Name: Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Naucz się izolować pierwotne miofibroblasty z tkanki okrężnicy myszy i człowieka. Ta metoda umożliwia badanie funkcji komórek stromalnych w fizjologii przewodu pokarmowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 dla JY.

1. Uzyskaj tkankę jelita grubego
Mysz
Protokół przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach, szczegółowo opisujący uzasadnienie i cele badań, został przedłożony i zatwierdzony przez nasze instytucjonalne Biuro Nadzoru nad Badaniami na Zwierzętach.
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji wziewnym izofluranem, a następnie zwichnięciu szyjki macicy.</li>
	<li>Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej, wycofaj jelito cienkie i zidentyfikuj okrężnicę. Cofnij pęcherz moczowy i macicę (jeśli są obecne) z boku i zidentyfikuj kość łonową i przetnij ją cienkimi nożyczkami, aby odsłonić odbytnicę.</li>
	<li>Wypreparuj krezkę grzbietową odbytnicy od okrężnicy i zmobilizuj okrężnicę od odbytu do jelita ślepego, a następnie przeciąć ją, aby odłączyć okrężnicę od jelita cienkiego.</li>
	<li>Umieścić próbkę w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml lodowatym PBS i kilkakrotnie przepłucz światło jelita grubego, aby usunąć jego zawartość, a następnie rozetnij okrężnicę wzdłuż za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Umieścić okrężnicę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml lodowatego PBS. Dwukropek nie musi być umieszczony w żadnej określonej orientacji. Umyj okrężnicę, wymieniając PBS, aż płyn będzie klarowny i nie będzie zawierał cząstek stałych.</li>
</ol>
Człowiek
Protokół pobierania tkanek ludzkich od pacjentów chirurgicznych, szczegółowo opisujący znaczenie pozyskiwania tej tkanki, jak również ocenę potencjalnego ryzyka i korzyści, został przedłożony i zatwierdzony przez nasze instytucjonalne Biuro Programu Ochrony Badań Naukowych.
<ol>
	<li>Współpraca badawcza z chirurgiem jelita grubego jest niezbędna, aby móc pozyskać tkankę ludzką do swoich badań. Protokół uzyskania ludzkiej tkanki jelita grubego powinien zostać przedłożony i zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną.</li>
	<li>Przed zabiegiem chirurgicznym uzyskuje się pisemną świadomą zgodę pacjenta.</li>
	<li>Chirurg wykona resekcję jelita grubego w standardowy sposób. Po usunięciu okrężnicy od pacjenta próbka jest natychmiast przenoszona do patologii. Dostarczany jest przekrój ściany okrężnicy o pełnej grubości 0,5 cala, który nie jest potrzebny do oceny patologicznej i jest natychmiast umieszczany na lodowatym PBS. Próbka ta nie powinna zawierać krezki jelita grubego, a także należy usunąć przydatki epiploiczne, ponieważ obecność tłuszczu wpłynie na proces trawienia.</li>
</ol>
2. Nagie komórki nabłonkowe
<ol>
	<li>Inkubować całą okrężnicę myszy w 25 ml 5 mM EDTA w HBSS (temperatura pokojowa) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umieść rurkę stożkową w łaźni wytrząsającej o temperaturze 37 °C (250 obr./min) na 15 minut. Po 15 minutach ostrożnie wylej płyn i ponownie napełnij probówkę 25 ml 5 mM EDTA, powtórz w sumie 5 prań. W przypadku ludzkiej okrężnicy, po uzyskaniu od patologa 1/2 cala paska ściany okrężnicy, pokrój okrężnicę nożyczkami na cztery równe kawałki. Umieść dwa