Name: Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę drukowania termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę architektury materiałów biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Deborah Studer za pomoc przy biodrukarce.
Praca została sfinansowana przez Siódmy Program Ramowy Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant n°NMP4-SL-2009-229292.

1. Przygotowanie roztworu Poloxamer 407
Jeśli to możliwe, przygotuj roztwór poloksamera w chłodni (4 °C). Jeśli nie jest dostępna, umieść szklaną butelkę w zlewce wypełnionej lodowatą wodą. W wyższych temperaturach poloksamer znajdzie się powyżej punktu żelu i nie rozpuści się prawidłowo.
<ol>
	<li>Dodać 60 ml lodowatego roztworu PBS do szklanej butelki i energicznie wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
	<li>Odważyć 24,5 grama poloksamu i dodać go w niewielkich ilościach do zimnego PBS. Poczekaj, aż poloksamer częściowo się rozpuści, zanim dodasz więcej.</li>
	<li>Mieszać roztwór, aż cały poloksamer się rozpuści.</li>
	<li>Dodawać zimny PBS aż do osiągnięcia końcowej objętości 100 ml. Końcowe stężenie wyniesie 24,5% w/v.</li>
	<li>Przerwać mieszanie roztworu i pozostawić go w temperaturze 4 °C do momentu zniknięcia pęcherzyków i piany w roztworze. Bąbelki, które zostaną uwięzione w żelu, zostaną przeniesione do wkładu drukarki i doprowadzą do wad w wydrukowanych formach ofiarnych.</li>
	<li>Przefiltruj (filtr 0,22 μm) roztwór bezpośrednio do wkładu drukarskiego, aby usunąć wszelkie niepożądane cząsteczki, które mogłyby zatkać igłę. Etap filtrowania powinien być przeprowadzony w chłodni (lub, jeśli nie jest dostępna, z chłodzonymi końcówkami, filtrem itp.), aby uniknąć żelowania poloksameru w filtrze. Załadowany wkład należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 30 minut przed eksperymentem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie drukarki 3D
Drukarka 3D użyta w tej pracy to "BioFactory" firmy regenHU. Część systemu do wytłaczania składa się z kilku części. Wkład pod ciśnieniem u góry jest przymocowany do złącza za pomocą adaptera luer-lock. Łącznik mostkuje przestrzenie między wylotem wkładu a wlotem zaworu elektromagnetycznego. Na wylocie elektrozaworu można użyć igieł o różnych średnicach. Materiał jest wytłaczany na podłoże, które jest utrzymywane w ruchomym etapie za pomocą próżni. Główne części systemu przedstawiono na rysunku 1. W procesie drukowania można zastosować inne systemy oparte na wytłaczaniu, a proces optymalizacji należy przeprowadzić dla każdego systemu.
<ol>
	<li>Umieść zawór elektromagnetyczny (średnica dyszy 0,3 mm) i igłę (średnica wewnętrzna 0,15 mm) w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml wypełnionych ultraczystą wodą i umieść je w podgrzanej łaźni ultradźwiękowej w celu czyszczenia przez 30 minut. Oczyszczone zawory przepłukać etanolem i osuszyć pistoletem do azotu.</li>
	<li>Zainstaluj zawór i igłę w drukarce, a także pusty, czysty wkład.</li>
	<li>Zastosuj ciśnienie 3 barów do układu i przedmuchnij wszelkie resztki płynów z zainstalowanego zaworu i igły sprężonym powietrzem. W przypadku małych średnic igieł zaleca się zainstalowanie filtra (zwykłego filtra strzykawkowego, wielkość porów 0,45 μm) na wylocie sprężonego powietrza, aby uniknąć przedostawania się małych cząstek, które mogłyby zatkać igłę.</li>
	<li>Wyłącz ciśnienie i zainstaluj wkład załadowany poloksamerem. Wkład należy wyjąć z lodówki na około 30 minut przed zamontowaniem wkładu, aby poloksamer mógł osiągnąć temperaturę pokojową i żel.</li>
	<li>Zastosować ciśnienie 3 barów do systemu i dozować poloksamer aż do momentu, gdy dotrze do końcówki igły i zostanie wytłoczony w ciągłym pasmie.</li>
</ol>
3. Optymalizacja parametrów drukowania
Aby stworzyć dokładne struktury 3D, proces drukowania musi być zoptymalizowany pod kątem wybranego materiału i stężenia. W zależności od lepkości i systemu druku 3D, każdy materiał będzie dawał określoną objętość dozowania i grubość linii dla ustalonego zestawu parametrów.
