Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie nanosensorów reagujących na pH oraz samomobilizujących rusztowań, które mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym i in situ, aby pomóc w zrozumieniu warunków wpływających na wzrost komórek. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności biokompatybilnych nanosensorów reagujących na anality, które mogą monitorować pH za pomocą sygnałów fluorescencyjnych. W drugim kroku nanosensory reagujące na pH są włączane do polimerowych rusztowań wytworzonych metodą elektroprzędzenia, tworząc środowisko 3D, w którym można hodować i monitorować komórki.

Następnie komórki ssaków osadza się na rusztowaniach wytworzonych metodą elektroprzędzenia, a do ich środowiska wewnątrzkomórkowego wprowadza się nanoczujniki w celu monitorowania pH wewnątrzkomórkowego. W trakcie eksperymentów uzyskano wyniki wykazujące zdolność nanoczujników wewnątrzkomórkowych i samoraportujących rusztowań do monitorowania pH w środowiskach inżynierii tkankowej na podstawie stosunków fluorescencji uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie elektronicznych sond pH, jest możliwość wykonywania pomiarów in situ i w czasie rzeczywistym bez konieczności zakłócania wzrostu komórek.

Aby rozpocząć, należy przygotować fluorofory, rozpuszczając 1,5 mg fam SE w 1 ml dimetyloformamidu (DMF) w kolbie okrągłodennej. W drugiej kolbie rozpuść 1,5 mg Tamara SE w 1 ml DMF. Następnie do każdej kolby dodaj 1,5 ml aminopropylotrietoksysilanu i mieszaj zawartość w ciemności, w suchej atmosferze azotu w temperaturze 21 °C przez 24 godziny.

Następnie dodaj 250 µL obu roztworów barwnika do mieszaniny zawierającej 6 mL etanolu i 4 mL wodorotlenku amonu w kolbie okrągłodennej. Mieszaj tę nową mieszaninę w temperaturze 21 °C przez jedną godzinę. Powoli dodaj do mieszaniny 0,5 mL ortokremlanu tetraetylu i kontynuuj mieszanie przez kolejne dwie godziny.

W tym czasie należy spodziewać się zmętnienia mieszaniny, a następnie zebrać nanoczujniki za pomocą ewaporatora rotacyjnego i przechowywać je w szklanej fiolce w temperaturze 4°C do późniejszego użycia. Następnie dodać wysuszone nanoczujniki pH w stężeniu 5 mg/mL do buforów fosforanowych Sorensona o wartościach pH od 5,5 do 7,5 w odstępach 0,5 pH. Resuspendować nanoczujniki, mieszając próbki na wortexie przez 3 minuty, a następnie poddać je sonikacji przez 5 minut lub do momentu, aż roztwór stanie się mętny.

Zbierz dane kalibracyjne, mierząc próbki przy długości fali wzbudzenia 488 nm dla FAM i 568 nm dla Tamara. Dla Tamara zarejestruj emisje w zakresie od 500 do 530 nm dla FAM oraz od 558 do 580 nm dla Tamara, a następnie oblicz stosunek maksimów emisji uzyskanych dla każdej wartości pH. Następnie przygotuj próbkę do obrazowania SEM, umieszczając próbkę nanoczujników na uchwycie do mikroskopu elektronowego pokrytym węglem i napylając cząsteczki złotem przez pięć minut w atmosferze argonu.

Po napyleniu umieść próbki w mikroskopie elektronowym i dostosuj odległość roboczą, napięcie oraz powiększenie, aby zminimalizować ładowanie elektronowe i uzyskać najlepsze obrazy w dygestorium. Przygotuj 20% roztwór PLGA w dichlorometanie z dodatkiem 1% mrअधिकan formiate. Napełnij roztworem strzykawkę o pojemności 10 ml z tępą igłą do napełniania o rozmiarze 18G i bezpiecznie zamocuj ją w pompie strzykawkowej.

