Name: Przepuszczalność przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę przejściowej permeabilizacji komórek przylegających za pomocą strumienia gazu obojętnego. Technika ta umożliwia efektywny transfer materiału genetycznego i biomolekuł do komórek ssaczych poprzez mechaniczne uszkodzenie błony komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować następującym źródłom finansowania: Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (CIHR), Radzie Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC).

1. Rozwój programu LabView
<ol>
	<li>Regulator przepływu masowego (MKS M100B Mass-Flo Controller) jest przymocowany do przewodu helu gazowego, aby zapewnić precyzyjne natężenie przepływu gazu. To urządzenie jest sterowane napięciem wejściowym w zakresie od 0 do 5 V. Pętla sterująca w programie LabView określa wymagane napięcie w danym momencie. Połączenie między komputerem a regulatorem przepływu masowego odbywa się za pomocą urządzenia do akwizycji danych (NI USB-6009), a zasilacz 12 V zapewnia zasilanie regulatora przepływu masowego.</li>
	<li>Do sterowania ruchem płytki 6-dołkowej służą dwie prowadnice liniowe pozycjonujące, po jednej dla każdego kierunku. Każdy zespół składa się z zespołu Velmex Unislide serii MA15 sprzężonego z silnikiem krokowym, a oba zespoły są sterowane przez pojedynczy sterownik silnika krokowego Velmex VXM. Sterownik pozwala na ręczne impulsowanie każdego silnika lub akceptuje ciąg zewnętrznych poleceń szeregowych, których kombinacja pozwala na określone wzorce ruchowe. W programie LabView można zaprogramować kilka wzorów, co wymaga od użytkownika podania tylko żądanej prędkości palnika, a także wymiarów ścieżki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Otwórz zarówno butlę z helem, jak i reduktor.</li>
	<li>Włącz sterownik silnika.</li>
	<li>Otwórz program LabView i sprawdź wszystkie warunki.</li>
	<li>Upewnij się, że platforma jest wyśrodkowana. Aby to sprawdzić, przyjrzyj się każdemu etapowi silnika i sprawdź, czy każdy wózek nie zbliża się do końca żadnego z nich. Albo program wyśrodkuje kareki, albo wyreguluj ręcznie za pomocą elementów sterujących impulsowaniem z przodu sterownika silnika.</li>
	<li>Jeśli jest to pierwsze uruchomienie w ciągu dnia, zaleca się jednokrotne uruchomienie programu bez komórek, aby upewnić się, że konfiguracja działa poprawnie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie wysokości dyszy kapilarnej strumienia gazu
<ol>
	<li>Wyjmij kapilarę z uchwytu i wyzeruj pokrętło wysokości.</li>
	<li>Umieść płytkę 6-dołkową na platformie.</li>
	<li>Wymień i opuść kapilarę strumienia gazu na dno studni, aż uderzy w szkiełko nakrywkowe. Zabezpiecz kapilarę w uchwycie.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła wysokości podnieś kapilę o 3 mm. Zaznacz tę wysokość na podstawie kapilary.</li>
	<li>Podnieś kapilatę na bezpieczną wysokość, a następnie wyjmij płytkę 6-dołkową.</li>
</ol>
4. Protokół przenikania komórek
<ol>
	<li>Hodowla przylegającej linii komórkowej do konfluencji na szklanych szkiełkach nakrywkowych na 6-dołkowej płytce przy użyciu standardowych technik hodowli. W przypadku komórek HeLa należy wysiać płytki 6-dołkowe z 2 x 105 komórek na dołek i inkubować przez 48 godzin przed zabiegiem.</li>
	<li>Przygotuj odpowiednią objętość roztworu zawierającego pożądany wektor. W przypadku hrGFPII-1 stężenie 50 ng/μl w 1x PBS zapewnia silny sygnał fluorescencyjny w komórkach HeLa 24 godziny po transfekcji. Do badań dekstranu zaleca się 80 μg/ml 10 kDa dekstranu fluorescencyjnego zielonego. Odtąd rozwiązanie to będzie określane jako "rozwiązanie wektorowe".</li>
	<li>Wyjmij pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienki i spłucz trzy razy 1x PBS.</li>
	<li>Odpipetować 1,370 μl roztworu wektorowego przygotowanego w kroku 4.2 do studzienki. Powinno to skutkować głębokością cieczy około 1,3 mm.</li>
	<li>Umieść studzienkę zawierającą roztwór wektorowy na środku platformy. Opuść dyszę strumienia gazu do wcześniej zaznaczonego poziomu, wskazując wysokość dyszy 3 mm nad suwakiem.</li>
	<li>Ustaw natężenie przepływu helu w programie LabView i wybierz żądany wzór ruchu, który ma być używany. Wybierz "Uruchom", gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia protokołu przepuszczalności. Nastąpi początkowy okres opóźnienia, podczas którego regulator przepływu masowego przygotowuje się do zapewnienia niezbędnego natężenia przepływu. Po osiągnięciu odpowiedniego natężenia przepływu program LabView aktywuje silniki krokowe, aby przesunąć studnię w pożądanym wzorcu przepuszczalności. Po zatrzymaniu platformy odczekaj około 30 sekund i usuń roztwór wektorowy. Uwaga: Optymalna przepuszczalność zachodzi w pobliżu ciśnienia dynamicznego od 100 do 200 Pa na wylocie dyszy, w zależności od średnicy kapilary.</li>
	<li>Umyj dobrze trzy razy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Dobrze wypełnij świeżymi pożywkami hodowlanymi.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3 - 4.6 dla żądanej liczby eksperymentów. Uwaga: Należy pamiętać o dołączeniu próbek kontrolnych, które składają się z studzienek napełnianych roztworem wektorowym bez przepływania po nich strumienia gazu. Pozostawić roztwór w studzienkach kontrolnych na około 1 minutę, a następnie przejść do kroków 4.5 i 4.6.</li>
	<li>W przypadku przeprowadzania eksperymentu transfekcji hrGFP, należy umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze na 24 godziny, aby umożliwić transkrypcję transfekowanego materiału przez komórki. Jeśli przeprowadzasz eksperyment przepuszczalności dekstranu, umieść 6-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze na 15 minut.</li>
</ol>
5. Obrazowanie komórek
<ol>
	<li>W razie potrzeby, bezpośrednio przed obrazowaniem, należy przeciwbarwić odpowiednią żywą/martwą barwą, aby ocenić śmierć komórki.</li>
	<li>Zobrazuj komórki za pomocą odpowiedniego mikroskopu, aby zbadać skuteczność transfekcji/przepuszczalności.</li>
</ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li>
<li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+gene+transfer+%28electroporation%29+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+analysis+techniques%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li>
<li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li>
<li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li>
<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Permeabilizacja strumieniem gazu obojętnego jest przydatną techniką transfekcji komórek adherentnych. Zapewnia możliwość przenoszenia biomolekuł do komórek za pomocą sił mechanicznych, co eliminuje konieczność stosowania potencjalnie szkodliwych substancji chemicznych lub wektorów wirusowych. Technika ta może potencjalnie zapewnić naukowcom i klinicystom skuteczny i stosunkowo prosty sposób na precyzyjną transfekcję komórek. Selektywność przenikania jest również wyjątkowa, co pozwala naukowcom leczyć tylko niektóre komór...

