Name: Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj stereotaktyczną mikroiniekcję wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w mózgu myszy. Ta metoda pozwala badać rolę genów w akwizycji, ekstynkcji i restytucji uwarunkowanej preferencji miejsca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Anni Lee i Maureen Byrne za pomoc w ustanowieniu protokołu rozszerzonej preferencji warunkowego miejsca.

Wszystkie procedury są przeprowadzane zgodnie z zasadami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Weill Cornell Medical College.
1. Przygotowanie i konfiguracja do stereotaktycznego dostarczania wektorów wirusowych
<ol>
	<li>Jeśli narzędzie, sterylny wacik lub sterylna rękawica do noszenia w dłoni zostaną zanieczyszczone w wyniku kontaktu z niesterylną powierzchnią, wyrzuć lub ponownie wysterylizuj instrument za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami, wyrzuć wacik lub zmień na nowe sterylne rękawice.</li>
	<li>Umieść klatkę dla myszy z pościelą na bloku grzewczym, aby się ogrzać w celu rekonwalescencji pooperacyjnej.</li>
	<li>Ustaw elektryczną maszynkę do golenia do golenia oraz etanol i jod, aby wysterylizować skórę głowy.</li>
	<li>Wytrzyj nauszniki i uchwyt ust stereotax 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 5 μl pobrać 5 μl wektora wirusowego (1 x 106 cząstek wirusa/μl) i umieścić w uchwycie strzykawki w trybie stereotax.</li>
	<li>Poduszka grzewcza do kuchenki mikrofalowej lub włącz podkładkę elektryczną i umieść na stereotax. Przykryj czystym wkładem chłonnym, aby zmniejszyć ryzyko poparzenia. Często monitoruj temperaturę ciała myszy (w zakresie 97-99.5 °F) przez cały czas trwania zabiegu. </li>
	<li>Wstrzyknąć myszom (o masie 22-35 g) mieszaninę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (20 mg/kg). Gdy mysz zostanie znieczulona, ściśnij końcówkę ogona, aby sprawdzić odruchy myszy i zanotować każdy ruch lub reakcję, aby upewnić się, że mysz jest odpowiednio znieczulona.</li>
	<li>Ogol głowę między uszami a oczami.</li>
	<li>Gładko ogolona głowa z naprzemiennie sterylnymi aplikatorami z etanolu i jodu.</li>
	<li>Przenieś mysz na podgrzewaną podkładkę w stereotax.</li>
</ol>
2. Stereotaktyczne mikrowstrzykiwanie wektorów wirusowych
<ol>
	<li>Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić sterylne rękawiczki. Jeśli rękawice zostaną zanieczyszczone w dowolnym momencie przez kontakt z niesterylnymi powierzchniami, należy je zmienić.</li>
	<li>Zero listwy zębatej i skali listwy usznej.</li>
	<li>Ustaw zęby w listwie zębatej.</li>
	<li>Wkręć lufę. Jeśli w dowolnym momencie zauważy się drgania lub ruchy wąsów, należy podać dawkę przypominającą IP (~0,05 cm³) mieszaniny ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (20 mg/kg).</li>
	<li>Wkręć nauszniki.</li>
	<li>Nasmaruj oczy preparatem PuraLube.</li>
	<li>Rozetnij skalpelem skórę głowy tuż za uszami.</li>
	<li>Umieść klipsy buldoga w rogach skóry głowy, aby oderwać skórę od czaszki. Bregma i lambda powinny być dobrze widoczne.</li>
	<li>Upewnij się, że szew od bregmy do lambdy jest ustawiony prosto. Jeśli szew jest krzywy, dostosuj położenie głowy.</li>
	<li>Sprawdź, czy wszystkie ustawienia stereotax są wyzerowane.</li>
	<li>Umieść końcówkę igły na miejscu w bregmie.</li>
	<li>Zmierz wszystkie współrzędne zarówno dla bregmy, jak i lambdy. Obejmuje to współrzędne grzbietowe/brzuszne, przyśrodkowe/boczne i przednie/tylne.</li>
	<li>Wyreguluj głowicę, aż współrzędne brzuszne bregmy i lambdy znajdą się w odległości 0.02 mm od siebie.</li>
	<li>Po wyrównaniu, od bregmy idź przyśrodkowo do współrzędnych środkowych/bocznych (M/L). Upewnij się, że lewa i prawa strona są wyrównane w odległości 0.02 mm od siebie.</li>
	<li>Ponownie wyśrodkuj końcówkę igły na bregmie, a stamtąd przesuń się w kierunku przednim/tylnym (A/P) do pożądanej współrzędnej przedniej/tylnej.</li>
	<li>W razie potrzeby ustaw igłę pod kątem w jednym kierunku i upewnij się, że stereotax jest zablokowany. Wyjdź na lewą współrzędną M/L (+/- 1,52)</li>
