatwiających celowanie genetyczne i walidację delecji genu, a także konstrukcję plazmidu do późniejszej delecji HXGPRT w procesie jednokrokowym (Rysunki 1A-C, Rysunek 2A, Rysunek 3A). Zaprezentowano ogólny schemat wykonywania celowanej delecji genu (Rysunek 2A), pary starterów wykorzystywane do walidacji nokautu, na przykład typu I rop18 (Rysunek 2B) oraz reprezentatywne wyniki walidacji metodą PCR (Rysunek 2C). Reprezentatywny wynik ten służy zilustrowaniu zakresu rezultatów, jakie można uzyskać w przypadku loci genetycznych, które są stosunkowo trudne do celowania. Pomyślnie przeprowadzona celowana delecja genu objawi się brakiem produktu PCR dla badanego genu (PCR 1), obecnością 3' flanki celowania genomicznego (PCR 2) oraz obecnością markera selekcyjnego HXGPRT prawidłowo zintegrowanego pomiędzy 5' a 3' flankami celowania genomicznego definiującymi delecję (PCR 3 i PCR 4). Klony 3, 4, 5, 6, 8, 9 i 11 są zwalidowanymi celowanymi delecjami genów (nokautami), w których HXGPRT zastąpił badany gen (Rysunek 2C).
Klon, który nie zawiera delecji genu, może być reprezentowany przez różne wzory prążkowania. Typowo klon bez delecji genu odzwierciedla szczep rodzicielski (wzór rodzicielski) z prążkami widocznymi dla PCR1 i PCR2, ale nie dla PCR3 lub PCR4, co widać w przypadku klonów 1 i 2 (Rysunek 2C). Ten „wzór rodzicielski” wynika z kilku potencjalnych mechanizmów. Sporadycznie wyselekcjonowane pasożyty oporne na MPA przenoszą niezlączone, utrzymujące się episomy plazmidu celującego pΔGOI; zauważamy, że dalsza selekcja często wymusza integrację tych episomów. Obserwujemy również rzadkie tło w szczepie typu I Δku80 z powodu niezamierzonej integracji plazmidu celującego pΔGOI, który zawiera cDNA HXGPRT ekspresyjne poprzez elementy promotora 5' i 3' DHFR, albo w locus DHFR, albo w częściowo usuniętym locus HXGPRT14. Choć to rzadkie zdarzenie jest integracją celowaną, nie była ona zamierzona i stanowi kluczowy punkt do zapamiętania przy projektowaniu każdej strategii wymiany genu. Homologia DNA większa niż 120 bp zawarta w plazmidzie celującym pΔGOI może dostarczyć alternatywnego miejsca rekombinacji w szczepach Δku802, co może prowadzić do powstania niepożądanego tła. W szczepie typu II Pru Δku80 tło to jest zredukowane lub nieobecne w porównaniu z typem I, ponieważ marker selekcyjny HXGPRT oparty jest na sekwencjach typu I, które wykazują polimorfizmy nukleotydowe w porównaniu z DNA typu II, co znacznie zmniejsza to rzadkie tło w eksperymentach z wykorzystaniem szczepu typu II Pru Δku801. Jeśli locus genu jest niezbędny (nie może zostać usunięty), wykazuje ekstremalnie niską częstotliwość celowania w locus, lub jeśli utrzymujące się [niezlączone] episomy nie są łatwo eliminowane poprzez wzrost i selekcję, wzór rodzicielski będzie dominował nad wzorem obserwowanym w klonach opornych na MPA. Alternatywnie, czasami obserwuje się integrację cząsteczki DNA celującego tylko w obrębie 5' lub 3' flanki genomowej i prążek jest widoczny dla PCR3 lub PCR4 (ale nie dla obu) wraz z PCR1 i PCR2, co widać w przypadku klonu 10 (integracja 5') i klonu 7 (integracja 3') (Rysunek 2C). Wzory te sugerują rzadkie występowanie pojedynczego crossoveru integracji plazmidu celującego w locus, który integruje HXGPRT, ale ta integracja celowana nie usuwa genu zainteresowania. Ten wzór (ścieżki 7 i 10 na Rysunku 2C) podkreśla konieczność raportowania danych PCR w celu weryfikacji, czy nastąpiła integracja celowana, a nie pojedynczy homologiczny crossover i druga niehomologiczna integracja cząsteczki celującej. Rzadko obserwujemy mieszaninę genetyczną reprezentowaną przez klon 12 (Rysunek 2C), która wykazuje zarówno wzór rodzicielski, jak i wzór delecji celowanej. Ten wzór najprawdopodobniej wynika sporadycznie z obecności dwóch genotypów pasożytów w tym samym miejscu w studzience klonowania.
