Name: Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Poznaj metodę tworzenia samoraportujących rusztowań PLGA z nanoczujnikami pH do monitorowania mikrośrodowiska komórkowego w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia nieinwazyjną analizę warunków wzrostu komórek w trójwymiarowej hodowli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uprzejmie dziękujemy za dofinansowanie z BBSRC (numer grantu BB H011293/1).

Przegląd
Sekcja 1 opisuje przygotowanie nanosensorów reagujących na pH oraz charakterystykę reakcji nanosensorów na pH za pomocą spektrometrii fluorescencyjnej oraz ich wielkość przy użyciu SEM.
Sekcja 2 opisuje przygotowanie elektrowirowanych rusztowań polimerowych oraz charakterystykę ich morfologii i rozmiaru za pomocą SEM. Sekcja 2 opisuje również przygotowanie rusztowań samoraportujących, które są rusztowaniami elektroprzędzonymi z uwzględnieniem nanoczujników reagujących na pH. Powstałe w ten sposób rusztowania samoopisujące się są charakteryzowane za pomocą SEM, aby ocenić, czy wystąpiły jakiekolwiek zmiany morfologiczne we włóknach elektroprzędzonych. Fluorescencja z samoopisujących się rusztowań powstałych dzięki wbudowanym nanoczujnikom jest oceniana za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Sekcja 3 opisuje hodowlę komórek na rusztowaniu elektrowirowym i rusztowaniu samoopisującym. Rusztowania są najpierw sterylizowane w ramach przygotowań do hodowli komórek, po czym rusztowania są oceniane w celu określenia, czy sterylizacja i hodowla komórek wpływają na zdolność fluorescencyjną rusztowań samoopisujących. Protokół opisuje również dostarczanie nanoczujników do komórek, które są hodowane na elektroprzędzonych rusztowaniach. Barwnik Lysotracker służy do zapewnienia, że nanoczujniki nie zostały wprowadzone do komórkowych komór kwasowych.
1. Przygotowanie i analiza nanosensorów zol-żel reagujących na pH
1.1 Przygotowanie nanosensorów zol-żel reagujących na pH
Uwaga: To przygotowanie powinno być wykonywane w dygestorium.
<ol>
	<li>Przygotować fluorofory do użycia w nanoczujnikach pH, rozpuszczając 5-(i-6)-karboksyfluoresceinę, ester sukcynimidylowy (FAM-SE) (1,5 mg) w dimetyloformamidzie (DMF) (1 ml) w kolbie okrągłodennej i 6-karboksytetrametylododaminę, ester sukcynimidylowy (TAMRA-SE) (1,5 mg) w DMF (1 ml) w innej kolbie okrągłodennej. Dodać 3-aminopropylotrietoksysilan (APTES) (1,5 ml) do każdej kolby i mieszać w suchej atmosferze azotu (21 °C) przez 24 godziny w ciemności, tj. owinąć próbki w folię.</li>
	<li>Dodać oba powyższe barwniki (250 μl) do mieszaniny etanolu (6 ml) i wodorotlenku amonu (30 % wag., 4 ml) znajdujących się w kolbie okrągłodennej i mieszać przez 1 godzinę (21 °C).</li>
	<li>Powoli dodawać tetraetyloortokrzemian (TEOS) (0,5 ml) do mieszaniny, kontynuować mieszanie przez kolejne 2 godziny. Mieszanina stanie się mętna. Nanoczujniki mogą być zbierane przez odparowanie obrotowe. Nanoczujniki można przechowywać w szklanej fiolce w temperaturze 4 oC do wykorzystania w przyszłości. UWAGA: dalsze obchodzenie się z nanoczujnikami w postaci suchej powinno odbywać się pod wyciągiem wyciągowym lub w przypadku ich ważenia waga powinna być zamknięta, na przykład w sejfie.</li>
</ol>
1.2 Odpowiedź nanosensora na pH
<ol>
	<li>Przygotować buforowe roztwory fosforanowe Sørensena o pH 5,5-8,0, mieszając określone proporcje roztworów podstawowych jednozasadowego (0,2 M) i dwuzasadowego (0,2 M) fosforanu sodu. Sprawdź końcowe pH za pomocą pH-metru. Dokonać drobnych korekt pH za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH) (4 M) lub kwasu solnego (HCl) (2 M).</li>
	<li>Zawiesić nanoczujniki pH w pH (5 mg/ml), najpierw przytrzymując naczynie zawierające roztwór nanosensora w wirze przez 3 minuty, a następnie zanurzając naczynie w ultrasonografie, aż roztwór stanie się mętny (około 5 minut). Powtórz te kroki, aby całkowicie zawiesić nanoczujniki w roztworze.</li>
	<li>Umieść pierwszy roztwór w kuwecie optycznej i użyj długości fali wzbudzenia 488 nm dla 5-(i-6)-karboksyfluoresceiny (FAM) i 568 nm dla 6-karboksytetrametylorodaminy (TAMRA). Zebrać długości fal emisji przy 500-530 nm dla FAM i 558-580 nm dla TAMRA za pomocą spektrometru fluorescencyjnego.</li>
	<li>Zmień roztwory w kuwecie optycznej tak, aby można było zaobserwować pH przy innym pH i kontynuuj zbieranie widm emisyjnych.</li>
	<li>Obliczyć stosunek maksymalnych emisji wytwarzanych przy każdej wartości pH, aby otrzymać krzywą kalibracyjną.</li>
</ol>
1.3 SEM nanosensorów
<ol>
	<li>Umieść próbkę nanoczujników na pokrytym węglem króćcu mikroskopu elektronowego i napylaj złotem przez 5 minut w atmosferze argonu.</li>
	<li>Obserwuj za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Podczas obrazowania dostosuj odległość roboczą, napięcie i powiększenie, aby zminimalizować ładunek elektronów (ilustracja 1).</li>
</ol>
2. Przygotowanie i analiza rusztowań PLGA
2.1 Elektroprzędzące rusztowania PLGA
<ol>
	<li>W dygestorii rozpuścić poli(kwas mlekowo-glikolowy) (PLGA) w dichlorometanie (DCM) (20% (m/w)) z mrówczanem pirydyny (PF) (1% (w/w)). Umieścić roztwór w strzykawce o pojemności 10 ml z igłą o sile 18 g i bezpiecznie dopasować do pompy strzykawkowej.</li>
	<li>Odsuń końcówkę igły na 20 cm od aluminiowej płytki zbierającej o wymiarach 20 cm x 15 cm.</li>
	<li>Przymocuj elektrodę zasilacza wysokonapięciowego do końcówki strzykawki, a uziemienie do aluminiowej płytki zbiorczej.