	<li>Zmierz pozycję brzuszną górnej części czaszki, aby użyć jej jako odniesienia po wywierceniu odwiertu.</li>
	<li>Wywierć otwór wiertniczy za pomocą sterylnego wiertła w żądanej współrzędnej. Sprawdzić, czy igła może bez przeszkód wchodzić przez czaszkę.</li>
	<li>Opuścić igłę do żądanej współrzędnej brzusznej.</li>
	<li>Po osiągnięciu współrzędnej zanurz się 0,015 mm poniżej na ~10 sekund, aby utworzyć małą kieszeń dla wektora wirusowego.</li>
	<li>Wstrzyknąć żądaną objętość wektora wirusowego z szybkością ~0,1 μl/min. Odczekaj 3 minuty, aż wektor wirusowy całkowicie się rozproszy. Podnieś końcówkę igły o 0,015 mm i odczekaj dodatkowe 2 minuty.</li>
	<li>Zanurzyć igłę (w przypadku wstrzyknięć pod kątem) w przeciwnym kierunku. Ponownie zapisz pozycję brzuszną jako odniesienie dla górnej części czaszki.</li>
	<li>Powtórz te same kroki, co po pierwszej stronie, aby wstrzyknąć wektor wirusowy po przeciwnej stronie (jeśli wykonujesz wstrzyknięcia dwustronne).</li>
	<li>Nałóż wosk kostny na oba otwory, aby je uszczelnić za pomocą drewnianej końcówki sterylnej bawełnianej końcówki aplikatora.</li>
	<li>Zszyj skórę głowy.</li>
	<li>Nałóż blokadę nerwów na zraniony obszar.</li>
	<li>Wyjmij mysz ze stereotaxu i umieść w rozgrzanej klatce na bloku grzewczym, aby dojść do siebie na 45 minut.</li>
	<li>Monitoruj objawy bólu, w tym: zmniejszoną ogólną aktywność lub niepokój, zmniejszone spożycie pokarmu i wody lub zwiększoną wokalizację. Buprenorfina (0,05 - 0,2 mg/kg) może być podawana dwa razy na dobę przez tydzień, jeśli jest to konieczne w przypadku bólu. Dopuszczalne alternatywy to: meperydyna (20-60 mg/kg), pentazocyna (10 mg/kg), nalbufina (4-8 mg/kg).</li>
</ol>
3. Preferencja miejsca warunkowego: przejęcie, wygaśnięcie i przywrócenie
<ol>
	<li>Umieść myszy w centralnej komorze trzykomorowego aparatu do preferencji miejsca (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) na 60-sekundowy okres przyzwyczajenia przy zamkniętych drzwiach gilotyny.</li>
	<li>Po przyzwyczajeniu otwórz drzwi gilotyny i pozwól myszom na swobodną eksplorację wszystkich 3 komór przez 1,200 sekund, przy czym czas spędzony w każdej komorze jest rejestrowany za pomocą oprogramowania MedPC IV (Med Associates, Inc.).</li>
	<li>Przypisz myszy do komór kondycjonujących na podstawie ich wydajności podczas testu wstępnego. Korzystając z tendencyjnego projektu, połącz podawanie leku w ciągu kolejnych 3 dni z kompartją, która była najmniej preferowana podczas wyjściowego testu wstępnego.</li>
	<li>Przez następne 3 dni kondycjonowania wstrzyknij myszom kokainę (10 mg / kg; i.p.) podczas porannej sesji i zamknij je w przydzielonej im komorze na 1200 sekund bezpośrednio po wstrzyknięciu. Po sesji przywróć myszy do ich domowych klatek. Po 4 godzinach wstrzyknij myszom sól fizjologiczną (0,01 ml / g masy ciała) i umieść je w przeciwległej komorze na 1200-sekundową sesję popołudniową.</li>
	<li>Aby przetestować akwizycję, umieść myszy w centralnej komorze z zamkniętymi drzwiczkami gilotyny na 60-sekundowy okres przyzwyczajenia. Otwórz drzwi gilotyny i pozwól na swobodną eksplorację przez 1,200 sekund, z czasem spędzonym we wszystkich komorach zarejestrowanym przez oprogramowanie MedPC IV (Med Associates, Inc.). Oblicz preferencję, odejmując ilość czasu spędzonego w komorze sparowanej solą fizjologiczną od ilości czasu spędzonego w kokainowej kokomorze.</li>
	<li>Aby wygasić preferencję miejsca, wystawiaj myszy na dwie 20-minutowe sesje swobodnej eksploracji dziennie w tym samym urządzeniu, w odstępie co najmniej 2 godzin, rozpoczynając 24 godziny po teście na akwizycję. Czas spędzony we wszystkich komorach powinien być ponownie zarejestrowany, a wielkość początkowego CPP powinna być porównana z wielkością każdej sesji ekstynkcji.</li>
	<li>Określ, czy myszy wygasiły preferencję wywołaną lekiem, oceniając, czy preferencja dla określonej komory przez dwa kolejne dni wymierania jest znacznie niższa w porównaniu z wynikiem preferencji nabycia.</li>