<ol>
	<li>Za pomocą odpowiedniego oprogramowania CAD (zdolnego do tworzenia plików ISO na podstawie rysunków) narysuj pojedynczą linię o tej samej długości, co struktura, którą zamierzasz wydrukować.</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe o wymiarach 25 mm x 75 mm x 1 mm lub inne podłoże w drukarce i zabezpiecz je, włączając odkurzacz.</li>
	<li>W oprogramowaniu drukarki ustaw zawór elektromagnetyczny na wysoką częstotliwość 50 Hz i ustaw wysokie ciśnienie na 3 bary.</li>
	<li>Drukuj jedną warstwę pojedynczej linii z prędkością stołu montażowego 300 mm/min.</li>
	<li>Zmniejszaj ciśnienie, aż do osiągnięcia żądanej szerokości linii. Możesz także kontrolować objętość, która jest wytłaczana za pomocą czasu otwarcia zaworu.</li>
	<li>Zmniejsz częstotliwość zaworu, aż nie będzie można już wydrukować ciągłej linii. Wybierz częstotliwość powyżej tej wartości.</li>
</ol>
Uwaga: Po osiągnięciu pożądanej szerokości linii i linii ciągłych, określ optymalną prędkość etapu i grubość warstwy, tj. podniesienie igły po jednej wydrukowanej warstwie.
<ol start="7">
	<li>Wydrukuj kilka warstw jedna na drugiej i sprawdź, czy igła znajduje się we właściwej pozycji nad poprzednią warstwą po kilku wydrukowanych warstwach. Dostosuj grubość warstwy (podnoszenie igły) tak, aby każda warstwa była drukowana na następnej (Rysunek 3).</li>
	<li>Stopniowo zmniejszaj prędkość stołu montażowego z 300 mm/min, tak aby wytłaczane warstwy zaczynały się i kończyły w tych samych pozycjach, co poprzednie (Rysunek 4). Zbyt duże prędkości stołu montażowego powodują, że stolik przesuwa się, zanim wytłaczany materiał dotknie poprzedniej warstwy.</li>
	<li>Aby wydrukować struktury słupów, wykonaj kroki 3.1-3.8., ale zamiast rysować pojedynczą linię, narysuj pojedynczy punkt. Parametry, na które należy zwrócić uwagę podczas drukowania słupków, to ciśnienie (reguluje grubość warstwy i średnicę słupka poloksameru), czas otwarcia zaworu (objętość wytłaczana) oraz czas przebywania głowicy drukującej w miejscu, w którym słupek powinien zostać osadzony.</li>
	<li>Po zoptymalizowaniu parametrów, wydrukowanie kilku warstw linii powinno skutkować solidną ścianą, a w przypadku punktów słupkiem. Zapisz parametry do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
4. Drukowanie i elucja odwróconej formy
Od tego momentu używaj parametrów znalezionych podczas procedury optymalizacji.
<ol>
	<li>Wydrukuj wewnętrzną strukturę (w tym przypadku jest to układ filarów) na szklanym szkiełku mikroskopowym i pozostaw do wyschnięcia na noc. To a) zmniejsza rozmiar i grubość struktur oraz b) zapewnia lepszą przyczepność między strukturą a podłożem, dzięki czemu można uniknąć unoszenia się podczas zasypywania.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania CAD narysuj strukturę, która składa się z zewnętrznej ściany otaczającej strukturę, którą zamierzasz usunąć i wypełnić. Wydrukuj strukturę za pomocą poloxamiru. Wydruk ściany zajmie 6 minut.</li>
</ol>
Uwaga: Ścianka musi być wydrukowana w odległości co najmniej 3,5 mm od wewnętrznej struktury ze względu na wymiary igły. W przeciwnym razie drukowanie ściany zewnętrznej zniszczy strukturę wewnętrzną
<ol start="3">
	<li>Przygotuj roztwór, którym chcesz wypełnić formę ofiarną (tutaj 1% agarozy w wodzie dejonizowanej). Roztwór agarozy powinien mieć temperaturę między 35 °C a 45 °C. Poniżej tej temperatury agaroza zestala się zbyt szybko; Powyżej tej temperatury może zniszczyć wydrukowane filary, ponieważ struktura poloksamera zmięknie.</li>
	<li>Powoli napełnij formę protektorową roztworem do zasypywania za pomocą pipety. Należy to robić powoli, aby uniknąć zniszczenia konstrukcji wewnątrz ściany.</li>
	<li>Pozwól, aby wypełniony roztwór zżelował się lub usieciował go w zależności od użytego polimeru. W przypadku agarozy krzepnięcie odbywało się w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Umieść wypełnioną formę protektorową w łaźni lodowej na 10 minut, aby wymyć strukturę poloksamera.</li>
	<li>Osusz zasypaną strukturę chusteczką papierową i umieść ją na nowym szklanym szkiełku mikroskopowym. Ostrożnie dociśnij strukturę do szklanego szkiełka mikroskopowego, aby uniknąć wycieku trzeciego hydrożelu z pustki do przestrzeni między zasypaną strukturą a szklanym szkiełkiem mikroskopowym.</li>
</ol>
5. Wypełnianie pustych przestrzeni
<ol>
	<li>Aby wypełnić puste przestrzenie pozostawione przez eluowany poloksamer, należy wlać zamierzony roztwór polimeru do strzykawki wyposażonej w igłę 30 G. W tym przykładzie użyliśmy 1% metakrylanu alginianu w 0,15 M roztworze NaCl z dodatkiem 0,05% w/v fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) i 2,5% v/v sprzężonego fibrynogenu Alexa-488. Sprzężony fibrynogen Alexa-488 został dodany w celach wizualizacyjnych.</li>
	<li>Fotopolimeryzuj polimer lampą UV o wysokiej intensywności (100 W, 365 nm, odległość od podłoża wynosiła 3,5 cm) przez 5 minut i zobrazuj konstrukt za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+photocrosslinked+Lutrol+hydrogel+for+tissue+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications.</a> Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).</li>
