2.8: Metoda ELISA

Test ELISA lub test immunoenzymatyczny jest szeroko stosowaną metodą określania obecności lub braku określonego białka docelowego.

Poprzez serię etapów mycia i wiązania, przeciwciało sprzężone lub połączone z enzymem rozpozna docelowe białko na dnie 96-dołkowej płytki. Po dodaniu substratu do próbki zachodzi reakcja enzymatyczna, powodująca zmianę koloru, która umożliwia identyfikację i kwantyfikację białka docelowego.

Zanim omówimy, jak przeprowadzić test ELISA, zapoznajmy się ze sprzętem i odczynnikami, które będą Ci potrzebne.

Miejscem reakcji ELISA jest zazwyczaj 96-dołkowa płaska płytka denna. Płaskie dna studzienek ułatwią równomierne rozprowadzenie próbki eksperymentalnej, a także wychwytywanie i wykrywanie przeciwciał.

Testy ELISA wykrywają obecność określonych białek docelowych w eksperymentalnych roztworach wodnych. Mocz, pożywki do hodowli komórkowych i surowica są powszechnymi próbkami eksperymentalnymi.

W teście ELISA przeciwciało, które bezpośrednio wiąże się z białkiem docelowym, jest przeciwciałem pierwszorzędowym. Ma wysokie powinowactwo, czyli wysoką zdolność do ścisłego wiązania się z epitopem - określonym regionem - docelowego białka. Przeciwciało pierwszorzędowe jest zwykle nieznakowane lub niesprzężone.

Jak wspomniano, przeciwciała w większości wiążą się z białkami docelowymi poprzez wysokie powinowactwo do określonego epitopu. Jednak próbka eksperymentalna może zawierać fragmenty komórek, które wyrażają niespecyficzne miejsca wiązania, miejsca, które mogą wiązać stały lub niespecyficzny dla epitopu region przeciwciał detektora.

Dlatego dodanie buforu blokującego jest niezbędne w teście ELISA, aby pokryć wszelkie niespecyficzne miejsca wiązania w próbkach eksperymentalnych. W przeciwnym razie mogą wystąpić reakcje enzymatyczne w studzienkach, które nie zawierają białka docelowego, co da fałszywie dodatnie dane!

Przeciwciało drugorzędowe w teście ELISA to przeciwciało używane do rozpoznawania przeciwciała pierwszorzędowego. To przeciwciało jest zwykle sprzężone z enzymem. Czasami przeciwciało drugorzędowe ma dziwną nazwę. Na przykład, jeśli przeciwciało drugorzędowe wytworzone lub wyhodowane u osła w celu rozpoznania przeciwciała pierwszorzędowego wyhodowanego u kozy, przeciwciało drugorzędowe będzie nazywane przeciwciałem przeciwko kozicy osła. Jeśli chodzi o nazewnictwo przeciwciał drugorzędowych, pierwsza nazwa wskazuje na organizm, który wytworzył przeciwciało drugorzędowe, a druga nazwa reprezentuje organizm, który wytwarza przeciwciało pierwszorzędowe.

Potrzebny będzie również substrat, który wiąże się z miejscem aktywnym enzymu połączonego z przeciwciałem drugorzędowym. Reakcja chemiczna, która zachodzi podczas tej reakcji, powoduje zmianę koloru bezbarwnego podłoża. Ten tak zwany test kolorymetryczny pozwala na identyfikację i ilościowe określenie obecności białka docelowego.

Reakcja enzymatyczna będzie trwała tak długo, jak długo dostępny będzie substrat. Dlatego po krótkim okresie inkubacji do studzienek dodaje się roztwór zatrzymujący, który powoduje kolejną zmianę koloru, wskazując, że reakcja została w rzeczywistości zatrzymana.

Czytnik mikropłytek zostanie użyty do ilościowego określenia stężenia białka będącego przedmiotem zainteresowania w każdym dołku poprzez odczyt absorbancji, czyli ilości zabarwionego produktu w każdym dołku. Absorbancja jest proporcjonalna do ilości obecnego białka docelowego.

Teraz, gdy masz już gotowy cały sprzęt, przeprowadźmy test ELISA!

Aby przeprowadzić standardowy lub bezpośredni test ELISA, najpierw pokryj dołki 96-dołkowej płytki docelowym białkiem rozcieńczonym w buforze powlekającym. Również w tym czasie utrzymuj kontrolę pozytywną i negatywną.

Po inkubacji powlekanej płytki wystarczająco długo, aby białko miało czas na całkowitą adsorpcję lub przyczepienie się do dna płytki, zrzuć nadmiar roztworu powlekającego szybkim ruchem nadgarstka.

Następnie zablokuj wszelkie możliwe niespecyficzne wiązanie lub sygnał tła poprzez inkubację każdej studzienki w buforze blokującym.

Teraz zrzuć bufor blokujący i umyj studzienki krótką inkubacją w temperaturze pokojowej w buforze soli fizjologicznej lub PBS i 1% BSA.