	<li>Przywróć myszom dawkę początkową kokainy (5 lub 10 mg/kg; i.p.) i ponownie wystaw je na działanie aparatury umożliwiającej swobodną eksplorację i zapisanie czasu spędzonego w każdym przedziale.</li>
	<li>Podawać roztwór Euthasol do eutanazji (150 mg/kg). Perfuzja przezsercowa u myszy z 4% paraformaldehydem (PFA) i przeprowadzenie badania histologicznego w celu sprawdzenia prawidłowego umieszczenia mikroiniekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neurobiology+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+on+Addictions%22%5BJournal%5D)">Molecular neurobiology of addiction.</a> American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).</li>
<li>Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroplasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system+and+cocaine+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction.</a> British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).</li>
<li>Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+induction+or+expression+of+psychostimulant+sensitization+by+the+circumstances+surrounding+drug+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).</li>
<li>Tzschentke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reward+with+the+conditioned+place+preference+%28CPP%29+paradigm%3A+update+of+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade.</a> Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).</li>
<li>Mueller, D., Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+conditioned+place+preference%3A+reinstatement+by+priming+injections+of+cocaine+after+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction.</a> Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).</li>
<li>Itzhak, Y., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+conditioned+place+preference+in+mice%3A+Induction%2C+extinction+and+reinstatement+by+related+psychostimulants%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants.</a> Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).</li>
<li>Kreibich, A. S., Blendy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+response+element-binding+protein+is+required+for+stress+but+not+cocaine-induced+reinstatement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement.</a> Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).</li>
<li>Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+systematic+cue+exposure+with+standard+treatment+in+recovering+drug+dependent+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Addictive+Behaviors%22%5BJournal%5D)">Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients.</a> Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).</li>
<li>O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+learning+model+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Research+publications+-+Association+for+Research+in+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">A learning model of addiction.</a> Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).</li>
<li>Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+and+neural+mechanisms+of+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Psychological and neural mechanisms of relapse.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).</li>
<li>Bueler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno+associated+viral+vectors+for+gene+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy.</a> Biological Chemistry. 380, (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+adeno-associated+virus+vectors+into+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system.</a> Experimental Neurology. 144 (1), (1997).</li>
<li>Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gamma+irradiation+on+the+transduction+of+dividing+and+nondividing+cells+in+brain+and+muscle+of+rats+by+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).</li>
<li>Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%28v%291.2+L-Type+Ca2%2B+Channels+Mediate+Cocaine-Induced+GluA1+Trafficking+in+the+Nucleus+Accumbens%2C+a+Long-Term+Adaptation+Dependent+on+Ventral+Tegmental+Area+Ca%28v%291.3+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).</li>