	 UWAGA: Należy zachować ostrożność, ponieważ używane jest wysokie napięcie, tj. zawsze wyłączaj zasilanie elektryczne przed obsługą jakiegokolwiek sprzętu do elektroprzędzenia.</li>
	<li>Roztwór należy dostarczyć przy stałym natężeniu przepływu 3,5 m/h przy napięciu 12 kV przez 2 godziny. Elektroprzędzenie w tych warunkach zapewni głębokość rusztowania około 60 μm.</li>
	<li>Pozostawić rusztowanie w dygestorii na 24 godziny, aby pozostałości rozpuszczalnika mogły odparować.</li>
</ol>
2.2 Elektroprzędzenie Rusztowania PLGA reagujące na pH
<ol>
	<li>Przygotować rusztowania zawierające nanoczujniki reagujące na pH, jak opisano w sekcji 2.1, ale z modyfikacją polegającą na dodawaniu nanoczujników do roztworu polimeru (5 mg/ml). Zawieś nanoczujniki w roztworze PLGA za pomocą ultradźwięków (około 5 min) przed umieszczeniem w strzykawce o pojemności 10 ml.</li>
</ol>
2.3 SEM rusztowania PLGA i rusztowania reagującego na pH
<ol>
	<li>Umieścić próbkę rusztowania PLGA lub rusztowania reagującego na pH na króćcu mikroskopu elektronowego pokrytego węglem i postępować zgodnie z opisem dla SEM nanoczujników (rysunek 1).</li>
</ol>
2.4 Kalibracja rusztowania reagującego na pH
<ol>
	<li>Umieścić próbkę rusztowania reagującego na pH na płytce hodowlanej o średnicy 35 mm i zanurzyć w odpowiednich roztworach buforowych.</li>
	<li>W mikroskopie konfokalnym użyj lasera argonowego o długości fali 488 nm do wzbudzenia FAM i lasera kryptonowego o długości fali 568 nm do wzbudzenia TAMRA w nanoczujnikach. Obserwować emisję fluorescencji dla rusztowań reagujących na pH przy 500-530 nm dla FAM i 558-580 nm dla TAMRA. (Rysunek 2). Użyj skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć zbierania długości fal wzbudzenia.</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa na rusztowaniach PLGA i rusztowaniach PLGA reagujących na pH
Uwaga: Następujące czynności powinny być wykonywane w komorze do hodowli komórkowych.
3.1 Przygotowanie rusztowań PLGA do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Pociąć rusztowania PLGA lub PLGA reagujące na pH na 2 cm2 części.</li>
	<li>Sterylizuj rusztowania, naświetlając je światłem ultrafioletowym (UV) z odległości 8 cm przez 15 minut z każdej strony.</li>
	<li>Przenieś rusztowania na 12-dołkową płytkę hodowlaną i umieść na niej stalowy pierścień. Dodać roztwór penicyliny/streptomycyny (5% v/v) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do wnętrza i na zewnątrz stalowego pierścienia, inkubować przez noc (37 °C, 5% CO2 ). Zwróć uwagę, że stalowy pierścień został wyprodukowany na Uniwersytecie w Nottingham i ma następujące wymiary: 2 cm średnica zewnętrzna, 1 cm średnica wewnętrzna, 1 cm głębokość.</li>
	<li>Usuń roztwór sterylizujący i przemyj PBS.</li>
	<li>Dodać pożywkę do hodowli komórkowych do wnętrza (500 μl) i na zewnątrz (500 μl) stalowego pierścienia, umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), przygotowując zawiesinę komórek.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego.</li>
	<li>Utwórz zawiesinę komórek, aby uzyskać liczbę komórek 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Usuń nośnik z wewnątrz i na zewnątrz stalowego pierścienia.</li>
	<li>Zastąp wstępnie podgrzaną pożywką do hodowli komórkowych na zewnątrz stalowego pierścienia (1 m).</li>
	<li>Dodaj 300 μl zawiesiny komórek do wnętrza stalowego pierścienia - płytki skalnej do tyłu i do przodu, delikatnie rozprowadzając komórki.</li>
	<li>Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) - przyłączenie komórek powinno nastąpić w ciągu 24 godzin, jednak kontynuuj hodowlę tak długo, jak wymaga tego eksperyment - odświeżając pożywkę co 2-3 dni.</li>
</ol>
3.2 Dostarczanie nanosensorów do komórek hodowanych na rusztowaniu PLGA
<ol>
	<li>Komórki nasienne na rusztowanie PLGA zgodnie z opisem w sekcji 3.1. W tym badaniu użyto ślepego rusztowania PLGA (niezawierającego nanoczujników) ze względu na nakładanie się emisji fluorescencji podczas obrazowania.</li>
	<li>Umieść rusztowanie wysiewane komórkami w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 72 godziny, aby umożliwić komórkom wzrost i migrację w całym rusztowaniu przed dostarczeniem nanosensorów.</li>
	<li>Przed podaniem nanosensora przemyć komórki PBS i zmienić pożywkę ze standardowej pożywki hodowlanej na pożywkę wolną od antybiotyków i surowicy, inkubować (37 °C, 5% CO2) przez 1 godzinę. Uwaga: standardowa pożywka hodowlana dla komórek 3T3 składa się z pożywki Dulbecco Modified Eagle's uzupełnionej płodową surowicą cielęcą (10% (v/v)), roztworem L-glutaminy (2 mM), penicylina/streptomycyna (1% (v/v)).</li>
	<li>W okresie inkubacji przygotować kompleks nanosensor-liposom poprzez krótką sonikację nanoczujników (5 mg) za pomocą Optimem (50 μl) w celu wytworzenia roztworu A.</li>
	<li>Stworzyć roztwór B, dodając Lipofectamine 2000 (5 μl) do Optimem (45 μl), inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Dodaj roztwór A do roztworu B, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utworzyć roztwór C, który jest kompleksem nanosensor-liposom.</li>