Ogólny schemat usuwania HXGPRT z Δku80Δgoi::HXGPRT w celu usunięcia HXGPRT ze szczepu został przedstawiony (Rysunek 3A). Para starterów użyta do walidacji usunięcia HXGPRT z Δku80Δgra2::HXGPRT (Rysunek 3B)) amplifikuje unikalny prążek o wielkości ~1.2 Kbp w PCR5, co widać w klonach 4, 7, 9, 11 i 12 (Rysunek 3C). Jeśli HXGPRT nie zostanie usunięty z locus, obserwuje się prążek ~3.4 Kbp (klony 1, 2, 3, 6, 8, 10 oraz kontrola rodzicielska). Kilka mechanizmów sprawia, że usuwanie HXGPRT (selekcja 6TX) jest trudniejsze i mniej wydajne niż integracja HXGPRT (selekcja MPA + X). Selekcja MPA jest po prostu bardziej wydajna niż selekcja 6TX14,16. Ponadto do selekcji 6TX wymagane są wyższe poziomy ekspresji HXGPRT niż do selekcji MPA16,24. W konsekwencji mutacje, które mogą obniżyć aktywność enzymatyczną HXGPRT, lub mutacje bądź zmiany epigenetyczne obniżające poziom ekspresji HXGPRT w locus genu, mogą potencjalnie znieść skuteczność selekcji 6TX. Mimo tych trudności związanych z selekcją 6TX, wskaźnik sukcesu selekcji 6TX w szczepach Δku80 wynosi ponad 90% przy pierwszej próbie1-3.
Ogólny schemat bezpośredniego znakowania C-końca genów kodujących białka przedstawiono na (Rysunku 4). Schemat ten wykorzystuje bezpośrednią integrację poprzez podwójną rekombinację homologiczną z krzyżowaniem w obrębie 3' genu znakowanego z HXGPRT, a także stosuje strategie walidacji podobne do opisanych powyżej. W przypadku podejrzenia, że gen jest genem niezbędnym, można to zweryfikować za pomocą drugiej transfekcji z niezależnie wyizolowanym plazmidem DNA celującego. W celu dalszej weryfikacji, czy gen jest niezbędny, dostępne są alternatywne metody, takie jak schematy regulowanej ekspresji genów25.