<li>Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%28v%291.3+L-type+Ca2%2B+channels+mediate+long-term+adaptation+in+dopamine+D2L-mediated+GluA1+trafficking+in+the+dorsal+striatum+following+cocaine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure.</a> Channels. 6 (1), 11-17 (2012).</li>
<li>Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+gene+expression+in+opiate+and+cocaine+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22NIDA+Research+Monograph%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction.</a> NIDA Research Monograph. 125, (1993).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+and+the+brain%3A+The+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).</li>
<li>Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+elimination+of+cacna1c+mediates+anxiety-like+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice.</a> Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).</li>
<li>Li, X., Wolf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+virus-infected+brain+regions+using+a+GFP-illuminating+flashlight+enables+accurate+and+rapid+dissection+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).</li>
<li>Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+Cre-recombinase+to+neurons+in+vivo+and+stable+transduction+of+neurons+using+adeno-associated+and+lentiviral+vectors+-+art.+no.+5%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5.</a> BMC Neuroscience. 5, (2004).</li>
<li>Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+effectively+mediates+conditional+gene+modification+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).</li>
<li>Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+herpes+virus+amplicon+vectors+to+study+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders.</a> Biotechniques. 39 (3), 9(2005).</li>
<li>Pohl, M., Braz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+pain%3A+emerging+strategies+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions.</a> European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).</li>
<li>Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cytotoxic+herpes+simplex+virus+vector+which+expresses+Cre+recombinase+directs+efficient+site+specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination.</a> Virus Research. 65 (1), (1999).</li>
<li>Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+hybrid+serotypes%3A+Improved+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery.</a> Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).</li>
<li>Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+delivery+of+CLN2+reduces+brain+pathology+in+a+mouse+model+of+classical+late+infantile+neuronal+ceroid+lipofuscinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses+-+normal+integration+does+not+require+viral+gene-expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression.</a> Journal of Virology. 63 (9), (1989).</li>
<li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene-expression+and+phenotypic+correction+using+adenoassociated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), (1994).</li>
<li>Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+activation+of+lateral+amygdala+pyramidal+cells+instructs+associative+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).</li>
<li>Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Specyficzna regionalnie i czasowo ablacja genów poprzez stereotaktyczną mikroiniekcję wektorów wirusowych w połączeniu z CPP, która obejmuje fazy wymierania i przywracania, pozwala na zbadanie specyficznego wkładu genów w trzy odrębne fazy zachowań podobnych do uzależnień. Podczas gdy warunkowy nokaut, który osiąga się przy użyciu tradycyjnego systemu Cre-LoxP, zapewnia czasowo ograniczoną ablację genów, stereotaktyczne mikrowstrzykiwanie Cre-rekombinazy do dyskretnych obszarów mózgu myszy z klapkami pozwala na jeszcze ś...