	<li>Dodać roztwór C (100 μl) do komórek i inkubować (37 °C, 5% CO2 ) przez 3 godziny.</li>
	<li>Usunąć rusztowania z nasionami komórek z inkubatora, odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć PBS przed dodaniem PBS (1 ml), aby umożliwić wizualizację żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Uwaga: PBS został użyty w tym protokole, aby wskaźnik czerwieni fenolowej obecny w pożywkach do hodowli komórkowych nie powodował autofluorescencji, a także dlatego, że wykonywano kalibrację przy innym pH. Jednak pożywki wolne od czerwieni fenolowej mogą być stosowane do długoterminowej analizy kultur komórkowych.</li>
	<li>Zanurz rusztowanie wysiewane komórkami w o różnym pH i monitoruj reakcję nanoczujników związanych z komórkami.</li>
	<li>Monitoruj pHi, określając stosunek intensywności fluorescencji z FAM i TAMRA, obserwując fluorescencję za pomocą mikroskopii konfokalnej (ryc. 3).</li>
</ol>
3.3 Lokalizacja nanosensora w komórkach ssaków
<ol>
	<li>Inkubować komórki za pomocą nanoczujników zawierających tylko barwnik FAM, jak opisano w sekcji 3.2 (dzieje się tak, ponieważ emisja fluorescencji TAMRA znajduje się w tym samym obszarze widmowym co LysoTracker Red). Przygotować te nanoczujniki w sposób opisany w sekcji 1.1, ale z pominięciem przygotowania i dodania TAMRA.</li>
	<li>Po upływie okresu dostarczania nanosensora rozcieńczyć roztwór podstawowy LysoTracker Red do długości fali 50 nM.</li>
	<li>Dodać podwielokrotność rozcieńczonego roztworu (2 μl) do komórek hodowanych na rusztowaniach PLGA.</li>
	<li>Inkubować komórki za pomocą LysoTracker Red przez 1 godzinę (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Po okresie inkubacji należy usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS (pH 7,4) przed zmianą pożywki na PBS (pH 7,4) (2 ml) w celu przygotowania do oglądania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Uwaga: Zamiast PBS można użyć pożywki wolnej od czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Dodać barwnik jądrowy Draq5 do PBS, tak aby końcowe stężenie wynosiło 5 μM i inkubować z komórkami przez 3 minuty (37 °C 5% CO2 ). Nie jest konieczna zmiana pożywki po okresie inkubacji z Draq5.</li>
	<li>Użyj lasera argonowego o długości fali 488 nm do wzbudzenia nanoczujników tylko FAM, lasera kryptonowego o długości fali 568 nm do wzbudzenia LysoTracker Red i lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm do wzbudzenia chromoforu Draq5 i obserwacji fluorescencji odpowiednio przy 500-530 nm, 580-600 nm, 650-750 nm (rysunek 3). Użyj skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć zbierania długości fal wzbudzenia.</li>
</ol>

<ol><li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li>
<li>Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precoating+of+elastomeric+tissue-engineering+scaffolds+increased+cellularity%2C+enhanced+extracellular+matrix+protein+production%2C+and+differentially+regulated+the+phenotypes+of+circulating+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).</li>
<li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).</li>
<li>Li, D., Xia, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+nanofibers%3A+Reinventing+the+wheel%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?</a> Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro+spinning%3A+Applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).</li>
<li>Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+monitoring+of+3D+in+vitro+cell+aggregation+using+an+optical+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).</li>
<li>Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Response+to+Interstitial+Flow%3A+A+State-of-the-Art+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).</li>
<li>Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for tissue engineering.</a> Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).</li>
<li>You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+degradation+behaviour+of+non-porous+ultra-fine+poly%28glycolic+acid%29%2Fpoly%28L-lactic+acid%29+fibres+and+porous+ultra-fine+poly%28glycolic+acid%29+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres.</a> Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).</li>
<li>Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+degradation+behaviors+of+electrospun+PGA%2C+PLGA+and+P%28LLA-CL%29+nanofibers+cultured+with%2Fwithout+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Multi-Functional+Materials+and+Structures%22%5BJournal%5D)">Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture.</a> Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).</li>
<li>Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+glucose+monitoring+and+control+in+a+rotating+wall+perfused+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).</li>
