Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyprodukowanie nanoczujników reagujących na pH i rusztowań samoraportujących, które mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym i in situ, aby pomóc w zrozumieniu warunków wpływających na wzrost komórek. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw biokompatybilnych nanoczujników reagujących na analit, które mogą monitorować pH za pomocą sygnałów wyjściowych fluorescencji. W drugim etapie nanoczujniki reagujące na pH są umieszczane w polimerowych rusztowaniach elektroprzędzonych, tworząc środowisko 3D, na którym można hodować i monitorować komórki.

Następnie komórki ssaków są umieszczane na rusztowaniach przędzonych elektronicznie, a nanoczujniki są również dostarczane do ich środowiska wewnątrzkomórkowego w celu monitorowania wewnątrzkomórkowego pH. Podczas eksperymentów uzyskuje się wyniki, które pokazują zdolność wewnątrzkomórkowych nanoczujników i samoraportujących rusztowań do monitorowania pH w środowiskach inżynierii tkankowej w oparciu o współczynniki fluorescencji uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zastosowanie elektronicznych sond pH, jest to, że pomiary można wykonywać in situ i w czasie rzeczywistym bez konieczności zakłócania wzrostu komórek.

Aby rozpocząć, przygotuj fluorofory, rozpuszczając 1,5 miligrama fam SE w jednym mililitrze dimetyloformamidu znanego jako DMF na okrągłym dnie. Kolba również rozpuścić 1,5 miligrama Tamara SE w jednym mililitrze DMF w drugiej kolbie. Następnie dodaj 1,5 mililitra trzech aminopropylotrietylu do każdej kolby i mieszaj ciągle w ciemności w suchej atmosferze azotu w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnie dodać 250 mikrolitrów obu roztworów barwników do mieszaniny zawierającej sześć mililitrów etanolu i cztery mililitry wodorotlenku amonu zawartych w kolbie okrągłodennej. Wymieszaj tę nową mieszaninę w temperaturze 21 stopni Celsjusza po godzinie. Powoli dodaj 0,5 mililitra tetraetylo-ortokrzemianu do mieszaniny i kontynuuj mieszanie przez kolejne dwie godziny.

W tym czasie spodziewaj się, że mieszanina stanie się mętna, a następnie zbierz nanoczujniki przez odparowanie obrotowe i przechowuj je w szklanej fiolce w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Następnie dodaj wysuszone nanoczujniki pH w ilości pięciu miligramów na mililitr do fosforanowych Sorensona, w zakresie od pH 5,5 do pH 7,5 w krokach co pH 0,5. Ponownie zawiesić nanoczujniki, wirując próbki przez trzy minuty, a następnie poddaj je sonikacji przez pięć minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się mętny.

Zbierz dane kalibracyjne, mierząc próbki przy długości fali wzbudzenia 488 nanometrów dla FAM i 568 nanometrów. W przypadku Tamary należy zebrać emisje w odległości od 500 do 530 nanometrów dla FAM i od 558 do 580 nanometrów dla Tamary i obliczyć stosunek maksymalnych emisji wytwarzanych przy każdej wartości pH. Następnie przygotuj próbkę do obrazowania SEM, umieszczając próbkę nanoczujników na mikroskopie elektronowym pokrytym węglem, króćcu i napylaj cząstki złotem przez pięć minut w atmosferze argonu.

Po pokryciu umieść próbki w mikroskopie elektronowym i dostosuj odległość roboczą, napięcie i powiększenie, aby zminimalizować ładunek elektronów i uzyskać najlepsze obrazy w dygestorium. Przygotować 20% roztwór PLGA w chlorometanie z 1% mrówczanem krocza. Załaduj roztwór do 10-mililitrowej strzykawki z igłą do napełniania o rozmiarze 18 i bezpiecznie zamocuj go na pompie strzykawkowej.