Kokaina jest wysoce wzmacniającym środkiem psychostymulującym. Po wielokrotnym narażeniu w obwodach mózgu istotnych dla nagrody zachodzi kilka adaptacji molekularnych i komórkowych, które, jak się uważa, powodują kompulsywne poszukiwanie narkotyków, powodując wysokie wskaźniki nawrotów, które stanowią poważny problem kliniczny 1. Kokaina wywiera te długotrwałe efekty behawioralne poprzez regulację ekspresji genów. Aby zbadać adaptacje wynikające z przewlekłego zażywania kokainy, szeroko wykorzystano przedkliniczne modele gryzoni. Jednym z takich modeli jest paradygmat warunkowej preferencji miejsca (CPP). Model ten zakłada rozwój wyuczonego związku między wcześniej neutralnym środowiskiem a nagradzającymi właściwościami kokainy. Po kilku parach kokainy z określoną komorą, zwierzęta mogą swobodnie eksplorować środowiska sparowane z kokainą i niesparowane z kokainą, a jeśli wolą komorę sparowaną z narkotykami, mówi się, że nabyły preferencję miejsca wywołaną przez kokainę. Co więcej, po okresie treningu wymierania, paradygmat ten może być wykorzystany do badania powrotu zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy w zależności od kontekstu.
W porównaniu z innymi modelami behawioralnymi zachowań podobnych do uzależnienia, takimi jak uwrażliwienie psychomotoryczne, które jest używane do badania długoterminowej plastyczności behawioralnej i molekularnej wywołanej kokainą 2,3 oraz samodzielnego administrowania (SA), które uważa się za dokładniejsze naśladowanie uzależniającego zachowania występującego u ludzi, paradygmat CPP jest prostą procedurą do badania kontekstowego uczenia się kokainy 4. Protokoły CPP można wygodnie rozszerzyć o fazy wygaszania i przywracania, podobnie jak SA, które pozwalają na badanie mechanizmów leżących u podstaw głodu narkotykowego i nawrotu 5-7 i które, jak się uważa, podsumowują aspekty tego, co dzieje się w ludzkich zachowaniach związanych z poszukiwaniem narkotyków i nawrotami wywołanymi przez narkotyki i sygnały 8-10.
Jednym z mechanizmów, który leży u podstaw indukowanej przez kokainę plastyczności behawioralnej, która jest charakterystyczna dla każdej z odrębnych faz CPP, w tym nabywania, wygaszania i przywracania, jest aktywacja unikalnych sygnatur ekspresji genów w różnych regionach mózgu. Aby bezpośrednio sprawdzić, które geny w regionach mózgu istotnych dla nagrody pośredniczą w zmianach behawioralnych wywołanych przez kokainę, przydatna jest możliwość selektywnego manipulowania nimi w sposób specyficzny dla regionu. Jednym ze sposobów osiągnięcia tego celu jest mikrowstrzyknięcie rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenoarelacją (rAAV), które wyrażają rekombinazę Cre za pomocą chirurgii stereotaktycznej, do różnych obszarów mózgu myszy, które mają docelowe geny otoczone miejscami LoxP (myszy floksowane). Metoda ta pozwala na bardzo precyzyjną kontrolę czasową i regionalną nad tym, kiedy i gdzie geny są ablowane, zarówno w neuronach dzielących, jak i niedzielących się, bez wywoływania odpowiedzi immunologicznej 11-13. Ten poziom kontroli stanowi istotną przewagę nad tradycyjną technologią Cre-LoxP polegającą na rozmnażaniu myszy z floksami z myszami eksprymującymi rekombinazę Cre pod kontrolą endogennego promotora genu, ponieważ czas i dystrybucja delecji genu mogą być ściślej regulowane. Dodatkowo, nokaut genów za pośrednictwem wektora wirusowego omija potencjalne efekty kompensacyjne rozwoju, które mogą wystąpić przy użyciu tradycyjnych strategii nokautu.
Oprócz kokainy CPP, która jest tutaj opisana, mikroiniekcja rAAV-Cre do mózgu myszy z klapkami w celu oceny roli określonych genów może być stosowana wszędzie w paradygmatach behawioralnych, które obejmują oddzielne fazy, w tym samodzielne podawanie i uwrażliwienie psychomotoryczne. Na przykład nasze laboratorium wykorzystało technologię rAAV-Cre do zbadania roli kanałów Cav1,2 L typuCa 2+ w uwrażliwianiu psychomotorycznym na kokainę 14. W szczególności rAAV-Cre został mikrowstrzyknięty do jądra półleżącego (NAc) myszy z genem kodującym Cav1,2 floksowany, aby wykazać, że Cav1,2 działający w tym regionie pośredniczy w fazie ekspresji uwrażliwienia psychomotorycznego 14,15. Jednak strategia rAAV-Cre nie może być stosowana, jeśli nie istnieją myszy z błędnym genem będącym przedmiotem zainteresowania, jak to miało miejsce podczas oceny roli kanałów Cav1,3 Ca2 + typu L w uczuleniu psychomotorycznym. W związku z tym pojawia się ograniczenie stosowania rAAV-Cre, jeśli myszy warunkowe nie istnieją dla określonego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak rAAV, które wyrażają siRNA, mogą być wykorzystywane do niszczenia docelowych genów, tak jak zrobiliśmy to w celu zbadania roli kanałów Cav1.3 14,15.
Mikroiniekcja rAAV-Cre do dyskretnych obszarów mózgu myszy z floksami, a następnie przetestowanie ich w paradygmacie CPP pozwala na zbadanie konkretnych genów, które pośredniczą w różnych fazach uzależniającego zachowania i gdzie działają. Zastosowanie tego paradygmatu pomogło nam zrozumieć, w jaki sposób powtarzające się podawanie kokainy w istocie przejmuje kontrolę nad obwodem nagrody w mózgu, powodując nieprzystosowawcze zmiany w szlakach transdukcji sygnału molekularnego i ekspresji genów, które prowadzą do stanu uzależnienia 1,16,17.