<li>Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+PLGA+fibre+sheets+incorporating+fluorescent+nanosensors%3A+self-reporting+scaffolds+for+application+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering.</a> Analytical Methods. 5 (1), (2013).</li>
<li>Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+membranes+for+highly+sensitive+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors.</a> Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).</li>
<li>Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+fluorescent+monitoring+of+the+degradation+of+polymeric+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering.</a> Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).</li>
<li>Blackwood, K. A., McKean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).</li>
<li>Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter+and+orientation+on+fibroblast+morphology+and+proliferation+on+electrospun+poly%28D%2CL-lactic-co-glycolic+acid%29+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes.</a> Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).</li>
<li>Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+scaffold+degradation+rate+on+three-dimensional+cell+growth+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis.</a> Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Inżynieria tkankowa dąży do stworzenia substytutów biologicznych, które mogą być stosowane zarówno jako modele tkanek in vivo, jak i w terapii zastępczej w celu naprawy, zastąpienia, utrzymania lub wzmocnienia funkcji określonej tkanki lub narządu. Syntetyczne substytuty są stosowane od wielu lat w celu zastąpienia lub pomocy w naprawie tkanek, ale często zawodzą one z powodu słabej integracji z tkanką gospodarza i/lub infekcji, co ostatecznie prowadzi do odrzucenia lub dalszej operacji rewizyjnej. Wyg...

Kluczową strategią w inżynierii tkankowej jest wykorzystanie biokompatybilnych materiałów do produkcji rusztowań, których morfologia przypomina tkankę, którą zamierza zastąpić, a także jest w stanie wspierać wzrost i funkcję komórek1,2. Rusztowanie zapewnia mechaniczne wsparcie, umożliwiając przyłączanie i proliferację komórek, a jednocześnie umożliwia migrację komórek przez szczeliny konstruktu komórkowego 3D. Rusztowanie musi również umożliwiać masowy transport składników odżywczych w komórkach i nie może hamować usuwania odpadów metabolicznych3.
Elektroprzędzenie okazało się obiecującą metodą wytwarzania polimerowych rusztowań zdolnych do wspierania wzrostu komórkowego4-6. Wytworzone włókniny elektroprzędzione włókna nadają się do wzrostu komórek, ponieważ często są porowate i umożliwiają interakcję komórka-komórka, a także migrację komórek przez szczeliny konstruktu komórkowego 3D7. Ważne jest monitorowanie żywotności komórek w okresie hodowli i zapewnienie, że żywotność komórek jest utrzymana przez cały czas trwania konstrukcji 3D. Na przykład warunki hodowli, takie jak tlen i pH, wymagają starannej kontroli, ponieważ w konstrukcji 3D mogą występować gradienty stężenia analitu. Bioreaktory lub systemy perfuzyjne mogą być stosowane do naśladowania warunków przepływu śródmiąższowego in vivo, a w rezultacie do zwiększenia transportu składników odżywczych i usuwania odpadów metabolicznych8. Pytanie, czy takie systemy zapewniają stałe warunki mikrośrodowiskowe, można rozwiązać, oceniając mikrośrodowisko komórkowe w czasie rzeczywistym.
Kluczowe wskaźniki mikrośrodowiska, które mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym, to: temperatura, skład chemiczny nośników komórkowych, stężenie rozpuszczonego tlenu i dwutlenku węgla, pH i wilgotność. Spośród tych wskaźników temperaturę można najłatwiej monitorować za pomocą sond in situ. Metody monitorowania pozostałych wymienionych wskaźników zwykle polegają na usunięciu podwielokrotności do pobierania próbek, a zatem zakłócają hodowlę komórkową i zwiększają ryzyko zanieczyszczenia. Poszukiwane są metody ciągłe w czasie rzeczywistym. Obecne metody monitorowania zwykle opierają się na instrumentach, które fizycznie sondują konstrukcję komórkową, takich jak monitor pH lub sonda tlenu. Jednak te inwazyjne metody mogą uszkodzić konstrukt komórkowy i zakłócić trwający eksperyment. Nieinwazyjne monitorowanie stężeń analitów w konstrukcji 3D może umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym różnych aspektów środowiskowych, takich jak wyczerpanie składników odżywczych9. Pozwoliłoby to na ocenę dostarczania składników odżywczych do głębszych regionów struktury i określenie, czy odpady metaboliczne są skutecznie usuwane10,11. Systemy, które próbują rozwiązać problem inwazyjności, zazwyczaj obejmują użycie komory perfuzyjnej, która przepuszcza pożywkę hodowlaną zarówno przez naczynie hodowlane, jak i do zewnętrznych czujników w celu monitorowania pH, tlenu i glukozy12. Rośnie zainteresowanie opracowywaniem czujników, które można bezpośrednio zintegrować z naczyniem hodowlanym, które nie wymagają usuwania podwielokrotności do pobierania próbek i jako takie zapewniłyby monitorowanie in situ.
