Oczyszczanie z żelu

Oczyszczanie żelowe to standardowa procedura wykonywana w celu odzyskania pożądanych fragmentów DNA z żeli agarozowych po rozdziale elektroforetycznym. Po rozpuszczeniu fragmentu żelu i przepuszczeniu go przez specjalistyczny filtr, procedura ta pozwala na uzyskanie DNA wolnego od zanieczyszczeń, takich jak sole, wolne nukleotydy i enzymy, co czyni je odpowiednim do dalszych zastosowań.

Podstawowa zasada odzyskiwania DNA z żelu agarozowego opiera się na sekwencji etapów wiązania, płukania i elucji. Po rozpuszczeniu żelu w buforze solubilizującym, roztwór nanosi się na „kolumienkę wirową”, która podczas wirowania umożliwia selektywne wiązanie cząsteczek DNA do filtra krzemionkowego, podczas gdy zanieczyszczenia przedostają się do probówki zbierającej.

DNA może wiązać się z krzemionką dzięki wysokiemu stężeniu soli w buforze do solubilizacji żelu. Przyjmuje się, że bufor ten zaburza strukturę hydratacyjną wokół filtra i tworzy kationowy mostek solny między silnymi ładunkami ujemnymi na filtrze a ładunkami ujemnymi DNA. Pozostałe zanieczyszczenia są usuwane poprzez płukanie etanolem.

Do kolumienki dodaje się wodę lub bufor o niskim stężeniu soli, co prowadzi do „elucji”, czyli uwolnienia DNA, prawdopodobnie poprzez zerwanie mostka kationowego. W ten sposób DNA zostaje oczyszczone z żelu.

Pierwszy krok procedury oczyszczania z żelu obejmuje odlewanie żelu agarozowego i przeprowadzenie elektroforezy próbek DNA. Po zakończeniu przebiegu żelowego pożądane fragmenty DNA są wizualizowane w świetle UV, a następnie wycinane po porównaniu z markerem masy cząsteczkowej.

W przypadku żelu niebarwionego położenie prążka można określić przybliżeniu na podstawie porównania z drabiną DNA. Podczas wycinania żelu żyletką należy zadbać o odzyskanie jak największej ilości DNA przy jak najmniejszej ilości agarozy.

Podczas pracy z żelami barwionymi bromkiem etydyny oraz w świetle UV należy stosować rękawice i okulary ochronne. Po wycięciu pożądanego DNA z żelu, żel oraz bufor do elektroforezy należy zutylizować zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa.

Wyizolowany fragment żelu umieszcza się w probówce do wirówki i waży na wadze. Przyjmując przybliżenie, że 100 mg żelu zajmuje 100 µl, do fragmentu żelu dodaje się objętość buforu do solubilizacji stanowiącą 4X wagę żelu. Po umieszczeniu w buforze fragment żelu inkubuje się w temperaturze około 50 °C, aby stopić agarozę.

Po stopieniu zsolubilizowany żel przenosi się na kolumienkę wirówkową i wiruje, co spowoduje przywiązanie całego DNA oraz innych cząsteczek do filtra.

Następnie związane DNA przemywa się, dodając do filtra 70% etanolu, a następnie wirując, co usunie pozostałe zanieczyszczenia z filtra. Przesącz zostaje odrzucony, a ten etap płukania zazwyczaj powtarza się do trzech razy. Pusty filtr wiruje się ponownie w celu usunięcia resztek etanolu, a następnie pozostawia filtr krzemionkowy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Do filtra dodaje się wodę lub bufor elucyjny, a po kolejnej serii wirowania oczyszczone DNA zostaje zebrane na dnie probówki.

Przedstawiona metoda odnosi się do oczyszczania z żelu z wykorzystaniem filtrów w kolumienkach wirówkowych z krzemionką. Istnieją inne metody wykorzystujące te same podstawowe zasady wiązania DNA do krzemionki, a następnie etapy płukania i elucji. Na przykład krzemionkę można zmieszać z DNA w zawiesinie zwanej „glassmilk”, którą można zpelletować i przemyć, a później eluować. Można również zastosować ssanie, aby przeciągnąć DNA przez filtry krzemionkowe, a następnie je eluować. Należy zapoznać się z procedurami oczyszczania z żelu obowiązującymi w Twoim laboratorium.

Po zapoznaniu się ze sposobem odzyskiwania DNA z żeli agarozowych, przyjrzyjmy się kilku dalszym zastosowaniom, w których wykorzystuje się DNA uzyskane w procesie oczyszczania z żelu.

Przykładowo, oczyszczanie z żelu jest etapem pośrednim w immunoprecypitacji chromatyny, technice mającej na celu izolację białek regulatorowych wiążących DNA genomowe, aby zidentyfikować sekwencje podlegające regulacji. Izolowane fragmenty są oczyszczane z żelu i sekwencjonowane, aby można było je przypisać do poszczególnych regionów chromosomów.

Subklonowanie – proces przenoszenia genu z jednego wektora do innego – może obejmować oczyszczanie z żelu. Na przykład sekwencje genów z jednego wektora mogą zostać wycięte z jednej konstrukcji i zmontowane w sekwencje chimeryczne za pomocą PCR, po czym są oczyszczane z żelu i wprowadzone do innych konstrukcji.

Być może najprostszym zastosowaniem oczyszczania z żelu jest jego użycie po długotrwałym przechowywaniu w temperaturze -80 ˚C wyciętych prążków DNA po elektroforezie.

Dowiedzieli się Państwo, jak wyizolować fragmenty DNA z żelu agarozowego, zapoznali się z wariantami procedur wiązania, płukania i elucji stosowanymi w zależności od preferencji użytkownika, a na koniec z niektórymi z możliwych zastosowań tej metody w dalszych analizach. Jak zawsze, dziękujemy za uwagę.