Wraz z ewolucją biomedycyny i zrozumieniem mechaniki komórkowej, dostarczanie biomolekuł do komórek stało się kluczowe dla wielu dziedzin badań i terapii medycznych. Opracowano różne techniki wprowadzania obcych cząsteczek przez błonę plazmatyczną do cytozolu komórki. Można je ogólnie sklasyfikować jako: techniki wirusowe, chemiczne lub mechaniczne. Techniki wirusowe mogą transfekować materiał genetyczny, taki jak RNA i DNA, za pomocą wektorów wirusowych1. Techniki wirusowe mają zwykle wysoką skuteczność w niektórych liniach komórkowych, jednak mają potencjał do reakcji immunologicznych i zapalnych2. Typowe metody transfekcji chemicznej obejmują wytrącanie fosforanem wapnia3, egzotoksynami bakteryjnymi4 i lipofekcję5. Techniki te okazały się skuteczne; Pojawiają się jednak pewne problemy, takie jak toksyczność komórek i nieswoistość. Ponadto stwierdzono, że techniki takie jak wytrącanie fosforanu wapnia mają skuteczność transfekcji do 70%, ale tylko w niektórych liniach komórkowych, rzadko w komórkach pierwotnych6. Jest to godne uwagi, ponieważ coraz więcej wysiłków badawczych wkłada się w komórki pierwotne, zwłaszcza w przypadku projektowania różnych terapii do użytku klinicznego i badania funkcjonowania DNA.
Czasowe zakłócenie błony komórkowej przez bodźce mechaniczne jest alternatywą dla wprowadzania obcych cząsteczek do komórek. Techniki obejmują: mikroiniekcję cząsteczek7, elektroporację przy użyciu pola elektrycznego w celu przerwania błony8,9, sonoporację za pomocą fal ultradźwiękowych w celu przerwania błony komórkowej10-12, bombardowanie cząstkami, jak wykazano za pomocą "pistoletu genowego", który wystrzeliwuje cząstki związane z genami do komórki13, a ostatnio zastosowanie naprężenia ścinającego płyn, które, jak wykazano, czasowo przenika komórki ssaków14,15. Chociaż metody mechaniczne pozwalają uniknąć niektórych z wyżej wymienionych problemów, zazwyczaj towarzyszy im niższa wydajność oraz bardzo złożone i wyspecjalizowane konfiguracje. Palnik wyładowczy jarzeniowy pod ciśnieniem atmosferycznym (APGD-t) został opracowany w McGill z początkowym celem funkcjonalizacji powierzchni i odłączenia przylegających komórek in vitro16. Nieoczekiwanie odkryto, że żywa/martwa plama, która była używana, była w jakiś sposób wchłaniana przez komórki bez dodawania środka przepuszczalnego. Co więcej, wydawało się, że zdarzało się to tylko w ograniczonych obszarach studni, które przypadkiem pokrywały się ze ścieżką pochodni. Kontynuowano badania nad zdolnościami przepuszczalności APGD-t, a w badaniach kontrolnych stwierdzono, że strumień gazu obojętnego nośnika plazmy bez wzbudzenia był również zdolny do przenikania komórek. Było to sprzeczne z początkową hipotezą, że reaktywne formy wytworzone przez strumień plazmy tymczasowo upośledzają funkcję błony i sugerowało, że po prostu siły mechaniczne były wystarczające, aby spowodować przenikanie komórek. Od tego momentu w naszym laboratorium kontynuowano badania, aby spróbować określić ilościowo i scharakteryzować skuteczność przepuszczalności strumienia gazu obojętnego, a także przyjrzeć się jego zdolnościom transfekcji16.
Dzięki tym badaniom stwierdzono, że mikropory faktycznie tworzą się w błonie plazmatycznej, a pory te mają tendencję do ponownego zamykania się w ciągu około 5 sekund15. Wykazaliśmy użyteczność tej techniki in vitro i in vivo w błonie kosmówkowo-omoczniowej zarodka kurczątka.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>Zielone białko fluorescencyjne do eksperymentów transfekcyjnych na komórkach HeLa</td></tr><tr><td>Dekstran, AlexaFluor 488; 10 000 MW, Anionowy, Fixable</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>dekstran do eksperymentów przepuszczalności</td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>do barwienia przeciwstawnego komórek ssaków</td></tr><tr><td>Odczynnik Antibrede Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>do montażu szkiełek podczas obrazowania</td></tr><tr><td>Helium o ultra wysokiej czystości</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/ Pożywka o wysokiej zawartości glukozy - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>dla komórek HeLa</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Dla pożywek</td></tr><tr><td>DMEM Penicylina-Streptomycyna, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Do pożywek DMEM</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>Wyprodukowano w laboratorium</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><silny>Tabela 1</silny>. Lista wymaganych odczynników</td></tr><tr><td>6-dołkowe przezroczyste mikropłytki poddane działaniu TC</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>WPI Identyfikator informacji o rozmiarach</td></tr><tr><td>(mm): 1, 0,86, 0,68, 0,5 Zamówienie #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontroler Mass-Flo</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>Regulator przepływu masowego, seria M100B, wymaga zewnętrznego zasilacza 12 V</td></tr><tr><td>USB-6009 DAQ Device</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zespół UniSlide z silnikiem krokowym i kontrolerem</td> Dwa <td>zespoły UniSlide serii MA15 Velmex, wyposażone w silniki krokowe Vexta 1,8 stopnia dostarczone przez firmę Velmex i sterowane przez sterownik silnika krokowego VXM</td><td></td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tabela 2. Lista wymaganego wyposażenia</td></tr></tbody></table>

