Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajna i niezawodna wymiana genów z wykorzystaniem szczepów typu pierwszego i drugiego delta dwa 80 Toxoplasmic ndii. Osiąga się to poprzez konstrukcję cząsteczki DNA celującego, która łączy marker selekcyjny HX GPRT w orientacji prostej pomiędzy odrębnymi flankami DNA celującego 5' i 3'. Drugim krokiem procedury jest transfekcja cząsteczki DNA celującego do szczepu toxoplasma DYI typu pierwszego lub drugiego.

Trzecim krokiem jest cierpliwa selekcja zdarzeń podwójnej rekombinacji homologicznej z wymianą krzyżową oraz izolacja poszczególnych klonów. Ostatnim etapem jest walidacja obecności zdarzenia celowanego targetowania genu w wyizolowanych klonach mutantów. W ostateczności wyniki tej procedury mogą ujawnić funkcję genów pasożyta poprzez analizę celowanych knockoutów genowych, zastąpień genów oraz genów z tagami z wykorzystaniem różnorodnych zastosowań w dalszych analizach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wykorzystującymi szczepy dzikie tego pasożyta jest fakt, że tła pasożytnicze typu pierwszego i typu drugiego delta dwa 80 umożliwiają obecnie niezwykle niezawodną selekcję ukierunkowanych zdarzeń podwójnego crossoveru podczas rekombinacji homologicznej w celu wytworzenia precyzyjnie zdefiniowanych genetycznie szczepów. Technika ta znacznie przyspieszy odkrywanie nowych celów dla terapii lekami przeciwtoksycznymi oraz opracowanie bezpiecznych i skutecznych atenuowanych szczepów szczepionkowych, zwłaszcza w połączeniu z dobrze opracowanymi zasobami genomicznymi dostępnymi online pod adresem toxodb.org. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z projektowaniem ukierunkowanych cząsteczek DNA lub manipulacjami genetycznymi z Toxoplasma Gandhi.

Niemniej jednak, cierpliwość badacza oraz projekt wiarygodnych cząsteczek celujących zapewnią sukces. Rozpocznij protokół od amplifikacji metodą PCR pięcioposobowych i trzypozobowych flank genomicznych dla interesującego genu z DNA genomicznego. Następnie przeprowadź amplifikację PCR znacznika selekcyjnego HX GPRT wraz z jego pięcioprymowymi i trzyprymowymi flankami DHFR z kasety minigenu HX GPRT CD NA.

Wykorzystaj rekombinację drożdżową lub podobną metodę, aby połączyć cząsteczki 3D NA w prawidłowej orientacji od końca 5' do 3' z plazmidem PRS 416, generując w ten sposób plazmid p delta GOI, który będzie celować w delecję w genie zainteresowania. Następnie przygotuj próbkę o objętości 100 µL zawierającą od 15 do 30 µg zlinearyzowanego plazmidu celującego do transfekcji do T gia 68 do 72 godzin po zaszczepieniu kolby o średnicy 25 cm z konfluentnymi komórkami HFF. Zweryfikuj obecność świeżo lizeowanych pasożytów, potwierdzając wizualnie, że 90 do 95% komórek HFF uległo lizie; żywe pasożyty są niezbędne do celowania w geny.

Wymieszaj żywe pasożyty z roztworem, energicznie wstrząsając zamkniętą kolbą, tak aby ciecz nie rozpryskała się na wewnętrzną stronę nakrętki lub szyjkę kolby. Zbierz pasożyty z kolby i przygotuj je do transfekcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przeprowadź elektroporację plazmidu celującego do szczepu Toxoplasma delta CO 80.

Przenieś mieszaninę po elektroporacji do kolby o pojemności 150 cm², zawierającej konfluentne komórki HFF oraz 30 ml medium do infekcji. Inkubuj zainfekowaną kulturę przez noc w temperaturze 37°C, około 20 godzin po transfekcji. Wymień medium na medium selekcyjne MPA plus X.

Następnie należy inkubować pasożyty w temperaturze 37 °C przez około osiem dni, nie niepokojąc ich. Po pojawieniu się plam (plaques), należy potrząsnąć kolbą, aby odseparować pasożyty pozakomórkowe od monowarstwy, tworząc zawiesinę pasożytów. Przenieś około 0,5 ml zawiesiny pasożytów do nowej kolby o pojemności 25 cm zawierającej konfluente komórki HFF w 5 ml pożywki selekcyjnej MPA plus X.

Oznacz tę kulturę jako PAs one A około trzy dni później. Powtórz przeniesienie 0,5 ml roztworu pasożyta z oryginalnej kolby do innej kolby z komórkami HFF w tym samym medium selekcyjnym. Oznacz tę kulturę jako PAs one B w ciągu kolejnych pięciu dni.

Monitoruj pierwsze przejście A i pierwsze przejście B pod kątem pfu. Wybierz pierwsze przejście A lub pierwsze przejście B do subklonowania na podstawie uzyskania odpowiedniej liczby stref infekcji, przekraczającej 25. W przypadku lizy komórek HFF przez pasożyty, przenieś kulturę do nowej kolby o rozmiarze 25 centymetrów z konfluencyjnymi komórkami HFF w podłożu selekcyjnym. Trzy tygodnie po transfekcji subklonuj świeżo zaszczepione pasożyty poprzez rozcieńczenie ich do odpowiedniego stężenia w podłożu MPA plus X, a następnie równomiernie rozprowadź roztwór pasożytów w płytce 96-dołkowej zawierającej konfluencyjne komórki HFF.