<table><tbody><tr><td>Komory aktywności z preferencją miejsca</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny system wyrównywania myszy</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>model 900</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Hamilton</td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vector BioLabs, Filadelfia, PA, USA</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>Vector BioLabs, Filadelfia, PA, USA</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Mikroiniekcja rekombinowanych wektorów wirusa adenosażowego (rAAV) wyrażających rekombinazę Cre do różnych regionów mózgu myszy w celu selektywnego nokautowania interesujących genów pozwala na zwiększoną czasowo i regionalnie specyficzną kontrolę delecji genów, w porównaniu z istniejącymi metodami. Podczas gdy warunkową delecję można również osiągnąć poprzez kojarzenie myszy, które wykazują ekspresję rekombinazy Cre pod kontrolą określonych promotorów genów, z myszami noszącymi gen floksowany, mikroiniekcja stereotaktyczna pozwala na celowanie w dyskretne obszary mózgu w określonych przez eksperymentatora punktach czasowych zainteresowania. W kontekście preferencji miejsca uwarunkowanego kokainą i innych paradygmatów behawioralnych kokainy, takich jak samodzielne podawanie lub uwrażliwienie psychomotoryczne, które mogą obejmować fazy odstawienia, wygaszenia i/lub przywrócenia, technika ta jest szczególnie przydatna w badaniu unikalnego wkładu genów docelowych w te odrębne fazy behawioralnych modeli plastyczności indukowanej kokainą. W szczególności technika ta pozwala na selektywną ablację docelowych genów podczas dyskretnych faz zachowania w celu zbadania ich wkładu w zachowanie w czasie. Ostatecznie wiedza ta pozwala na bardziej ukierunkowane terapie, które są w stanie najlepiej zająć się najsilniejszymi czynnikami ryzyka, które pojawiają się w każdej fazie uzależniającego zachowania.