kawałki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a pozostałe dwa kawałki tkanki okrężnicy umieść w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie inkubować z 25 ml 5 mM EDTA w HBSS i przeprowadzić płukanie, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Opłucz okrężnicę dwukrotnie w 20 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Umieść tkankę okrężnicy myszy w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml RPMI-5, 10 U dyspazy i 2,000 U kolagenazy D (temperatura pokojowa). W przypadku ludzkiej tkanki jelita grubego należy użyć podwójnej ilości dypazy i kolagenazy (20 U dypazy, 4 000 U kolagenazy D).</li>
	<li>Umieść rurkę w łaźni powietrznej z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C zorientowanej pionowo (jeśli jest umieszczona poziomo, następuje zbyt duże napowietrzenie i uszkodzenie komórek). Wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez maksymalnie 60 min. Po ekspozycji na dypazę i kolagenazę D tkanka okrężnicy zacznie trawić, a tkanka okrężnicy zacznie wyglądać na żylastą. Zwykle trwa to około 30 minut. Kiedy okrężnica ma taki wygląd, usuń okrężnicę z enzymów.</li>
	<li>Potrząśnij każdą rurką w górę iw dół 2-4 razy, aby rozbić tkankę. Osadzać tkankę w proporcjach 200 x g w wirówce stołowej (4 °C) przez 5 minut. Ostrożnie odlej supernatant i wyrzuć.</li>
</ol>
3. Izolacja i hodowla miofibroblastów
<ol>
	<li>Zawiesić każdą osadkę, dodając 10 ml buforu do lizy ACK (47 °C). Ponownie odwirować przy 200 x g przez 5 minut (4 °C), odlać i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić każdą granulkę, dodając 10 ml RPMI-5 za pomocą pipety.</li>
	<li>Przepuścić połowę zawiesiny komórek (5 ml) przez sitko o oczkach 70 μm za pomocą pipety o pojemności 10 ml do naczynia poddanego działaniu TC o średnicy 100 mm. Następnie dodaj dodatkowe 15 ml RPMI-5. Powtórzyć z pozostałymi 5 ml zawiesiny komórkowej w innym naczyniu o średnicy 100 mm poddanej działaniu TC. Jedna okrężnica myszy da zatem dwie 100-milimetrowe szalki poddane działaniu TC. Jeden 1/2-calowy pasek ludzkiej tkanki okrężnicy da w sumie cztery 100-milimetrowe naczynia poddane działaniu TC.</li>
	<li>Umieścić szalki z kultur tkankowych w inkubatorze o stężeniu 10% CO2 w temperaturze 37 °C. Warunki hodowli są takie same dla mysich i ludzkich komórek pierwotnych.</li>
	<li>Po 3 godzinach delikatnie zmyj nieprzylegające komórki za pomocą dwóch zmian HBSS. Unoszące się zanieczyszczenia należy delikatnie zmyć. Komórki przylegające składają się z komórek nabłonkowych, makrofagów i miofibroblastów. Tydzień po wysiewie dzielą się tylko miofibroblasty, makrofagi i komórki nabłonkowe starzeją się po pierwszym pasażu. Dodaj świeży RPMI-5 i hoduj komórki w hodowli komórkowej.</li>
	<li>Komórki są pasażowane przez trypsynizację przez 5 minut i są dzielone w stosunku 2:1.</li>
</ol>
Skróty
HBSS: Zrównoważony roztwór soli Hanka; RPMI-5: Media Instytutu Pamięci Roswell Park; ACK: Chlorek amonu-potas; FCS: płodowa surowica cielęca; Poddany działaniu TC: poddany działaniu hodowli tkankowej
Rozwiązania
Bufor do lizy ACK - (4.15 g NH4Cl, 0.5 g KHCO3, 18.6 mg Na2EDTA, 400 ml H2O, dostosuj pH do 7.2-7.4 za pomocą 1 N HCl). Filtrować sterylizować przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. RPMI-5 - (do 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME w PBS).