Przygotuj jedną płytkę w stężeniu jednego pasożyta na dołek oraz drugą płytkę w stężeniu dwóch pasożytów na dołek. Inkubuj obie płytki w temperaturze 37 °C po dacie pierwotnej transfekcji. Nie przeprowadzaj subklonowania pasożytów przed 20. dniem dla pasożytów typu pierwszego lub przed 25. dniem dla pasożytów typu drugiego.

Kontynuuj pasażowanie kolby o pojemności 25 centymetrów w cyklu tygodniowym, zgodnie z opisem w tekście online, aż do momentu walidacji szczepu z nokautem. Po około tygodniu oceń płytki 96-dołkowe pod powiększeniem od 40 do 60x. Wybierz wyłącznie te dołki, które zawierają pojedynczą PFU, zidentyfikowaną jako pojedyncza strefa infekcji, używając pipety ustawionej na 50 µL.

Wymieszaj zawartość tych studzienek, kierując przepływ cieczy nad PFU, aby rozproszyć pasożyty w obrębie studzienki. Od czterech do pięciu dni po wymieszaniu wybranych studzienek, wybierz kilkanaście klonów z lizowanymi komórkami. Przenieś 12 klonów z tacki 96-dołkowej do 12 studzienek tacki 24-dołkowej. Zrób to, zeskrobując dno studzienki końcówką pipety i pobierając 6 µL.

Przenieś roztwór do dołka płytki 24-dołkowej z konfluentnymi komórkami HFF w 1 mL pożywki MPA z dodatkiem selekcji X. Inkubuj płytkę 24-dołkową w temperaturze 37 °C i monitoruj lizę komórek HFF. Przesiewaj pasożyty z dołka, w którym nastąpiła liza, w cyklu tygodniowym.

Zastosuj technikę rozrysowywania (scratch and draw), aby przenieść 2 µL roztworu pasożytów na nową płytkę z MPA i selekcją X. Po pasażu zbierz pasożyty z oryginalnej płytki 24-dołkowej i przenieś je do małych probówek w celu izolacji DNA.

Na koniec należy przeprowadzić reakcję PCR w celu potwierdzenia delecji badanego genu, co pozwoli sprawdzić integrację flank docelowych 5' i 3'. Należy również sprawdzić obecność markera selekcyjnego HX GPRT. Niniejszy protokół dotyczy usunięcia markera HX GPRT ze zmodyfikowanego szczepu delta Q 80 i został opisany w tekście dostępnym online.

P delta GOYC ma na celu usunięcie HX GPRT z pasożyta poprzez selekcję negatywną z wykorzystaniem sześciu mediów TX. Następnie stosuje się PCR, aby potwierdzić utratę HX GPRT; w przypadku, gdy HX GPRT nie został usunięty z locus, widoczny jest prążek o wielkości 1,2 kb. Pojawia się również prążek o wielkości 3,4 kb.

Ostatnia część niniejszego protokołu, dotycząca znakowania białek na terminalu C, jest również szczegółowo opisana w tekście online; po wykonaniu opisanego protokołu w celu ukierunkowanego usunięcia genu, zastosowano metodę PCR w celu potwierdzenia delecji typu knockout genu R 18, który jest obszarem zazwyczaj trudnym do targetowania. Wynik PCR 1 wykazuje brak produktu PCR genu R 18.

PCR 2 wykazuje obecność flanki genomicznej 3' R18; PCR 3 i PCR 4 wykazują obecność markera selekcyjnego prawidłowo zintegrowanego pomiędzy flankami genomicznymi 5' i 3', co definiuje delecję R18. Aby ponownie wykorzystać marker selekcyjny do wykonania kolejnych delecji w szczepie, pierwotny HX GPRT musi zostać najpierw usunięty z locus, zgodnie z opisanym protokołem.

HX GPRT usunięto z locus GRA dwa w szczepie delta dwa 80 delta GRA dwa. Do potwierdzenia utraty HX GPRT wykorzystano HX.G-P-R-T-P-C-R, co objawiło się prążkiem o wielkości 1,2 kb. W przypadku braku usunięcia H-X-G-P-R-T, po początkowym etapie celowania w gen, widoczny był prążek o wielkości 3,4 kb. Dodatkowe metody celowania w geny można zastosować w celu stworzenia wielokrotnych knockoutów w tym samym szczepie typu pierwszego lub drugiego, lub w celu znakowania bądź komplementacji szczepu mutantowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: gdzie to białko lokalizuje się w komórce?

Lub jaka jest kluczowa domena lub aktywność tego białka lub szlaku, która wyjaśnia jego funkcję biologiczną? Technika ta utorowała drogę badaczom w tej dziedzinie do zintensyfikowania eksploracji funkcji genów pasożytów w modelowym kompleksie AP i w pasożycie Toxoplasma. Gandhi eye.

Należy pamiętać, że praca z toksoplazmą może być niebezpieczna, dlatego w trakcie całej procedury należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie wszystkich wytycznych BSL 2.