<img alt="Schemat edycji genów z plazmidem pRS416, genem HxGPRT, starterami i tabelą sekwencji do analizy PCR." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd projektu plazmidu z DNA celującym. A. Schemat projektowania starterów z nakładkami stosowanych do amplifikacji PCR flanki 5' i 3' celu z 33 pb nakładkami dla wektora wahadłowego pRS416 i kasety minigenu HXGPRT. Startery przedstawione na schemacie posłużyły do wygenerowania flanki 5' i 3' celu dla pΔROP1810. B. Ogólna strategia projektowania cząsteczki DNA celującego. Szkieletem pΔGOI jest wektor wahadłowy pRS416 zawierający markery selekcyjne uracylu (URA) i ampicyliny (AMP). Do pRS416 wstawiona jest flanka 5' DNA celu o długości ~1 Kbp amplifikowana z DNA genomowego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów F1 i R1, flanka 3' DNA celu o długości ~1 Kbp amplifikowana z DNA genomowego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów F2 i R2 oraz kaseta minigenu HXGPRT. Do starterów dodano następujące unikalne miejsca cięcia enzymów restrykcyjnych: RE.X (miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego X) w starterze F1 w celu przecięcia plazmidu na końcu 5' flanki 5' DNA celu, RE.Y w starterze R2 w celu przecięcia plazmidu na końcu 3' flanki 3' DNA celu oraz RE.Z w starterach R1 i F2 w celu wycięcia kasety minigenu HXGPRT. C. Sekwencje starterów użytych do wygenerowania konstruktu celującego do delecji rop18. Regiony pogrubione odpowiadają sekwencji genomowej T. gondii, a regiony niepogrubione odpowiadają miejscom cięcia enzymów restrykcyjnych i sekwencjom nakładającym się na pRS416 i kasetę minigenu HXGPRT. Para starterów HX_F i HX_R amplifikuje kasetę minigenu HXGPRT14. Startery odczytane od 5' do 3'. Tabela zaadaptowana z Fentress et al10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek</a>.
<img alt="Schemat edycji genów z procesem PCR, starterami i wynikami elektroforezy żelowej dla analizy DNA." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przegląd protokołu delecji genu z wykorzystaniem HXGPRT. A. Przerwanie GOI w szczepie Δku80Δhxgprt poprzez zdarzenie podwójnej homolologicznej rekombinacji krzyżowej z użyciem ok. 1 Kbp 5' flankującego fragmentu DNA celu i ok. 1 Kbp 3' flankującego fragmentu DNA celu na plazmidzie pΔGOI. Przedstawiono strategię PCR z użyciem PCR1, PCR2, PCR3 i PCR4 (nie w skali), która umożliwia weryfikację genotypu w celu walidacji klonów z ukierunkowaną integracją HXGPRT i delecją locus GOI. B. Reprezentatywne pary starterów zaprojektowane w celu walidacji delecji rop18. ROP18_DF i ROP18_DR amplifikują PCR1, ROP18_ExF i ROP18_CxR amplifikują PCR2, ROP18_CxF i DHFR_CxR amplifikują PCR3, a DHFR_CxF i ROP18_CxR amplifikują PCR4 (patrz Rycina 2A). Startery odczytane od 5' do 3'. Tabela zaadaptowana z Fentress et al10. C. Reprezentatywne wyniki walidacji ukierunkowanej delecji genu (rop18) z wykorzystaniem HXGPRT. Po transfekcji plazmidu pΔROP18 do Δku80Δhxgprt i selekcji w MPA+X, klony oporne na MPA+X poddano badaniu w kierunku delecji rop18. Kontrolny szczep rodzicielski jest dodatni dla produktów PCR 1(~400 bp) i PCR 2 (~650 bp) oraz ujemny dla produktów PCR 3 (~1 200 bp) i PCR 4 (~1 300 bp). Ukierunkowany knockout GOI jest dodatni dla produktów PCR2, PCR3 i PCR4 oraz ujemny dla produktu PCR 1 (patrz Rycina 2A). Przedstawiono reprezentatywne panele wyników PCR1 i PCR2 (panel górny), PCR3 (panel środkowy) i PCR4 (panel dolny). Klony 3, 4, 5, 6, 8, 9 i 11 wykazują prawidłowy wzór prążków dla PCR 1, PCR2, PCR3 i PCR4, co definiuje zdarzenie ukierunkowanej delecji genu w klonie. Klony 1, 2, 7, 10 i 12 nie są delecjami genowymi i odpowiadają innym potencjalnym reprezentatywnym wynikom. (C = kontrolny szczep rodzicielski Δku80Δhxgprt, M = markery wielkości). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Schemat procesu modyfikacji genetycznej z PCR, sekwencjami flankującymi i wynikami elektroforezy żelowej." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przegląd protokołu ponownego celowania genu zainteresowania w celu usunięcia HXGPRT. A. Strategia usunięcia markera selekcyjnego HXGPRT poprzez zdarzenie podwójnej homologicznej rekombinacji krzyżowej w szczepie Δku80Δgoi::HXGPRT przy użyciu flanki 5' docelowego DNA o długości ~1 Kbp i flanki 3' docelowego DNA o długości ~1 Kbp na plazmidzie pΔGOIc. Strategia PCR dla weryfikacji genotypu jest przedstawiona z użyciem pary starterów do analizy produktu PCR (PCR5), który obejmuje delecję (nie w skali). B. Reprezentatywna para starterów zaprojektowana w celu walidacji usunięcia markera selekcyjnego HXGPRT z locus gra2 w szczepie Δku80Δgra2::HXGPRT. Startery GRA2 _CLF i GRA2_CxR amplifikują PCR5. Startery czytane są od 5' do 3'. C. Reprezentatywny panel klonów opornych na 6TX, które mogą zostać uzyskane po transfekcji plazmidu pΔGOIc do Δku80Δgoi::HXGPRT i selekcji w 6TX. Klony 4, 7, 9, 11 i 12 wykazują prawidłowy wzór prążków PCR5, który odpowiada celowanej delecji markera HXGPRT (produkt ~1.2 Kbp obejmujący flankę 3' z niewielkim nakładaniem na flankę 5' i poza flankę 3'). Klony 1, 2, 3, 6, 8 i 10 (ten prążek jest słaby) reprezentują oczekiwany wzór prążków o długości około ~3.4 Kbp, który odpowiada genotypowi klonu rodzicielskiego, mimo że klony te wykazały stopień oporności na 6TX, który umożliwił ich selekcję (fenotyp ten może sporadycznie pojawić się spontanicznie w wyniku wyciszenia ekspresji HXGPRT (patrz uwaga w protokole 2.1 (krok 8) i sekcja Reprezentatywne Wyniki). (C = rodzicielski szczep kontrolny Δku80Δgoi::HXGPRT, M = markery wielkości). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Schemat procesu edycji genów z integracją GOI przy użyciu strategii selekcji HXGPRT i MPA." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Projekt cząsteczki DNA celującego w celu oznakowania końca C-terminalnego białka. Strategia opiera się na zdolności markera HXGPRT do pełnienia funkcji 3' regulatorowego regionu downstream. Szkielet pΔGOItag stanowi wektor wahadłowy pRS416 zawierający markery selekcyjne uracylu (URA) i ampicyliny (AMP). Do pRS416 wstawiono flankujący fragment DNA 5' o długości ~1 Kbp, namnożony z DNA genomicznego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów Fgoi i Rtag; flankujący fragment DNA 3' o długości ~1 Kbp jest namnażany z DNA genomicznego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów F2 i R2 oraz kasety minigenu HXGPRT. Flankujący fragment DNA 5' zastępuje kodon stop znacznikiem (HA, Myc, His itd.), po którym następuje zastępczy kodon stop. Selekcja MPA + X integruje znacznik C-terminalny oraz downstream HXGPRT i przesuwa 3' UTR na pozycję następującą po markerze HXGPRT. Do starterów dodano następujące unikalne miejsca cięcia enzymów restrykcyjnych: RE.X (miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego X) w starterze Fgoi, aby przeciąć plazmid na końcu 5' flankującego fragmentu DNA 5', RE.Y w starterze R2, aby przeciąć plazmid na końcu 3' flankującego fragmentu DNA 3', oraz RE.Z w starterach Rtag i F2, aby wyciąć kasetę minigenu HXGPRT do wykorzystania w konstrukcji plazmidu w celu ponownego celowania w locus genu z znacznikiem, aby usunąć marker HXGPRT, co przywróci pierwotne położenie 3' UTR.