<li>Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanoarrays+generated+by+Dip-Pen+Nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Abstr+Pap+Am+Chem+S%22%5BJournal%5D)">Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography.</a> Abstr Pap Am Chem S. 223, C94(2002).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Mironov, V., Reis, N., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+bioprinting%3A+a+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Review: bioprinting: a beginning.</a> Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).</li>
<li>Odde, D. J., Renn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-guided+direct+writing+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Laser-guided direct writing of living cells.</a> Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting%3A+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).</li>
<li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nature. 2, 265-271 (2003).</li>
<li>Engelhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+2D+protein+microstructures+and+3D+polymer-protein+hybrid+microstructures+by+two-photon+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization.</a> Biofabrication. 3, 025003(2011).</li>
<li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+technology+to+produce+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+biological+therapy%22%5BJournal%5D)">Printing technology to produce living tissue.</a> Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Organ printing: promises and challenges.</a> Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).</li>
<li>Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fiber+deposition+of+cell-laden%2C+viable%2C+patterned+constructs+for+bone+tissue+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing.</a> Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).</li>
<li>Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+tissue-engineering+constructs%2C+using+photopolymerizable+hydrogels+and+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography.</a> Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).</li>
<li>Cook, C., Wang, T., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+Printing+of+Enzymes+for+Glucose+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Res+Soc+Symp+P%22%5BJournal%5D)">Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors.</a> Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).</li>
<li>Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+myotube+formation+using+bioprinting+technology+for+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications.</a> Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).</li>
<li>Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), , 82-85 (2009).</li>
<li>Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+of+a+mechanically+enhanced+three-dimensional+dual+cell-laden+construct+for+osteochondral+tissue+engineering+using+a+multi-head+tissue%2Forgan+building+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micromech.+Microeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system.</a> J. Micromech. Microeng. 22, (2012).</li>
<li>Malmsten, M., Lindman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+in+Aqueous+Block+Copolymer+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions.</a> Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).</li>
<li>Cebotari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+tissue+engineered+human+heart+valves+using+autologous+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells.</a> Circulation. 114, I132-I137 (2006).</li>
<li>Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+application+of+tissue+engineered+vascular+autografts%3A+clinical+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience.</a> Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).</li>
<li>Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+bladders%3A+new+possibilities+for+cystoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Urology%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty.</a> Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).</li>
<li>Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstitution+of+a+functional+mammalian+urinary+bladder+by+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering.</a> Nature. 17, 149-155 (1999).</li>
<li>Wood, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+plastic+surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of skin.</a> Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).</li>
<li>Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+tissue+engineering--in+vivo+and+in+vitro+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+plastic+surgery%22%5BJournal%5D)">Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications.</a> Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).</li>
<li>Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Panminerva+medica%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of skin substitutes.</a> Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).</li>
<li>Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+fiction+or+science%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: fiction or science.</a> Biorheology. 41, 371-375 (2004).</li>