To rozwiązanie zostanie wykorzystane do tego, aby rusztowania kontrolne PLGA oddalały końcówkę igły o 20 centymetrów od aluminiowej płytki zbiorczej o wymiarach 20 na 15 centymetrów i przymocowały elektrodę zasilacza wysokonapięciowego do końcówki strzykawki i uziemiły drut do aluminiowej płytki zbiorczej. Następnie włącz zasilanie i dostosuj napięcie do 12 kilowoltów. Następnie włącz pompę strzykawkową i dostarczaj roztwór przy stałym natężeniu przepływu 3,5 mililitra na godzinę przez dwie godziny.

Pozwoli to uzyskać rusztowanie o głębokości około 60 mikronów. Po zakończeniu wyłącz sprzęt i pozostaw rusztowanie w dygestoriach na 24 godziny, aby pozostałości rozpuszczalnika odparowały. Aby przygotować rusztowania wyposażone w nanoczujniki reagujące na pH, przygotuj roztwór PLGA jak poprzednio, ale tym razem dodaj również pięć miligramów na mililitr nanoczujników.

Następnie wiruj elektrolitycznie reagując na pH, używając tych samych ustawień, co poprzednio. Następnie skalibruj reakcję pH rusztowania, umieszczając małe próbki wysuszonego rusztowania z wbudowanymi nanoczujnikami na 35-milimetrowych płytkach hodowlanych i zanurzając je w dwóch mililitrach fosforanowych Sorensen między pH 5,5 a 7,5 w krokach co 0,5 w mikroskopie konfokalnym. Użyj lasera argonowego o długości 488 nanometrów, aby wzbudzić FAM i lasera kryptonowego o długości 568 nanometrów, aby wzbudzić Tamarę w nanoczujnikach.

Obserwuj emisję przy 500 do 530 nanometrach dla FAM i 558 do 580 nanometrach dla Tamary, a następnie oblicz stosunek maksimów emisji wytwarzanych przy każdej wartości pH. Najpierw wysterylizuj powierzchnie rusztowań źródłem światła UV w odległości ośmiu centymetrów przez 15 minut z każdej strony. Następnie sterylnie przenieś rusztowania na 12-dołkową płytkę hodowlaną i umieść stalowy pierścień o średnicy wewnętrznej jednego centymetra i średnicy zewnętrznej dwóch centymetrów nad rusztowaniem.

Następnie dodaj PBS z 5% paskiem długopisu do wewnątrz i na zewnątrz stalowego pierścienia i inkubuj próbki przez noc. Następnego dnia. Usunąć PBS za pomocą 5% paciorkowca i umyć rusztowania PBS.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do wnętrza i na zewnątrz stalowego pierścienia i podgrzej płytkę w inkubatorze. Następnie zbierz interesujące Cię komórki i przygotuj zawiesinę komórek od jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Gdy komórki będą gotowe, usuń pożywkę ze studzienki i dodaj jeden mililitr świeżej pożywki na zewnątrz stalowego pierścienia.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów zawiesiny komórek do wnętrza stalowego pierścienia i delikatnie kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 i inkubuj komórki tak długo, jak to konieczne. Odświeżanie pożywki co dwa do trzech dni umieszcza komórki nasienne na rusztowaniach zgodnie z opisem w poprzednim rozdziale i pozostawia je do nieprzerwanego wzrostu przez 72 godziny.

Następnie przepłucz komórki PBS i dodaj 500 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy na zewnątrz pierścienia i 300 mikrolitrów wewnątrz pierścienia. Inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza podczas inkubacji. Przygotuj roztwór A, dodając pięć miligramów nanosensorów z 50 mikrolitrami optimum i krótko cudzołożnego.

Następnie zmieszać roztwór B, dodając pięć mikrolitrów lipektomii 2000 do 45 mikrolitrów Optum i pozostawić mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj roztwór A do roztworu B, wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utworzyć roztwór C, który jest kompleksem liposomów nanosensorowych. Wyjmij płytkę z inkubatora i dodaj 100 mikrolitrów złożonego roztworu do wnętrza stalowego pierścienia.

Następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubować komórki z kompleksami odczynników do lipektomii przez trzy godziny po inkubacji. Odessać pożywkę i dwukrotnie umyć komórki podgrzanym PBS przed zanurzeniem rusztowania osadzonego w komórce w o różnych ph w celu monitorowania odpowiedzi nanoczujników. Teraz wewnątrz komórek zobrazuj komórki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, aby śledzić lokalizację nanoczujników w komórkach ssaków.

Po pierwsze, przygotuj i dostarcz tylko fam zawierające nanosensory do komórek osadzonych na rusztowaniach PLGA. Następnie dodaj dwa mikrolitry 50 nano molowych lyo tracker red do 300 mikrolitrów pożywki i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po okresie inkubacji. Usuń pożywkę i umyj komórki dwukrotnie PBS.

Następnie dodaj dwa mikrolitry PBS lub inne pożywki wolne od czerwieni fenolowej, aby pokryć komórki podczas obrazowania konfokalnego. Następnie dodaj pięć mikromolowców barwienia jądrowego, strzyj pięć do PBS i inkubuj z komórkami przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech minutach wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją na stoliku konfokalnym w celu obrazowania obrazu, nanosensorów organelli i jądra kwasowego przy użyciu różnych długości fal wzbudzenia i emisji, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, przy użyciu skanowania sekwencyjnego w celu uniknięcia zbierania długości fal wzbudzenia, rozkład wielkości przygotowanych nanoczujników reagujących na pH scharakteryzowano za pomocą SEM, w którym zmierzono populację obrazowanych nanoczujników i stwierdzono, że mają wymiary nanometrowe w zakresie od 240 do 470 nanometrów.

Po lewej stronie pokazano obraz włókien PLGA przędzonych elektronicznie, a po prawej włókna PLGA przędzone elektronicznie z nanoczujnikami. Mikrofotografie SEM włókien dostarczają dowodów na powiązanie nanoczujników na powierzchni włókien. Mogą być jednak również wbudowane we włókna rusztowania.

Po przędzeniu elektro nanoczujniki zachowują swoją zdolność do pozostawania optycznie i chemicznie aktywnymi, a tutaj są pokazane w połączeniu z włóknami rusztowania. Po lewej stronie znajduje się barwnik fam pokazany na zielono, a po prawej barwnik Tamara pokazany na czerwono. Współczynnik intensywności fluorescencji tworzy krzywą kalibracyjną, jak pokazano tutaj.

Nanoczujniki oceniane samodzielnie i po umieszczeniu w rusztowaniach PLGA z przędzeniem elektro odzwierciedlały się nawzajem, wykazując, że nanoczujniki zachowują swoją aktywność optyczną po wbudowaniu do rusztowań. Wbudowane nanoczujniki również odwracalnie dobrze reagują na zmieniające się wartości pH, ponieważ bufor zmieniał pH między 5,5 a 7,5. Stosunek fam Tamra zgodnie z przewidywaniami reagował za każdym razem, gdy był wyświetlany.

Oto konfokalne obrazy fibroblastów, które miały nanoczujniki dostarczane wewnątrzkomórkowo za pomocą odczynnika do transfekcji. Punktowa kolokalizacja barwników fam i Tamara sugeruje, że barwniki pozostały uwięzione w matrycy nanosensora. Wewnątrzkomórkowe dostarczanie nanoczujników można potwierdzić, mierząc stosunek fam Tamara komórek umieszczonych w różnych.

Jak widać tutaj, stosunek ten wzrasta podczas pomiaru nanoczujników opartych na rusztowaniach, ale pozostaje stabilny podczas pomiaru czujników w komórkach. Po opracowaniu tej techniki naukowcy zajmujący się inżynierią tkankową mogą prowadzić badania in situ i w czasie rzeczywistym. Mikrośrodowiskowe wewnątrzkomórkowe zmiany pH w konstruktach komórkowych 3D bez zakłócania trwającego eksperymentu.