Oczyszczanie żelu

Oczyszczanie żelu jest standardową procedurą wykonywaną w celu odzyskania pożądanych fragmentów DNA z żeli agarozowych po separacji elektroforetycznej. Po rozpuszczeniu fragmentu żelu i przepuszczeniu go przez specjalistyczny filtr, procedura ta pozwala uzyskać DNA wolne od zanieczyszczeń, takich jak sole, wolne nukleotydy i enzymy, odpowiednie do dalszych zastosowań.

Podstawowa zasada odzyskiwania DNA z żelu agarozowego obejmuje sekwencję etapów wiązania, mycia i elucji. Gdy żel znajdzie się w buforze solubilizującym, nakłada się go na "kolumnę wirową", która po odwirowaniu pozwala cząsteczkom DNA selektywnie wiązać się z filtrem krzemionkowym, podczas gdy zanieczyszczenia przepływają do probówki zbiorczej.

DNA jest w stanie wiązać się z krzemionką dzięki wysokiemu stężeniu soli w buforze do solubilizacji żelu. Uważa się, że ten bufor zakłóca strukturę hydratacji wokół filtra i tworzy mostek soli kationowej między silnymi ładunkami ujemnymi na filtrze a ujemnymi ładunkami na DNA. Resztki zanieczyszczeń usuwa się przez mycie etanolem.

Do kolumny dodaje się wodę lub bufor o niskiej zawartości soli, który "wymywa" lub uwalnia z niej DNA, prawdopodobnie poprzez przerwanie mostka kationowego. DNA jest teraz oczyszczone z żelu.

Pierwszym krokiem w procedurze oczyszczania żelu jest odlewanie żelu agarozowego i wykonanie elektroforezy próbek DNA. Po zakończeniu żelowania pożądane fragmenty DNA są wizualizowane pod kątem światła UV, a fragmenty są wybierane po porównaniu z wzorcem masy cząsteczkowej.

Jeśli żel jest niebarwiony, położenie prążka można w przybliżeniu określić na podstawie porównania z drabiną DNA. Podczas krojenia żelu żyletką należy zadbać o to, aby odzyskać jak najwięcej DNA przy jak najmniejszej ilości agarozy.

Podczas pracy z żelami zabarwionymi bromkiem etydyny i pracy przed światłem UV należy używać rękawic i okularów ochronnych. Po wycięciu pożądanego DNA z żelu, należy odpowiednio zutylizować żel i bufor do działania, zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa.

Po wyizolowaniu kawałek żelu umieszcza się w probówce do mikrofuge i waży na wadze. Przyjmując przybliżenie, że 100 mg żelu zajmuje 100 l, do kawałka żelu dodaje się objętość buforu rozpuszczalnego 4 razy większą niż masa żelu. Po umieszczeniu w buforze, kawałek żelu inkubuje się w temperaturze około 50 C w celu stopienia agarozy.

Po stopieniu rozpuszczony żel dodaje się do kolumny wirowej, a roztwór odwirowuje, co spowoduje, że całe DNA i inne cząstki przykleją się do filtra.

Następnie związane DNA jest myte przez dodanie 70% etanolu do filtra, a następnie odwirowanie, które usunie resztki zanieczyszczeń z filtra. Przepływ jest odrzucany, a ten etap mycia jest następnie zwykle powtarzany do trzech razy. Pusty filtr jest ponownie wirowany w celu usunięcia resztek etanolu, a filtr krzemionkowy pozostawia się do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Do filtra dodaje się wodę lub bufor elucyjny, a po kolejnej rundzie wirowania oczyszczone DNA zbiera się na dnie probówki.

Metoda, którą właśnie widziałeś, dotyczy oczyszczania żelu za pomocą filtrów z krzemionkową kolumną wirową. Istnieją inne metody, które wykorzystują te same podstawowe zasady wiązania DNA z krzemionką, po których następują etapy płukania i elucji. Na przykład krzemionkę można mieszać z DNA w zawiesinie zwanej "szklanym mlekiem", którą można granulować i myć, a następnie eluować. Ssanie może być również wykorzystane do przeciągnięcia DNA przez filtry krzemionkowe, a następnie jego wymycia. Upewnij się, że rozumiesz procedury oczyszczania żelu w swoim laboratorium.

Teraz, gdy nauczyłeś się odzyskiwać DNA z żeli agarozowych, przyjrzyjmy się kilku dalszym zastosowaniom, które wykorzystują DNA uzyskane z oczyszczania żelem.

Na przykład oczyszczanie żelu jest pośrednim etapem immunoprecypitacji chromatyny, techniki, która ma na celu wyizolowanie białek regulatorowych, które wiążą genomowe DNA, w celu określenia, które sekwencje są regulowane. Wyizolowane fragmenty są oczyszczane żelem i sekwencjonowane w celu zmapowania ich na poszczególne regiony chromosomów.

Subklonowanie - proces przenoszenia genu z jednego wektora na inny - może obejmować oczyszczanie żelu. Na przykład sekwencje genów z jednego wektora mogą być trawione z jednego konstruktu i składane w sekwencje chimeryczne za pomocą PCR, po czym są oczyszczane w żelu i umieszczane w innych konstruktach.

Być może najprostszym zastosowaniem oczyszczania żelowego jest jego stosowanie po długotrwałym przechowywaniu w temperaturze -80 °C wyciętych prążków DNA po elektroforezie.

Dowiedziałeś się już, jak ekstrahować fragmenty DNA z żelu agarozowego, jakie są warianty procedur wiązania, płukania i elucji zgodnie z indywidualnymi preferencjami użytkownika, a także niektóre z możliwych dalszych zastosowań tej metody. Jak zawsze dziękuję za oglądanie.