Aby zaradzić takim niedociągnięciom w in-situ i nieinwazyjnym monitorowaniu warunków mikrośrodowiskowych, włączyliśmy nanoczujniki reagujące na analit do rusztowań elektroprzędzonych, aby wyprodukować rusztowania samoraportujące13. Rusztowania, które działają jako urządzenia detekcyjne poprzez monitorowanie aktywności fluorescencji, zostały przygotowane wcześniej, gdzie urządzenie czujnikowe było albo rzeczywistym rusztowaniem polimerowym utworzonym przez elektroprzędzenie, albo przez użycie barwnika reagującego na analit, który jest wprowadzany do polimeru przed utworzeniem rusztowania14,15. Jednak te czujniki mogą dawać błędne wyjścia optyczne spowodowane możliwymi zakłóceniami z innych analitów. Zastosowanie ratiometrycznego urządzenia pomiarowego, takiego jak te przygotowane w opisanym protokole, może potencjalnie wyeliminować te możliwe niekorzystne skutki i zapewnić odpowiedź specyficzną dla danego analitu.
Prezentowane tutaj elektrowirowane rusztowania zostały przygotowane z syntetycznego kopolimeru poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA), wybranego ze względu na aprobatę Agencji ds. Żywności i Leków (FDA), ze względu na jego biodegradowalne i biokompatybilne właściwości oraz doświadczenie we wspieraniu wzrostu i funkcji różnych typów komórek16-18. Przygotowane nanoczujniki reagujące na analit ratiometryczny reagują na pH. Nanoczujniki zawierają dwa barwniki fluorescencyjne w biokompatybilnej matrycy zol-żel, w której jeden barwnik, FAM, reaguje na pH, a drugi, TAMRA, działa jako wzorzec wewnętrzny, ponieważ nie reaguje na pH. Ponadto fluorescencja zarówno FAM, jak i TAMRA może być analizowana oddzielnie, ponieważ nie nakładają się one znacząco na siebie. Określenie stosunku emisji fluorescencji obu barwników przy określonych długościach fal daje odpowiedź pH niezależną od innych warunków środowiskowych. Samoraportujące się rusztowania mogą pozwolić na ponowną ocenę pH in situ i w czasie rzeczywistym bez zakłócania opracowanego modelu 3D. Wykazaliśmy, że te rusztowania są w stanie wspierać przyłączanie i proliferację komórek oraz pozostają wrażliwe na dany analit. Kinetyka kwaśnych produktów ubocznych w konstruktach inżynieryjnych pozostaje niedostatecznie zbadana, dlatego zastosowanie rusztowań reagujących na pH może znacznie ułatwić takiebadania19. Co więcej, wykorzystanie rusztowań samoraportujących do zastosowań w inżynierii tkankowej daje możliwość pełnego zrozumienia, monitorowania i optymalizacji wzrostu konstruktów tkanek modeli 3D in vitro, nieinwazyjnie i w czasie rzeczywistym.
Nanosensory reagujące na pH zostały również dostarczone do wewnątrzkomórkowego środowiska fibroblastów hodowanych na elektrowirowanych rusztowaniach PLGA. Stosunek emisji fluorescencji z barwników wykorzystano do monitorowania pH i porównano z samoraportującym rusztowaniem zawierającym nanoczujniki pH. Dostarczenie nanoczujników do komórek hodowanych w środowisku 3D może umożliwić monitorowanie stężenia analitu w głębi konstruktu w sposób nieniszczący. W związku z tym nanoczujniki mogą być realnym narzędziem do obrazowania do nieniszczącej oceny zachowania komórek w konstrukcjach 3D, umożliwiając długoterminową analizę. Badanie przesiewowe stężenia analitu w poszczególnych komórkach w konstrukcji 3D może zapewnić, że otrzymują one wystarczające stężenia składników odżywczych i tlenu. Monitorowanie parametrów procesu może pomóc w opracowaniu znormalizowanych technik skutecznego masowego transportu tlenu i składników odżywczych. Dostarczanie nanoczujników do środowiska wewnątrzkomórkowego i włączanie nanoczujników do rusztowań polimerowych można połączyć, aby umożliwić ocenę żywotności komórek, a także wydajności rusztowań w konstrukcjach 3D podczas procesu wzrostu tkanki. Może to prowadzić do poszerzenia wiedzy na temat tych konstruktów i postępu w wytwarzaniu biologicznie istotnych substytutów tkanek.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny dimetyloformamid (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu 50% (v/v) roztwór wodny</td><td>Alfa Aesar</td><td>35574</td><td>rozcieńczony do 30% (v/v) czystą wodą</td></tr><tr><td>TEOS</td><td>Sigma</td><td>13190-3</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>5-(i-6)-karboksyfluoresceina, ester sukcynimidylowy (FAM-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1311</td><td></td></tr><tr><td>6-karboksytetrametylorodamina, ester sukcynimidylowy (TAMRA-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Źródło Bioscience</td><td>Batch-213-101992</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus Ltd</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td> konfokalny TFA <td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica TCS-SP</td><td></td><td>wyposażony w lasery argonowe i kryptonowe oraz soczewkę zanurzeniową 63X 0,9NA w wodzie</td></tr><tr><td>Światło UV</td><td>UVLS28 UVP, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td>SB161-3 Miernik pH Jencons-PLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jenway model 3510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Buchi Rotary Parownik Wirówka