przepuszczalność przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Istnieją różne techniki transfekcji komórek, które można podzielić na trzy szerokie kategorie: wirusowe, chemiczne i mechaniczne. Protokół ten opisuje mechaniczną metodę czasowej przepuszczalności przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego, który może ułatwić przenoszenie normalnie nieprzepuszczalnych makrocząsteczek do komórek. Uważamy, że ta technika działa poprzez wywieranie sił ścinających na błonę plazmatyczną przylegających komórek, co powoduje tymczasowe tworzenie się mikroporów. Po utworzeniu tych porów komórki są przepuszczalne dla materiału genetycznego i innych biomolekuł. Występujące siły mechaniczne stwarzają ryzyko trwałego uszkodzenia lub oderwania komórek od ich podłoża. Istnieje zatem wąski zakres dynamiki gazów obojętnych, w którym technika ta jest skuteczna. Strumień gazu obojętnego okazał się skuteczny w przenikaniu różnych przylegających linii komórkowych, w tym HeLa, HEK293 i ludzkich komórek śródbłonka aorty brzusznej. Protokół ten jest odpowiedni do przenikania przylegających komórek zarówno in vitro, jak i, jak wykazaliśmy, in vivo, wykazując, że może być wykorzystany do badań i potencjalnie w przyszłych zastosowaniach klinicznych. Ma również tę zaletę, że przenika komórki w sposób ograniczony przestrzennie, co może okazać się cennym narzędziem badawczym.