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajna i niezawodna wymiana genów z wykorzystaniem szczepów typu pierwszego i drugiego delta dwa 80 Toxoplasmic ndii. Osiąga się to poprzez konstrukcję cząsteczki DNA celującego, która łączy marker selekcyjny HX GPRT w orientacji prostej pomiędzy odrębnymi flankami DNA celującego 5' i 3'. Drugim krokiem procedury jest transfekcja cząsteczki DNA celującego do szczepu toxoplasma DYI typu pierwszego lub drugiego.Trzecim krokiem jest cierpliwa selekcja zdarzeń podwójnej rekombinacji homologicznej z wymianą krzyżową oraz izolacja poszczególnych klonów. Ostatnim etapem jest walidacja obecności zdarzenia celowanego targetowania genu w wyizolowanych klonach mutantów. W ostateczności wyniki tej procedury mogą ujawnić funkcję genów pasożyta poprzez analizę celowanych knockoutów genowych, zastąpień genów oraz genów z tagami z wykorzystaniem różnorodnych zastosowań w dalszych analizach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wykorzystującymi szczepy dzikie tego pasożyta jest fakt, że tła pasożytnicze typu pierwszego i typu drugiego delta dwa 80 umożliwiają obecnie niezwykle niezawodną selekcję ukierunkowanych zdarzeń podwójnego crossoveru podczas rekombinacji homologicznej w celu wytworzenia precyzyjnie zdefiniowanych genetycznie szczepów. Technika ta znacznie przyspieszy odkrywanie nowych celów dla terapii lekami przeciwtoksycznymi oraz opracowanie bezpiecznych i skutecznych atenuowanych szczepów szczepionkowych, zwłaszcza w połączeniu z dobrze opracowanymi zasobami genomicznymi dostępnymi online pod adresem toxodb.org. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z projektowaniem ukierunkowanych cząsteczek DNA lub manipulacjami genetycznymi z Toxoplasma Gandhi.Niemniej jednak, cierpliwość badacza oraz projekt wiarygodnych cząsteczek celujących zapewnią sukces. Rozpocznij protokół od amplifikacji metodą PCR pięcioposobowych i trzypozobowych flank genomicznych dla interesującego genu z DNA genomicznego. Następnie przeprowadź amplifikację PCR znacznika selekcyjnego HX GPRT wraz z jego pięcioprymowymi i trzyprymowymi flankami DHFR z kasety minigenu HX GPRT CD NA.Wykorzystaj rekombinację drożdżową lub podobną metodę, aby połączyć cząsteczki 3D NA w prawidłowej orientacji od końca 5' do 3' z plazmidem PRS 416, generując w ten sposób plazmid p delta GOI, który będzie celować w delecję w genie zainteresowania. Następnie przygotuj próbkę o objętości 100 µL zawierającą od 15 do 30 µg zlinearyzowanego plazmidu celującego do transfekcji do T gia 68 do 72 godzin po zaszczepieniu kolby o średnicy 25 cm z konfluentnymi komórkami HFF. Zweryfikuj obecność świeżo lizeowanych pasożytów, potwierdzając wizualnie, że 90 do 95% komórek HFF uległo lizie; żywe pasożyty są niezbędne do celowania w geny.Wymieszaj żywe pasożyty z roztworem, energicznie wstrząsając zamkniętą kolbą, tak aby ciecz nie rozpryskała się na wewnętrzną stronę nakrętki lub szyjkę kolby. Zbierz pasożyty z kolby i przygotuj je do transfekcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przeprowadź elektroporację plazmidu celującego do szczepu Toxoplasma delta CO 80.Przenieś mieszaninę po elektroporacji do kolby o pojemności 150 cm², zawierającej konfluentne komórki HFF oraz 30 ml medium do infekcji. Inkubuj zainfekowaną kulturę przez noc w temperaturze 37°C, około 20 godzin po transfekcji. Wymień