R200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(nanoczujniki)</td>Wirówka <td>Hermle Z300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(hodowla komórkowa)</td><td>Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Whirlimixer Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwięki</td><td>FB11021 Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blacha aluminiowa</td><td>Uniwersytet</td><td></td><td></td> w Nottingham</tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych 35 mm</td><td>Iwaki</td><td>3000035</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 10 ml</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3 Komórki fibroblastów</td><td>Europejska kolekcja kultur</td><td></td><td></td>komórkowych</tr><tr><td>PLGA</td><td>Lakeshore Biomaterials</td><td>7525 DLG 7E</td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan pirydyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8535</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr></tbody></table>

rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Hodowla komórek w 3D na odpowiednich rusztowaniach ma na celu lepsze naśladowanie mikrośrodowiska in vivo i zwiększenie interakcji między komórkami. Uzyskany w ten sposób konstrukt komórkowy 3D może być często bardziej przydatny do badania zdarzeń molekularnych i interakcji komórka-komórka niż podobne eksperymenty badane w 2D. Aby stworzyć efektywne kultury 3D o wysokiej żywotności komórek w całym rusztowaniu, warunki hodowli, takie jak tlen i pH, muszą być dokładnie kontrolowane, ponieważ gradienty stężenia analitu mogą występować w całym konstrukcie 3D. W tym miejscu opisano metody przygotowania biokompatybilnych nanosensorów zol-żel reagujących na pH i ich włączenia do rusztowań elektroprzędzonych z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) wraz z ich późniejszym przygotowaniem do hodowli komórek ssaków. Rusztowania reagujące na pH mogą być używane jako narzędzia do określania pH mikrośrodowiskowego w konstrukcji komórkowej 3D. Ponadto szczegółowo opisujemy dostarczanie nanoczujników reagujących na pH do wewnątrzkomórkowego środowiska komórek ssaków, których wzrost był wspierany przez elektroprzędzone rusztowania PLGA. Cytoplazmatyczna lokalizacja nanoczujników reagujących na pH może być wykorzystana do monitorowania wewnątrzkomórkowego pH (pHi) podczas trwających eksperymentów.

Rozkład wielkości przygotowanych nanoczujników reagujących na pH scharakteryzowano za pomocą SEM; pomiary populacji obrazowanych nanoczujników wykazały, że ich wymiary nanometryczne mieszczą się w zakresie 240-470 nm (Rysunek 1A). Uzyskanie wąskiego i stosunkowo małego zakresu średnic jest zgodne z zastosowaniem metody Stöbera do otrzymywania nanocząstek. Wykazano, że zastosowanie zasadowego pH podczas syntezy nanocząstek, t.j. nanocząstek przygotowanych metodą Stöbera, pozwala na dobrą kontrolę...

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie nanosensorów reagujących na pH oraz samomobilizujących rusztowań, które mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym i in situ, aby pomóc w zrozumieniu warunków wpływających na wzrost komórek. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności biokompatybilnych nanosensorów reagujących na anality, które mogą monitorować pH za pomocą sygnałów fluorescencyjnych. W drugim kroku nanosensory reagujące na pH są włączane do polimerowych rusztowań wytworzonych metodą elektroprzędzenia, tworząc środowisko 3D, w którym można hodować i monitorować komórki.Następnie komórki ssaków osadza się na rusztowaniach wytworzonych metodą elektroprzędzenia, a do ich środowiska wewnątrzkomórkowego wprowadza się nanoczujniki w celu monitorowania pH wewnątrzkomórkowego. W trakcie eksperymentów uzyskano wyniki wykazujące zdolność nanoczujników wewnątrzkomórkowych i samoraportujących rusztowań do monitorowania pH w środowiskach inżynierii tkankowej na podstawie stosunków fluorescencji uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie elektronicznych sond pH, jest możliwość wykonywania pomiarów in situ i w czasie rzeczywistym bez konieczności zakłócania wzrostu komórek.Aby rozpocząć, należy przygotować fluorofory, rozpuszczając 1,5 mg fam SE w 1 ml dimetyloformamidu (DMF) w kolbie okrągłodennej. W drugiej kolbie rozpuść 1,5 mg Tamara SE w 1 ml DMF. Następnie do każdej kolby dodaj 1,5 ml aminopropylotrietoksysilanu i mieszaj zawartość w ciemności, w suchej atmosferze azotu w temperaturze 21 °C przez 24 godziny.Następnie dodaj 250 µL obu roztworów barwnika do mieszaniny zawierającej 6 mL etanolu i 4 mL wodorotlenku amonu w kolbie okrągłodennej. Mieszaj tę nową mieszaninę w temperaturze 21 °C przez jedną godzinę. Powoli dodaj do mieszaniny 0,5 mL ortokremlanu tetraetylu i kontynuuj mieszanie przez kolejne dwie godziny.W tym czasie należy spodziewać się zmętnienia mieszaniny, a następnie zebrać nanoczujniki za pomocą ewaporatora rotacyjnego i przechowywać je w szklanej fiolce w temperaturze 4°C do późniejszego użycia. Następnie dodać wysuszone nanoczujniki pH w stężeniu 5 mg/mL do buforów fosforanowych Sorensona o wartościach pH od 5,5 do 7,5 w odstępach 