Podczas przepłukiwania studzienek PBS, należy przygotować rozcieńczenia znanego stężenia białka docelowego, aby utworzyć krzywą wzorcową. Absorbancja studzienek o krzywej wzorcowej, które zawierają znane stężenia białka docelowego, zostanie wykorzystana do obliczenia stężenia białka docelowego w dołkach próbek eksperymentalnych na podstawie porównania absorbancji studzienek na próbki z absorbancją dołków krzywej wzorcowej.

Teraz nadszedł czas, aby dodać przeciwciało wykrywające lub pierwszorzędowe!

Płytka jest następnie inkubowana, zwykle w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wystarczające związanie się przeciwciała z białkiem docelowym w celu późniejszego wykrycia i ilościowego określenia białka.

Po tej inkubacji nadmiar przeciwciał jest usuwany, a studzienki są na krótko myte PBS.

Przeciwciało drugorzędowe jest następnie dodawane do płytki, a płytka jest ponownie inkubowana – zwykle na obrotowej platformie – aby umożliwić związanie przeciwciała drugorzędowego. Kroki mycia powtarza się jak poprzednio.

Następnie dodaj substrat do płytki, aby zobaczyć, które studzienki zawierają docelowe białko. Przykryć płytkę, aby chronić reakcję przed światłem, a następnie po krótkiej inkubacji zatrzymać reakcję roztworem zatrzymującym.

Na koniec umieść płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję lub ilość kolorowego roztworu w każdym dołku. Będziesz musiał wybrać, które studnie chcesz, aby czytelnik przeanalizował. Gdy przyrząd zakończy odczytywanie płytki, zostanie wyświetlony odczyt absorbancji dla każdej studzienki.

Należy zauważyć, że każdy zestaw ELISA ma limit wykrywalności. Oznacza to, że można dokładnie określić tylko stężenia białka powyżej i poniżej określonych limitów. Bardzo małe stężenia białka są zwykle zbyt bliskie poziomom tła niespecyficznego barwienia, podczas gdy bardzo wysokie stężenia mogą wskazywać, że nadmiar białka lub przeciwciała nie został odpowiednio wypłukany w tej próbce.

Dlaczego więc warto przeprowadzić test ELISA? Rzućmy okiem na kilka typowych zastosowań.

Prawdopodobnie najczęstszym rodzajem wykonywanego testu ELISA jest test ELISA typu kanapkowego.

W teście ELISA typu sandwich 96-dołkowa płytka jest najpierw pokryta pierwszorzędowym przeciwciałem, które rozpoznaje docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania.

W tym eksperymencie pożywki do hodowli komórkowych pobrane z ludzkich linii komórkowych wytwarzających przeciwciała zostały posiane przez zautomatyzowany system na 96-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych pierwotnym przeciwciałem, które rozpoznaje ludzkie przeciwciała.

Po zmyciu nadmiaru próbki za pomocą PBS dodaje się przeciwciało drugorzędowe związane z enzymem, a następnie substrat kolorymetryczny.

Absorbancję mierzy się następnie w taki sam sposób, jak w przypadku typowego testu ELISA. Na przykład w tym eksperymencie dane ELISA zostaną wykorzystane do określenia, które linie komórkowe wytwarzają ludzkie przeciwciało o najwyższym powinowactwie do docelowego antygenu, czyli najlepszej zdolności do dokładnego wiązania się z nim.

Test ciążowy dostępny bez recepty to jeden z rodzajów testu ELISA typu kanapkowego.

Kiedy mocz kobiety w ciąży zostanie dodany do testu, pierwotne przeciwciała enzymatyczne przyłączone do testu zwiążą hormon ciążowy hCG, jeśli jest on obecny. Jeśli kobieta jest w ciąży, wystąpi reakcja substrat-enyzme, gdy przeciwciała pierwszorzędowe zostaną rozpoznane przez przeciwciała drugorzędowe związane z substratem w miejscu testowym i pojawi się kolorowa linia.

Innym rodzajem testu ELISA jest kompetycyjny ELISA, który można wykorzystać do wykrycia obecności przeciwciał.

Jeśli interesujące przeciwciała są obecne w próbce, zwiążą się z białkiem docelowym przyczepionym do dna płytki. Później, gdy do płytki zostaną dodane przeciwciała wykrywające związane z enzymami, przeciwciała połączone z enzymem znajdą niewiele białek do związania się lub nie znajdą ich wcale; Zostaną one "wyprzedzone" przez przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania w próbce doświadczalnej.

W konkurencyjnym teście ELISA kolorowe dołki wskazują próbki, które w rzeczywistości nie zawierają interesującego przeciwciała! Próbki osocza pacjenta są zwykle poddawane konkurencyjnemu testowi ELISA w celu określenia, czy w próbce obecne są przeciwciała przeciwko niektórym patogenom, takim jak wirus HIV.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do wykonywania testu ELISA. W tym filmie omówiliśmy: czym jest ELISA i jak działa; jaki sprzęt i odczynniki będą potrzebne do wykonania testu ELISA; i niektóre różne zastosowania testu. Dziękujemy za oglądanie i pamiętaj, aby nie dopuścić do nadmiernego rozwoju podłoża!