<ol><li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li>
<li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-%7Balpha%7D+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li>
<li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li>
<li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li>
<li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li>
<li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li>
<li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li>
<li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li>
<li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-%2F-+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li>
<li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li>
<li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li>
<li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólna technika jest podobna w przypadku użycia okrężnicy myszy lub człowieka. Technika ta może być również stosowana do izolowania miofibroblastów z jelita cienkiego. Szczegółowe informacje dotyczące izolacji miofibroblastów z 1. mysz i 2. Jelito grube człowieka omówiono poniżej.
1. Dwukropek myszy
Irygacja okrężnicy myszy jest ułatwiona przez przymocowanie igły Popper o długości 4 cali i 16 G do jednego końca okrężnicy. Pomaga to również przy cięciu okrężnicy wzdłuż....

Regulacja funkcji przewodu pokarmowego (GI) obejmuje złożone, dynamiczne interakcje między warstwą śluzówkową a leżącą pod nią mezenchymą. Interakcje te zwykle służą utrzymaniu homeostazy, ale mogą również prowadzić do rozwoju stanów chorobowych w warunkach patologicznych1. Miofibroblasty to subpopulacja komórek zrębu znajdujących się pod warstwą nabłonkową, które komunikują się w sposób parakrynny z otaczającymi subpopulacjami komórek w celu regulacji szeregu krytycznych procesów przewodu pokarmowego, w tym regeneracji, naprawy i zwłóknienia błony śluzowej2.
Linia komórkowa 18Co jest przykładem linii komórkowej ludzkiego miofibroblastu okrężnicy, która jest szeroko stosowana do badania funkcji miofibroblastów, ponieważ ma wiele cech pierwotnych miofibroblastów in situ. Należą do nich ekspresja białek aktyny mięśni gładkich (α-SMA) i wimentyny, a także ekspresja szeregu receptorów powierzchniowych komórek, takich jak receptor naskórkowego czynnika wzrostu lub receptory kwasu lizofosfatydowego3,4. Ze względu na te wspólne cechy ultrastrukturalne, a także podobieństwa w funkcji biologicznej5, linia komórkowa 18Co była szeroko stosowana do badania funkcji miofibroblastów w kontekście wielu stanów chorobowych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit lub rak jelita grubego3,6. Istnieją jednak nieodłączne ograniczenia i obawy związane z korzystaniem z linii komórkowej. Należą do nich niestabilność genotypowa w czasie, która różnicuje linie komórkowe od komórek pierwotnych, zmieniając fenotyp i funkcję biologiczną komórki, w tym tempo wzrostu i interakcje z innymi populacjami komórek. Linie komórkowe nie mają również normalnych składników mikrośrodowiska przewodu pokarmowego (składników nabłonkowych, zrębowych i naczyniowych), co stanowi poważne ograniczenie w ich stosowaniu. W związku z tym wnioski wyciągnięte z eksperymentalnych badań linii komórkowych wymagają dalszej walidacji, aby zmniejszyć ryzyko błędnej interpretacji.
Pierwotne miofibroblasty można uzyskać z ludzkiej i mysiej tkanki okrężnicy, aby potwierdzić wyniki eksperymentów zidentyfikowanych w linii komórkowej7. Metoda ta została pierwotnie opisana przez Mahidę i wsp.8, a nasz protokół jest jedną z wielu dobrze opisanych technik, które można wykorzystać do wyizolowania pierwotnych miofibroblastów z mysiego i ludzkiego jelita grubego9. W przypadku dowolnego mysiego modelu choroby okrężnicy technika ta może być wykorzystana do wyizolowania pierwotnych miofibroblastów w celu zbadania, w jaki sposób oddziałują one z sąsiednimi komórkami lub przyczyniają się zarówno do normalnych, jak i patologicznych procesów żołądkowo-jelitowych10,11. Technika ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób miofibroblasty przyczyniają się do gojenia się błony śluzowej, zwłóknienia oraz rozwoju gruczolaków i raków jelita grubego. Pierwotne miofibroblasty można również uzyskać z ludzkiej tkanki okrężnicy, która została wycięta w czasie operacji z powodu łagodnych (nieswoiste zapalenie jelit, zwężenia, zapalenie uchyłków) lub złośliwych. Wyizolowane komórki pierwotne z ludzkiej i mysiej tkanki okrężnicy mogą być hodowane w hodowli komórkowej i wykorzystywane przez ograniczoną liczbę pasaży.

<table><tbody><tr><td>Nazwa odczynnika</td><td>Numer katalogowy</td><td>firmy</td><td>Komentarze (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Invitrogen/GIBCO</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>#1 088 858</td><td></td></tr><tr><td>4 in, 16 G Igła Popper z końcem</td><td>Fisher</td><td>#14-825-16K</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Miofibroblast to komórka zrębowa przewodu pokarmowego (GI), która zyskuje znaczną uwagę ze względu na swoją kluczową rolę w wielu funkcjach przewodu pokarmowego. Podczas gdy kilka linii komórkowych miofibroblastów jest dostępnych na rynku do badania tych komórek in vitro, wyniki badań z linii komórkowej wystawionej na eksperymentalne warunki hodowli komórkowej mają nieodłączne ograniczenia ze względu na nadmiernie redukcjonistyczny charakter pracy. Zastosowanie pierwotnych miofibroblastów daje ogromną przewagę w zakresie potwierdzania wyników eksperymentalnych zidentyfikowanych w linii komórkowej. Izolacja pierwotnych miofibroblastów z modelu zwierzęcego pozwala na badanie miofibroblastów w warunkach, które bardziej naśladują badany stan chorobowy. Izolacja pierwotnych miofibroblastów z ludzkiej tkanki okrężnicy dostarcza prawdopodobnie najistotniejszych danych eksperymentalnych, ponieważ komórki pochodzą bezpośrednio od pacjentów z chorobą podstawową. Opisujemy dobrze ugruntowaną technikę, którą można wykorzystać do wyizolowania pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy. Te izolowane komórki zostały scharakteryzowane jako alfa-mięśni gładkich aktyny i wimentyny dodatnie oraz desminy-ujemne, zgodne z podnabłonkowymi miofibroblastami jelitowymi. Pierwotne komórki miofibroblastów mogą być hodowane w hodowli komórkowej i wykorzystywane do celów eksperymentalnych przez ograniczoną liczbę pasaży.