Roztwór ten zostanie wykorzystany do przygotowania kontrolnych rusztowań PLGA; należy umieścić końcówkę igły w odległości 20 centymetrów od aluminiowej płyty kolektoryzującej o wymiarach 20 na 15 centymetrów, podłączyć elektrodę zasilacza wysokiego napięcia do końcówki strzykawki, a przewód uziemiający do aluminiowej płyty kolektoryzującej. Następnie należy włączyć zasilacz i ustawić napięcie na 12 kilowoltów. Potem włącz pompę strzykawkową i dozuj roztwór ze stałą prędkością przepływu 3,5 mililitrów na godzinę przez dwie godziny.

Pozwoli to uzyskać głębokość rusztowania wynoszącą około 60 mikronów. Po zakończeniu procesu wyłącz urządzenie i pozostaw rusztowanie w dygestorium na 24 godziny, aby pozostałości rozpuszczalnika mogły odparować. Aby przygotować rusztowania z wbudowanymi nanoczujnikami reagującymi na pH, przygotuj roztwór PLGA w ten sam sposób co wcześniej, ale tym razem dodaj również pięć miligramów na mililitr nanoczujników.

Następnie przeprowadź elektroprzędzenie materiału reagującego na pH, stosując te same ustawienia co poprzednio. Dalej, skalibruj responsywność rusztowania na pH, umieszczając niewielkie próbki wysuszonego rusztowania z wbudowanymi nanoczujnikami w płytkach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów i zanurzając je w 2 mililitrach buforów fosforanowych Sorensena o wartościach pH od 5,5 do 7,5 w przyrostach co 0,5, wykorzystując mikroskop konfokalny. Do wzbudzenia FAM użyj argonowego lasera o długości fali 488 nanometrów, a do wzbudzenia Tamara w nanoczujnikach – lasera kryptonowego o długości fali 568 nanometrów.

Obserwuj emisję w zakresie od 500 do 530 nm dla FAM oraz od 558 do 580 nm dla Tamara, a następnie oblicz stosunek maksimów emisji uzyskanych dla każdej wartości pH. Najpierw wysterylizuj powierzchnie rusztowań za pomocą źródła światła UV z odległości ośmiu centymetrów przez 15 minut z każdej strony. Następnie w warunkach sterylnych przenieś rusztowania na płytkę hodowlaną z 12 studniami i umieść nad rusztowaniem stalowy pierścień o średnicy wewnętrznej jednego centymetra i średnicy zewnętrznej dwóch centymetrów.

Następnie należy dodać PBS z 5% pen strep do wnętrza i na zewnątrz stalowego pierścienia i inkubować próbki przez noc. Następnego dnia należy usunąć PBS z 5% pen strep i przemyć rusztowania roztworem PBS.

Następnie dodaj 500 µL pożywki do hodowli komórkowej po wewnętrznej i zewnętrznej stronie stalowego pierścienia i podgrzej płytkę w inkubatorze. Następnie zebrać interesujące komórki i przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/mL. Po przygotowaniu komórek usuń pożywkę z dołka i dodaj 1 mL świeżej pożywki po zewnętrznej stronie stalowego pierścienia.

Następnie należy dodać 300 µL zawiesiny komórkowej do wnętrza stalowego pierścienia i delikatnie zakołysać płytką, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki. Płytkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i inkubować komórki przez wymagany czas. Odświeżając medium co dwa do trzech dni, wysiewamy komórki na rusztowania zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji i pozwalamy im rosnąć nieprzerwanie przez 72 godziny.

Następnie opłucz komórki za pomocą PBS i dodaj 500 µL pożywki bezsurowiczej na zewnątrz pierścienia oraz 300 µL do wnętrza pierścienia. Inkubuj płytkę przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Przygotuj roztwór A, dodając 5 mg nanoczujników do 50 µL optimum i krótko wierzchołkując.

Następnie przygotowano roztwór B, dodając 5 µL lipectomy 2000 do 45 µL Optum, i inkubowano mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie do mieszaniny roztworu B dodano roztwór A i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut w celu utworzenia roztworu C, będącego kompleksem liposomów nanoczujnika. Wyjęto płytkę z inkubatora i naniesiono 100 µL roztworu kompleksu do wnętrza stalowego pierścienia.

Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubuj komórki z kompleksami odczynnika do lipektomii przez trzy godziny po inkubacji. Odsuń medium i dwukrotnie przemyj komórki podgrzanym PBS przed zanurzeniem rusztowania z osadzonymi komórkami w buforach o różnych wartościach pH, aby monitorować odpowiedź nanoczujników. Następnie przeprowadź obrazowanie komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, aby śledzić lokalizację nanoczujników wewnątrz komórek ssaków.

W pierwszej kolejności należy przygotować i dostarczyć wyłącznie nanosensory zawierające fam do komórek osadzonych na rusztowaniach z PLGA. Następnie dodać 2 µL Lyotracker Red o stężeniu 50 nM do 300 µL medium i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C po okresie inkubacji. Usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki za pomocą PBS.

Następnie dodaj 2 µL PBS lub innego medium pozbawionego czerwieni fenolowej, aby pokryć komórki podczas obrazowania konfokalnego. Dalej, dodaj do PBS 5 µM barwnika jądrowego DRAK5 i inkubuj z komórkami przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Po trzech minutach wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją na stole mikroskopu konfokalnego w celu wykonania obrazowania; obrazuj nanoczujniki, organelle kwasowe oraz jądro, wykorzystując różne długości fal wzbudzenia i emisji zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, stosując skanowanie sekwencyjne, aby uniknąć zbierania fal wzbudzenia. Rozkład wielkości przygotowanych pH-responsywnych nanoczujników scharakteryzowano za pomocą SEM, gdzie zmierzono populację obrazowanych nanoczujników, ustalając, że ich wymiary nanometryczne mieszczą się w zakresie od 240 do 470 nm.

Po lewej stronie przedstawiono obraz włókien PLGA otrzymanych metodą elektroprzędzenia, a po prawej włókna PLGA z nanoczujnikami. Mikrografie SEM włókien stanowią dowód na obecność nanoczujników na ich powierzchni. Mogą one być jednak również wbudowane wewnątrz włókien rusztowania.

Po przędzeniu elektrostatycznym nanoczujniki zachowują zdolność do pozostania aktywnymi optycznie i chemicznie, co przedstawiono tutaj w powiązaniu z włóknami rusztowania. Po lewej stronie widoczny jest barwnik FAM w kolorze zielonym, a po prawej barwnik TAMRA w kolorze czerwonym. Stosunek intensywności fluorescencji pozwala na wyznaczenie krzywej kalibracyjnej, jak pokazano tutaj.

Nanosensory oceniane osobno oraz po wbudowaniu w rusztowania z PLGA otrzymane metodą elektroprzędzenia wykazywały analogiczne wyniki, co dowodzi, że nanosensory zachowują swoją aktywność optyczną po wbudowaniu w rusztowania. Wbudowane nanosensory również wykazywały prawidłową i odwracalną odpowiedź na zmiany wartości pH podczas naprzemiennego stosowania buforów o pH 5,5 i 7,5. Stosunek fam/Tamra reagował w sposób przewidywalny w każdym pokazanym przypadku.

Oto obrazy konfokalne fibroblastów, do których nanoczujniki zostały dostarczone wewnątrzkomórkowo za pomocą odczynnika do transfekcji. Punktowa kolokalizacja barwników fam i Tamara sugeruje, że barwniki pozostały uwięzione w matrycy nanoczujnika. Dostarczenie nanoczujników do wnętrza komórek można potwierdzić poprzez pomiar stosunku fam/Tamara w komórkach umieszczonych w różnych buforach.

Jak widać, stosunek ten wzrasta podczas pomiaru nanoczujników opartych na rusztowaniu, lecz pozostaje stały w przypadku pomiarów czujników wewnątrz komórek. Po opracowaniu tej techniki badacze z zakresu inżynierii tkankowej będą mogli badać in situ i w czasie rzeczywistym mikrośrodowiskowe zmiany pH wewnątrzkomórkowego w trójwymiarowych konstruktach komórkowych, nie zakłócając przebiegu prowadzonego eksperymentu.