Permeabilizacja komórek HeLa za pomocą zielonego fluorescencyjnego dekstranu 10 kDa przy użyciu strumienia gazu helu z kapilarą o średnicy wewnętrznej 0,86 mm przedstawiona jest na Rysunku 1. Komórki zostały poddane barwieniu kontrastowemu natychmiast po permeabilizacji przy użyciu roztworu EthD-1 w stężeniu 2 μl/ml (LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit) w celu wizualizacji śmierci komórkowej. Bezpośrednio po barwieniu kontrastowym szkiełka podstawowe zostały zamontowane i poddane obrazowaniu. Rysunek te...

Ten protokół opisuje metodę tymczasowej przepuszczalności przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego. Technika ta ułatwia przenoszenie materiału genetycznego i biomolekuł do przylegających komórek ssaków poprzez wykorzystanie sił mechanicznych do przerwania błony plazmatycznej.

Przepuszczalność przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest permeabilizacja komórek adherentnych. Osiąga się to poprzez uprzednie hodowlę komórek eksperymentalnych na szkiełkach podstawkowych w płytkach sześciodołkowych. Drugim krokiem jest przepłukanie komórek roztworem XPBS, a następnie przykrycie ich roztworem zawierającym biomolekułę, która ma zostać przetransportowana do wnętrza komórki.Następnie zastosowano strumień gazu obojętnego. Próbkę przepuszczono przez komórki. Ostatnim krokiem jest utrwalenie i barwienie komórek, jeśli jest to wymagane.W końcowym etapie wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną w celu wykazania wydajności permeacji oraz żywotności komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak proliferation czy pistolety genowe, jest łatwość jej przygotowania oraz możliwość przestrzennego ograniczenia permeacji w komórkach adherentnych. W przypadku hodowli, osoby początkujące w stosowaniu tej metody mogą napotkać trudności, ponieważ dopracowanie określonych parametrów, takich jak natężenie przepływu gazu czy średnica kapilary, w celu zapewnienia wydajnej permeacji w konkretnych zastosowaniach, może wymagać czasu.Regulator przepływu masowego użyty w tej procedurze wymaga zewnętrznego zasilacza 12 V i jest podłączony do linii z helem, aby zapewnić precyzyjny natężenie przepływu gazu; interfejs pomiędzy regulatorem przepływu masowego a komputerem jest realizowany przez urządzenie do akwizycji danych. Jednostka ta jest sterowana za pomocą napięcia wejściowego w zakresie od zero do pięciu woltów. Pętla sprzężenia zwrotnego w programie LabVIEW określa wymagane napięcie w dowolnym momencie.Do sterowania ruchem płytki sześciodołkowej w obu kierunkach wykorzystuje się dwie liniowe prowadnice pozycjonujące. Każdy zestaw składa się z prowadnicy Velm X serii MA 15 połączonej z silnikiem krokowym, a oba zestawy są sterowane za pomocą jednego kontrolera silników krokowych VELM XVXM. Kontroler umożliwia ręczne przesuwanie każdego silnika lub przyjmuje ciąg zewnętrznych komend szeregowych.Połączenie tych elementów umożliwia realizację specyficznych wzorów ruchu. W programie LabVIEW można zaprogramować kilka takich wzorów, co wymaga od użytkownika podania jedynie pożądanej prędkości palnika oraz wymiarów ścieżki. Przygotowanie sprzętu należy rozpocząć od otwarcia butli z helem oraz regulatora, a następnie włączenia sterownika silnika.Otwórz program LabVIEW i zweryfikuj wszystkie warunki. Następnie upewnij się, że platforma jest wycentrowana w celu sprawdzenia. Sprawdź każdy stolik motorowy i upewnij się, że żaden z wózków nie znajduje się blisko końca stolika, a następnie poleć programowi wycentrować wózki.Jeśli jest to pierwsze uruchomienie w ciągu dnia, zaleca się uruchomienie programu raz bez komórek, aby upewnić się, że konfiguracja działa prawidłowo. Aby przygotować wysokość dyszy kapilarnej gas Jett, wyjmij kapilarę z uchwytu i wyzeruj tarczę wysokości. Umieść płytkę 6-dołkową na platformie.Wymień kapilarę dyszy gazowej i opuść ją na dno dołka, aż dotknie ona szkiełka nakrywkowego. Zabezpiecz kapilarę w uchwycie za pomocą pokrętła wysokości. Podnieś kapilarę o 3 mm i zaznacz tę wysokość na podstawie kapilary.Na koniec podnieś kapilarę na bezpieczną wysokość, a następnie wyjmij płytkę 6-dołkową. Linia komórek adherentnych stosowana w tym protokole powinna