0,5 pH. Resuspendować nanoczujniki, mieszając próbki na wortexie przez 3 minuty, a następnie poddać je sonikacji przez 5 minut lub do momentu, aż roztwór stanie się mętny.Zbierz dane kalibracyjne, mierząc próbki przy długości fali wzbudzenia 488 nm dla FAM i 568 nm dla Tamara. Dla Tamara zarejestruj emisje w zakresie od 500 do 530 nm dla FAM oraz od 558 do 580 nm dla Tamara, a następnie oblicz stosunek maksimów emisji uzyskanych dla każdej wartości pH. Następnie przygotuj próbkę do obrazowania SEM, umieszczając próbkę nanoczujników na uchwycie do mikroskopu elektronowego pokrytym węglem i napylając cząsteczki złotem przez pięć minut w atmosferze argonu.Po napyleniu umieść próbki w mikroskopie elektronowym i dostosuj odległość roboczą, napięcie oraz powiększenie, aby zminimalizować ładowanie elektronowe i uzyskać najlepsze obrazy w dygestorium. Przygotuj 20% roztwór PLGA w dichlorometanie z dodatkiem 1% mrअधिकan formiate. Napełnij roztworem strzykawkę o pojemności 10 ml z tępą igłą do napełniania o rozmiarze 18G i bezpiecznie zamocuj ją w pompie strzykawkowej.Roztwór ten zostanie wykorzystany do przygotowania kontrolnych rusztowań PLGA; należy umieścić końcówkę igły w odległości 20 centymetrów od aluminiowej płyty kolektoryzującej o wymiarach 20 na 15 centymetrów, podłączyć elektrodę zasilacza wysokiego napięcia do końcówki strzykawki, a przewód uziemiający do aluminiowej płyty kolektoryzującej. Następnie należy włączyć zasilacz i ustawić napięcie na 12 kilowoltów. Potem włącz pompę strzykawkową i dozuj roztwór ze stałą prędkością przepływu 3,5 mililitrów na godzinę przez dwie godziny.Pozwoli to uzyskać głębokość rusztowania wynoszącą około 60 mikronów. Po zakończeniu procesu wyłącz urządzenie i pozostaw rusztowanie w dygestorium na 24 godziny, aby pozostałości rozpuszczalnika mogły odparować. Aby przygotować rusztowania z wbudowanymi nanoczujnikami reagującymi na pH, przygotuj roztwór PLGA w ten sam sposób co wcześniej, ale tym razem dodaj również pięć miligramów na mililitr nanoczujników.Następnie przeprowadź elektroprzędzenie materiału reagującego na pH, stosując te same ustawienia co poprzednio. Dalej, skalibruj responsywność rusztowania na pH, umieszczając niewielkie próbki wysuszonego rusztowania z wbudowanymi nanoczujnikami w płytkach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów i zanurzając je w 2 mililitrach buforów fosforanowych Sorensena o wartościach pH od 5,5 do 7,5 w przyrostach co 0,5, wykorzystując mikroskop konfokalny. Do wzbudzenia FAM użyj argonowego lasera o długości fali 488 nanometrów, a do wzbudzenia Tamara w nanoczujnikach – lasera kryptonowego o długości fali 568 nanometrów.Obserwuj emisję w zakresie od 500 do 530 nm dla FAM oraz od 558 do 580 nm dla Tamara, a następnie oblicz stosunek maksimów emisji uzyskanych dla każdej wartości pH. Najpierw wysterylizuj powierzchnie rusztowań za pomocą źródła światła UV z odległości ośmiu centymetrów przez 15 minut z każdej strony. Następnie w warunkach sterylnych przenieś rusztowania na płytkę hodowlaną z 12 studniami i umieść nad rusztowaniem stalowy pierścień o średnicy wewnętrznej jednego centymetra i średnicy zewnętrznej dwóch centymetrów.Następnie należy dodać PBS z 5% pen strep do wnętrza i na zewnątrz stalowego pierścienia i inkubować próbki przez noc. Następnego dnia należy usunąć PBS z 5% pen strep i przemyć rusztowania roztworem PBS.Następnie dodaj 500 µL pożywki do hodowli komórkowej po wewnętrznej i zewnętrznej stronie stalowego pierścienia i podgrzej płytkę w inkubatorze. Następnie zebrać interesujące komórki i przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/mL. Po przygotowaniu komórek usuń pożywkę z dołka i dodaj 1 mL świeżej pożywki po zewnętrznej stronie stalowego pierścienia.Następnie należy dodać 300 µL zawiesiny komórkowej do wnętrza stalowego pierścienia i delikatnie zakołysać płytką, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki. Płytkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i inkubować komórki przez wymagany czas. Odświeżając medium co dwa do trzech dni, wysiewamy komórki na rusztowania zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji i pozwalamy im rosnąć nieprzerwanie przez 72 godziny.Następnie opłucz komórki za pomocą PBS i dodaj 500 µL pożywki bezsurowiczej na zewnątrz pierścienia oraz 300 µL do wnętrza pierścienia. Inkubuj płytkę przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Przygotuj roztwór A, dodając 5 mg nanoczujników do 50 µL optimum i krótko wierzchołkując.Następnie przygotowano roztwór B, dodając 5 µL lipectomy 2000 do 45 µL Optum, i inkubowano mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie do mieszaniny roztworu B dodano roztwór A i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut w celu utworzenia roztworu C, będącego kompleksem liposomów nanoczujnika. Wyjęto płytkę z inkubatora i naniesiono 100 µL roztworu kompleksu do wnętrza stalowego pierścienia.Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubuj komórki z kompleksami odczynnika do lipektomii przez trzy godziny po inkubacji. Odsuń medium i dwukrotnie przemyj komórki podgrzanym PBS przed zanurzeniem rusztowania z osadzonymi komórkami w buforach o różnych wartościach pH, aby monitorować odpowiedź nanoczujników. Następnie przeprowadź obrazowanie komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, aby śledzić lokalizację nanoczujników wewnątrz komórek ssaków.W pierwszej kolejności należy przygotować i dostarczyć wyłącznie nanosensory zawierające fam do komórek osadzonych na rusztowaniach z PLGA. Następnie dodać 2 µL Lyotracker Red o stężeniu 50 nM do 300 µL medium i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C po okresie inkubacji. Usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki za pomocą PBS.Następnie dodaj 2 µL PBS lub innego medium pozbawionego czerwieni fenolowej, aby pokryć komórki podczas obrazowania konfokalnego. Dalej, dodaj do PBS 5 µM barwnika jądrowego DRAK5 i inkubuj z komórkami przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Po trzech minutach wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją na stole mikroskopu konfokalnego w celu wykonania obrazowania; obrazuj nanoczujniki, organelle kwasowe oraz jądro, wykorzystując różne długości fal wzbudzenia i emisji zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, stosując skanowanie sekwencyjne, aby uniknąć zbierania fal wzbudzenia. Rozkład wielkości przygotowanych pH-responsywnych nanoczujników scharakteryzowano za pomocą SEM, gdzie zmierzono populację obrazowanych nanoczujników, ustalając, że ich wymiary nanometryczne mieszczą się w zakresie od 240 do 470 nm.Po lewej stronie przedstawiono obraz włókien PLGA otrzymanych metodą elektroprzędzenia, a po prawej włókna PLGA z nanoczujnikami. Mikrografie SEM włókien stanowią dowód na obecność nanoczujników na ich powierzchni. Mogą one być jednak również wbudowane wewnątrz włókien rusztowania.Po przędzeniu elektrostatycznym nanoczujniki zachowują zdolność do pozostania aktywnymi optycznie i chemicznie, co przedstawiono tutaj w powiązaniu z włóknami rusztowania. Po lewej stronie widoczny jest barwnik FAM w kolorze zielonym, a po prawej barwnik TAMRA w kolorze czerwonym. Stosunek intensywności fluorescencji pozwala na wyznaczenie krzywej kalibracyjnej, jak pokazano tutaj.Nanosensory oceniane osobno oraz po wbudowaniu w rusztowania z PLGA otrzymane metodą elektroprzędzenia wykazywały analogiczne wyniki, co dowodzi, że nanosensory zachowują swoją aktywność optyczną po wbudowaniu w rusztowania. Wbudowane nanosensory również wykazywały prawidłową i odwracalną odpowiedź na zmiany wartości pH podczas naprzemiennego stosowania buforów o pH 5,5 i 7,5. Stosunek fam/Tamra reagował w sposób przewidywalny w każdym pokazanym przypadku.Oto obrazy konfokalne fibroblastów, do których nanoczujniki zostały dostarczone wewnątrzkomórkowo za pomocą odczynnika do transfekcji. Punktowa kolokalizacja barwników fam i Tamara sugeruje, że barwniki pozostały uwięzione w matrycy nanoczujnika. Dostarczenie nanoczujników do wnętrza komórek można potwierdzić poprzez pomiar stosunku fam/Tamara w komórkach umieszczonych w różnych buforach.Jak widać, stosunek ten wzrasta podczas pomiaru nanoczujników opartych na rusztowaniu, lecz pozostaje stały w przypadku pomiarów czujników wewnątrz komórek. Po opracowaniu tej techniki badacze z zakresu inżynierii tkankowej będą mogli badać in situ i w czasie rzeczywistym mikrośrodowiskowe zmiany pH wewnątrzkomórkowego w trójwymiarowych konstruktach komórkowych, nie zakłócając przebiegu prowadzonego eksperymentu.

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Szkielety z samodzielnym raportowaniem do 3-wymiarowej hodowli komórek

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.

Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Minimalizacja zmienności frakcji cząstek w granulowanych rusztowaniach ułatwia powtarzalne eksperymenty. W pracy opisano metody generowania rusztowań ziarnistych o kontrolowanych frakcjach cząstek do zastosowań w inżynierii tkankowej in vitro.

Kontrolowanie frakcji cząstek w mikroporowatych rusztowaniach z wyżarzonymi cząstkami do hodowli komórek 3D

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Sferoidy komórkowe były uważane za jeden z potencjalnych modeli w dziedzinie zastosowań biologicznych. W tym artykule opisano protokoły skalowalnego generowania sferoid komórkowych za pomocą urządzenia do montażu akustycznego 3D, które zapewnia wydajną metodę solidnego i szybkiego wytwarzania jednolitych sferoid komórkowych.

Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Protokół ten dokumentuje wytwarzanie i montaż SPOT, wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach, w formatach 96- i 384-dołkowych. Szczegółowo opisuje również proces wysiewu dla SPOT, zarówno ręczny, jak i przy użyciu dostępnego na rynku urządzenia do obsługi cieczy.

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Poznaj metodę tworzenia samoraportujących rusztowań PLGA z nanoczujnikami pH do monitorowania mikrośrodowiska komórkowego w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia nieinwazyjną analizę warunków wzrostu komórek w trójwymiarowej hodowli.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Przeglądaj więcej filmów