Po wyizolowaniu pierwotne ludzkie myofibroblasty mogą być hodowane in vitro i wykorzystywane przez ograniczoną liczbę pasaży (do 4. pasażu). Komórki te charakteryzują się pozytywnym wynikiem w kierunku α-aktyny mięśni gładkich oraz vimentyny i negatywnym w kierunku desminy (Rysunek 1A), co jest spójne z cechami myofibroblastów podnabłonkowych jelit5,7. Wykazują one również charakterystyczną morfologię gwiaździstą (Rysunek 1B). Pierwotne myofibroblasty mogą następnie służyć do ...

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie pierwotnych myofibroblastów z tkanki okrężnicy mysiej lub ludzkiej. Osiąga się to poprzez pobranie okrężnicy od myszy dawcy i przepłukanie jej lodowatym PBS. Następnie, w serii przemyć i obróbek enzymatycznych, usuwa się komórki nabłonkowe.Następnie zawiesinę komórek nabłonkowych wysiewa się na szalki hodowlane i poddaje inkubacji. Na koniec komórki nieprzylegające są wypłukiwane w celu wyizolowania myofibroblastów. W rezultacie można uzyskać wyniki potwierdzające izolację pierwotnych komórek myofibroblastów za pomocą barwienia immunohistochemicznego. Procedurę tę zaprezentuje technik z mojego laboratorium.Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Biuro Nadzoru nad Badaniami na Zwierzętach Uniwersytetu Kalifornijskiego (University of California Office of Animal Research Oversight) z wykorzystaniem myszy, która została poddana eutanazji poprzez inhalację isofluoranu, a następnie zwichnięcie szyi. Należy rozpocząć od wykonania nacięcia wzdłuż linii środkowej brzucha. Odsunąć jelita i zlokalizować okrężnicę, odsunąć pęcherz moczowy bocznie i zidentyfikować kość łonową za pomocą precyzyjnych nożyczek.Przetnij kość, aby odsłon

isolation-of-primary-myofibroblasts-from-mouse-and-human-colon-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja pierwotnych miofibublastów z tkanki jelita grubego myszy i człowieka

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Opisano protokół ekstrakcji pierwotnych komórek ludzkich z chirurgicznego guza jelita grubego i normalnych tkanek. Wyizolowane komórki są następnie hodowane na miękkich elastycznych podłożach (hydrożele poliakrylamidowe) funkcjonalizowanych przez białko macierzy zewnątrzkomórkowej i osadzonych w fluorescencyjnych mikrogranulkach. Cytometria trakcyjna jest wykonywana w celu oceny komórkowych naprężeń skurczowych.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów/miofibroblastów (MF) z zamrożonych komórek tkanki żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy o fenotypie MF. Komórki te wyrażają CD90, α-SMA i wimentynę. MF mogą być używane do różnych testów funkcjonalnych, w tym aktywności enzymatycznej i produkcji cytokin.

Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych, które znajdują się w blaszce właściwej jelita grubego, poprzez enzymatyczne trawienie tkanki za pomocą kolagenazy. Protokół ten pozwala na efektywną izolację komórek jednojądrzastych, w wyniku której powstaje zawiesina pojedynczej komórki, która z kolei może być wykorzystana do solidnego immunofenotypowania.

Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mysich mezenchymów jelitowych, w tym telocytów. Mogą one być wykorzystywane do kilku zastosowań, takich jak współhodowla z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wsparcia wzrostu i lepszego odzwierciedlenia sytuacji w oryginalnej tkance.

Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Naucz się izolować pierwotne miofibroblasty z tkanki okrężnicy myszy i człowieka. Ta metoda umożliwia badanie funkcji komórek stromalnych w fizjologii przewodu pokarmowego.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Przeglądaj więcej filmów