być hodowana do osiągnięcia konfluencji na szkiełkach przedmiotowych w płytce 6-dołkowej, stosując standardowe techniki hodowli komórek HeLa. Wysiej płytki 6-dołkowe w zagęszczeniu 2 × 10⁵ komórek na dołek i inkubuj przez 48 h przed rozpoczęciem zabiegu.W dniu zabiegu należy przygotować odpowiednią objętość roztworu zawierającego wybrany wektor. W badaniach z wykorzystaniem dekstryny zaleca się stosowanie stężenia 80 µg/mL zielonej fluorescencyjnej dekstryny o masie 10 kDa. W dalszej części niniejszego protokołu roztwór ten będzie określany jako roztwór wektora.Usunąć pożywkę z hodowli komórkowej z dołka i przepłukać go trzy razy przy użyciu XPBS; nalać pipetą 1 370 microliters roztworu wektora do dołka. Powinno to skutkować głębokością cieczy wynoszącą około 1,3 millimeters. Umieścić dołek zawierający roztwór wektora w centrum platformy.Obniż dyszę strumienia gazu do wcześniej zaznaczonego poziomu, wskazującego wysokość dyszy wynoszącą 3 mm nad preparatem. Ustaw natężenie przepływu helu w programie LabVIEW i wybierz pożądany wzór ruchu. Wybierz uruchom.Po przygotowaniu do rozpoczęcia protokołu permeacji nastąpi początkowy okres opóźnienia, podczas którego kontroler przepływu masowego będzie przygotowywał się do zapewnienia niezbędnej szybkości przepływu. Dla powodzenia tego protokołu ważne jest zoptymalizowanie warunków przepływu w celu zminimalizowania głębokości komórki oraz odrywania się komórek. Po osiągnięciu odpowiedniej szybkości przepływu program LabVIEW aktywuje silniki krokowe, aby przemieścić dołek zgodnie z żądanym wzorem permeacji. Po zatrzymaniu platformy należy wyjąć płytkę 6-dołkową z platformy.Odczekać około 30 sekund, a następnie usunąć roztwór wektora. Przemyć dołek trzy razy roztworem PBS. Po trzecim przemyciu wypełnić dołek świeżą pożywką hodowlaną.Powtórz protokół permeacji dla pożądanej liczby eksperymentów. Należy pamiętać o uwzględnieniu próbek kontrolnych, w których do dołków wlewa się roztwór wektora bez przepuszczania nad nimi strumienia gazu. Pozostaw roztwór w dołkach kontrolnych przez około jedną minutę przed jego usunięciem.Przemycie komórek roztworem PBS i napełnienie dołka świeżym medium hodowlanym. Płytkę sześciodołkową należy przenieść z powrotem do inkubatora; w przypadku permeabilizacji dekstryną inkubować przez 15 minut. Następnie należy wykonać obrazowanie komórek przy użyciu odpowiedniego mikroskopu w celu zbadania skuteczności permeabilizacji.Przedstawiono tutaj wyniki przepuszczalności komórek HeLa dla zielonej fluorescencyjnej dekstryny o masie 10 kilodalton z wykorzystaniem strumienia gazu helu o średnicy wewnętrznej 0,86 milimetra. Panele kapilarne A, B i C pokazują wyniki przy zastosowaniu trzech różnych ciśnieni wylotowych strumienia gazu helu, a panel D stanowi kontrolę z dodatkiem dekstryny, lecz bez ekspozycji na strumień gazu helu. Komórki poddano barwieniu kontrastowemu bezpośrednio po procesie przepuszczania w celu wizualizacji śmierci komórkowej. Na obrazach dekstryna fluorescuje na zielono, a martwe komórki na czerwono.Na panelach A i B zaobserwowano, że szerokość toru permeacji oraz wydajność zwiększały się wraz z wyższym ciśnieniem dynamicznym, przy jednoczesnym niewielkim wzroście śmiertelności komórek. Jednak po osiągnięciu wysokiego ciśnienia dynamicznego, co zaobserwowano na panelu C, komórki HeLa zostały oddzielone od szkiełek nakładkowych, a badania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej wykazały znikomą permeację peryferyjną. W błonie komórkowej zaobserwowano mikropory.W niniejszym przykładzie permeabilizację komórek HeLa przeprowadzono przy użyciu strumienia helu z kapilarą o średnicy wewnętrznej 0,86 mm i ciśnieniu wylotowym 300 Pa; wykonano obrazy z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej przy powiększeniu 50 000x. Panel A przedstawia próbkę kontrolną z gładką powierzchnią komórki, natomiast panel B ukazuje powierzchnię komórki poddanej permeabilizacji z porem o średnicy 84 nm. Po opanowaniu techniki procedura ta powinna zająć od 15 do 30 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Po zakończeniu procedury można przeprowadzić barwienia w celu oceny dodatkowych czynników, takich jak żywotność komórek.