CPP
Po przeprowadzeniu CPP u myszy poddanych mikroiniekcjom, należy zweryfikować, czy grupa myszy kontrolnych (rAAV-GFP) prawidłowo nabyła preferencję do komory sprzężonej z lekiem (Rysunek 1A, 1B). Uważa się, że myszy nabyły preferencję do konkretnej komory, gdy preferencja do kokainy (czas spędzony w komorze sprzężonej z kokainą minus czas spędzony w komorze sprzężonej z solą fizjologiczną) jest znacząco wyższa w porównaniu z wynikiem preferencji bazowej (Rysunek 1B, A ...

Ten artykuł opisuje, jak mikrowstrzykiwać wektory wirusowe do mózgu myszy, a następnie testować w warunkowym paradygmacie preferencji miejsca, który obejmuje fazę przejęcia, wyginięcia i przywrócenia.

Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest selektywna ablacja genów docelowych podczas poszczególnych faz paradygmatu preferencji miejsca uwarunkowanej, aby przetestować ich wkład w to zachowanie w czasie. Osiąga się to poprzez stereotaksycyjne mikroiniekcje rekombinowanego wirusowego wektora AAV wykazującego ekspresję rekombinazy Cre. Następnie myszy pozostawia się w klatkach domowych na 10 do 14 dni w celu maksymalnej reaktywacji Cre.Trzecim krokiem procedury jest poddanie myszy testowi preferencji miejsca uwarunkowanej, obejmującemu fazy nabywania, wygaszania i odnawiania reakcji. Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie badania histologicznego myszy poddanych mikroiniekcjom w celu potwierdzenia prawidłowego umiejscowienia mikroiniekcji. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany w zachowaniach podczas nabywania, wygaszania i/lub odnawiania reakcji w odpowiedzi na knockout genu za pomocą behawioralnych testów preferencji miejsca uwarunkowanej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak system Cre-LoxP, jest to, że pozwala ona na bardziej precyzyjne określenie czasu oraz specyficzności anatomicznej wyciszenia genu w sposób dyskretny, co um

stereotaxic-microinjection-viral-vectors-expressing-cre-recombinase

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Sterynotaksyczna mikroiniekcja wirusowych wektorów ekspresujących rekombinazę Cre w celu badania roli genów docelowych w preferencji miejsca uwarunkowanej kokainą

Źródło: Chen, S., et al., Stereotaktyka chirurgiczna w komórkach prążkowia noworodków w mózgach myszy noworodków. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego kodującego rekombinazę Cre i białko zielonej fluorescencji lub GFP do prążkowia genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy w celu uzyskania manipulacji genami poprzez wycięcie kasety STOP po bokach loxP, aktywując białko czerwonej fluorescencji lub RFP jako reportera.

Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i...

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Stereotaktyczne wstrzykiwanie lentiwirusów wyrażających cDNA lub shRNA może modulować ekspresję genów w określonych obszarach mózgu myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący zastrzyki stereotaktyczne z zadaniami behawioralnymi, takimi jak Test Otwartego Pola (OFT) i Test Wymuszonego Pływania (FST).

Zastosowanie techniki iniekcji stereotaktycznej do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Podejścia optogenetyczne są powszechnie używane do manipulowania aktywnością neuronalną i oceny konsekwencji dla funkcjonowania mózgu. W tym miejscu przedstawiono technikę, która po ekspresji in vivo aktywatora optycznego rodopsyny kanałowej pozwala na analizę ex vivo właściwości synaptycznych określonych połączeń neuronalnych dalekiego zasięgu i lokalnych połączeń nerwowych w obwodach związanych ze strachem.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Poznaj stereotaktyczną mikroiniekcję wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w mózgu myszy. Ta metoda pozwala badać rolę genów w akwizycji, ekstynkcji i restytucji uwarunkowanej preferencji miejsca.

Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą (Wideo) | JoVE Journal

Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą

Przeglądaj więcej filmów