medium na medium selekcyjne MPA plus X.Następnie należy inkubować pasożyty w temperaturze 37 °C przez około osiem dni, nie niepokojąc ich. Po pojawieniu się plam (plaques), należy potrząsnąć kolbą, aby odseparować pasożyty pozakomórkowe od monowarstwy, tworząc zawiesinę pasożytów. Przenieś około 0,5 ml zawiesiny pasożytów do nowej kolby o pojemności 25 cm zawierającej konfluente komórki HFF w 5 ml pożywki selekcyjnej MPA plus X.Oznacz tę kulturę jako PAs one A około trzy dni później. Powtórz przeniesienie 0,5 ml roztworu pasożyta z oryginalnej kolby do innej kolby z komórkami HFF w tym samym medium selekcyjnym. Oznacz tę kulturę jako PAs one B w ciągu kolejnych pięciu dni.Monitoruj pierwsze przejście A i pierwsze przejście B pod kątem pfu. Wybierz pierwsze przejście A lub pierwsze przejście B do subklonowania na podstawie uzyskania odpowiedniej liczby stref infekcji, przekraczającej 25. W przypadku lizy komórek HFF przez pasożyty, przenieś kulturę do nowej kolby o rozmiarze 25 centymetrów z konfluencyjnymi komórkami HFF w podłożu selekcyjnym. Trzy tygodnie po transfekcji subklonuj świeżo zaszczepione pasożyty poprzez rozcieńczenie ich do odpowiedniego stężenia w podłożu MPA plus X, a następnie równomiernie rozprowadź roztwór pasożytów w płytce 96-dołkowej zawierającej konfluencyjne komórki HFF.Przygotuj jedną płytkę w stężeniu jednego pasożyta na dołek oraz drugą płytkę w stężeniu dwóch pasożytów na dołek. Inkubuj obie płytki w temperaturze 37 °C po dacie pierwotnej transfekcji. Nie przeprowadzaj subklonowania pasożytów przed 20. dniem dla pasożytów typu pierwszego lub przed 25. dniem dla pasożytów typu drugiego.Kontynuuj pasażowanie kolby o pojemności 25 centymetrów w cyklu tygodniowym, zgodnie z opisem w tekście online, aż do momentu walidacji szczepu z nokautem. Po około tygodniu oceń płytki 96-dołkowe pod powiększeniem od 40 do 60x. Wybierz wyłącznie te dołki, które zawierają pojedynczą PFU, zidentyfikowaną jako pojedyncza strefa infekcji, używając pipety ustawionej na 50 µL.Wymieszaj zawartość tych studzienek, kierując przepływ cieczy nad PFU, aby rozproszyć pasożyty w obrębie studzienki. Od czterech do pięciu dni po wymieszaniu wybranych studzienek, wybierz kilkanaście klonów z lizowanymi komórkami. Przenieś 12 klonów z tacki 96-dołkowej do 12 studzienek tacki 24-dołkowej. Zrób to, zeskrobując dno studzienki końcówką pipety i pobierając 6 µL.Przenieś roztwór do dołka płytki 24-dołkowej z konfluentnymi komórkami HFF w 1 mL pożywki MPA z dodatkiem selekcji X. Inkubuj płytkę 24-dołkową w temperaturze 37 °C i monitoruj lizę komórek HFF. Przesiewaj pasożyty z dołka, w którym nastąpiła liza, w cyklu tygodniowym.Zastosuj technikę rozrysowywania (scratch and draw), aby przenieść 2 µL roztworu pasożytów na nową płytkę z MPA i selekcją X. Po pasażu zbierz pasożyty z oryginalnej płytki 24-dołkowej i przenieś je do małych probówek w celu izolacji DNA.Na koniec należy przeprowadzić reakcję PCR w celu potwierdzenia delecji badanego genu, co pozwoli sprawdzić integrację flank docelowych 5' i 3'. Należy również sprawdzić obecność markera selekcyjnego HX GPRT. Niniejszy protokół dotyczy usunięcia markera HX GPRT ze zmodyfikowanego szczepu delta Q 80 i został opisany w tekście dostępnym online.P delta GOYC ma na celu usunięcie HX GPRT z pasożyta poprzez selekcję negatywną z wykorzystaniem sześciu mediów TX. Następnie