permeabilization-of-adhered-cells-using-an-inert-gas-jet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Permeabilizacja przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Opis metod wykorzystanych do przekształcenia drukarki HP DeskJet 500 w biodrukarkę. Drukarka jest zdolna do przetwarzania żywych komórek, co powoduje powstanie przejściowych porów w błonie. Pory te mogą być wykorzystane do wprowadzania małych cząsteczek, w tym fluorescencyjnej G-aktyny, do wydrukowanych komórek.

Tworzenie przejściowych porów w błonie komórkowej przy użyciu standardowej drukarki atramentowej

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Wykorzystaliśmy chemiczne osadzanie z fazy gazowej wspomagane plazmą do osadzania cienkich warstw o grubości od kilku nm do kilkuset nm na nanocząsteczkach wykonanych z różnych materiałów. Następnie trawimy materiał rdzenia, aby wytworzyć puste w środku nanopowłoki, których przepuszczalność jest kontrolowana przez grubość powłoki. Charakteryzujemy przepuszczalność tych powłok dla małych substancji rozpuszczonych i wykazujemy, że bariery te mogą zapewniać przedłużone uwalnianie materiału rdzenia...

Charakterystyka enkapsulacji i przepuszczalności pustych cząstek polimeryzowanych w plazmie

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Obecne modele hodowli dwuwarstwowych nie pozwalają na funkcjonalne badania in vitro, które naśladują mikrośrodowiska in vivo. Wykorzystując glikol polietylenowy i metodę szablonowania tlenku, protokół ten opisuje rozwój ultracienkiej biomimetycznej błony podstawnej o regulowanej sztywności, porowatości i składzie biochemicznym, która ściśle naśladuje matryce zewnątrzkomórkowe in vivo.

Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Prezentujemy metodę wstrzykiwania komórek za pomocą technologii strumienia wody bez użycia igieł w połączeniu z kontynuacją badań po porodzie pod kątem żywotności komórek, proliferacji i pomiarów elastyczności.

Iniekcja komórek zrębu tkanki tłuszczowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej świń za pomocą technologii strumienia wody

Poznaj metodę przejściowej permeabilizacji komórek przylegających za pomocą strumienia gazu obojętnego. Technika ta umożliwia efektywny transfer materiału genetycznego i biomolekuł do komórek ssaczych poprzez mechaniczne uszkodzenie błony komórkowej.

Przepuszczalność przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego

Przeglądaj więcej filmów