stosuje się PCR, aby potwierdzić utratę HX GPRT; w przypadku, gdy HX GPRT nie został usunięty z locus, widoczny jest prążek o wielkości 1,2 kb. Pojawia się również prążek o wielkości 3,4 kb.Ostatnia część niniejszego protokołu, dotycząca znakowania białek na terminalu C, jest również szczegółowo opisana w tekście online; po wykonaniu opisanego protokołu w celu ukierunkowanego usunięcia genu, zastosowano metodę PCR w celu potwierdzenia delecji typu knockout genu R 18, który jest obszarem zazwyczaj trudnym do targetowania. Wynik PCR 1 wykazuje brak produktu PCR genu R 18.PCR 2 wykazuje obecność flanki genomicznej 3' R18; PCR 3 i PCR 4 wykazują obecność markera selekcyjnego prawidłowo zintegrowanego pomiędzy flankami genomicznymi 5' i 3', co definiuje delecję R18. Aby ponownie wykorzystać marker selekcyjny do wykonania kolejnych delecji w szczepie, pierwotny HX GPRT musi zostać najpierw usunięty z locus, zgodnie z opisanym protokołem.HX GPRT usunięto z locus GRA dwa w szczepie delta dwa 80 delta GRA dwa. Do potwierdzenia utraty HX GPRT wykorzystano HX.G-P-R-T-P-C-R, co objawiło się prążkiem o wielkości 1,2 kb. W przypadku braku usunięcia H-X-G-P-R-T, po początkowym etapie celowania w gen, widoczny był prążek o wielkości 3,4 kb. Dodatkowe metody celowania w geny można zastosować w celu stworzenia wielokrotnych knockoutów w tym samym szczepie typu pierwszego lub drugiego, lub w celu znakowania bądź komplementacji szczepu mutantowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: gdzie to białko lokalizuje się w komórce?Lub jaka jest kluczowa domena lub aktywność tego białka lub szlaku, która wyjaśnia jego funkcję biologiczną? Technika ta utorowała drogę badaczom w tej dziedzinie do zintensyfikowania eksploracji funkcji genów pasożytów w modelowym kompleksie AP i w pasożycie Toxoplasma. Gandhi eye.Należy pamiętać, że praca z toksoplazmą może być niebezpieczna, dlatego w trakcie całej procedury należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie wszystkich wytycznych BSL 2.

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do analizy funkcjonalnego genomu Toxoplasma gondii

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny skuteczności hamowania związków chemicznych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi in vitro Toxoplasma gondii za pomocą testu wzrostu opartego na lucyferazie. Technikę tę stosuje się w celu potwierdzenia swoistości inhibicji poprzez genetyczną delecję odpowiedniego genu docelowego. Jako przykład oceniane jest hamowanie LHVS wobec proteazy TgCPL.

Oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma Gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Przedstawiamy tutaj protokół służący do szybkiego identyfikowania i genotypowania szczepów Toxoplasma gondii za pomocą przenośnego sekwencjonowania nanoporami wybranych markerów genetycznych, umożliwiając skalowalną, ukierunkowaną identyfikację szczepów w izolatów hodowanych w laboratorium z potencjalnym przyszłym zastosowaniem w ustawieniach nadzorczych.

Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii

Poznaj metodę wymiany genów w szczepach Δku80 Toxoplasma gondii z wykorzystaniem rekombinacji homologicznej i markera HXGPRT. Protokół umożliwia precyzyjną analizę genomową i tworzenie szczepów genetycznie zdefiniowanych.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Przeglądaj więcej filmów