<li>Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+organ+printing+2%3A+fusion+of+cell+aggregates+in+three-dimensional+gels%5BTitle%5D)+AND+%22The+anatomical+record.+Part+A%2C+Discoveries+in+molecular%2C+cellular%2C+and+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels.</a> The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+polymerization%3A+from+fundamentals+to+biomedical+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+biomaterials%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature. 11, 768-774 (2012).</li>
<li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+trends+and+limitations+in+hydrogel-rapid+prototyping+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering.</a> Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).</li>
<li>Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hydrogels+for+bio-printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).</li>
<li>He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+fabrication+of+microstructured+chitosan-gelatin+scaffolds+using+rapid+prototyping%5BTitle%5D)+AND+%22Virtual+and+Physical+Prototyping%22%5BJournal%5D)">Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping.</a> Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).</li>
<li>Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+collagen+scaffolds+with+predefined+internal+morphology+made+by+solid+freeform+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication.</a> Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+three-dimensional+freeform+fabrication+of+multi-layered+hydrogel+scaffold+with+fluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels.</a> Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).</li>
<li>Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+sensitive+PEG+diacrylate+%28PEGDA%29+hydrogels+with+spatial+variations+in+matrix+properties+direct+vascular+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion.</a> J. Tissue. 6, 302-302 (2012).</li>
<li>Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerized+poly%28ethylene%29+glycol+diacrylate+%28PEGDA%29+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Roy.+Soc.+Ch%22%5BJournal%5D)">Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices.</a> Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).</li>
<li>Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+immobilized+RGD+peptide+in+alginate+scaffolds+on+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering.</a> Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).</li>
<li>Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinked+alginate+hydrogels+with+tunable+biodegradation+rates+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties.</a> Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).</li>
<li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng-T+Asme%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).</li>
<li>D'Arrigo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+methacrylate+derivatives+and+calcium+alginate+interpenetrated+hydrogel+networks+for+biomedical+applications%3A+physico-chemical+characterization+and+protein+release%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release.</a> Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).</li>
<li>Pescosolido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+Acid+and+Dextran-Based+Semi-IPN+Hydrogels+as+Biomaterials+for+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting.</a> Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+of+collagen%2Fchondroitin+sulfate%2Fhyaluronan+interpenetrating+polymer+network+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci-Mater.+M%22%5BJournal%5D)">Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Tutaj po raz pierwszy prezentujemy zastosowanie termoczułego polimeru do formy protektorowej, którą można szybko eluować w zimnej wodzie dzięki przemianie żel-zol poloksamera o temperaturze ~20 °C. Szybkość całego procesu sprawia, że poloxamer jest interesujący ze względu na szybkie tworzenie struktur biopolimerowych, których nie da się wydrukować z odpowiednią rozdzielczością. Opisana tutaj technika może być wykorzystana do modelowania jednego hydrożelu w innym hydrożelu lub do tworzenia kanałów mikroprzepływowych, jak ...

Podejścia inżynierii tkankowej poczyniły znaczne postępy w ostatnich latach w odniesieniu do regeneracji tkanek i organów ludzkich19,20. Jednak do tej pory inżynieria tkankowa często ograniczała się do tkanek o prostej budowie lub małych wymiarach, takich jak pęcherz moczowy21,22 lub skóra23-25. Ciało ludzkie składa się jednak z wielu złożonych trójwymiarowych tkanek, w których komórki i macierz zewnątrzkomórkowa są ułożone w określony przestrzennie sposób. Aby wytworzyć te tkanki, wymagana jest technika, która może umieścić komórki i rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej w trójwymiarowym konstrukcie w określonych pozycjach. Bioprinting ma potencjał, aby stać się taką techniką, w której wizja wytwarzania złożonych trójwymiarowych tkanek może zostać zrealizowana10,11,26-28.
Bioprinting jest zdefiniowany jako "wykorzystanie procesów transferu materiałów do tworzenia wzorów i składania biologicznie istotnych materiałów - molekuł, komórek, tkanek i biodegradowalnych biomateriałów - z określoną organizacją do spełnienia jednej lub więcej funkcji biologicznych"4. Obejmuje kilka różnych technik, które działają w różnych rozdzielczościach i skalach długości, od rozdzielczości submikronowej polimeryzacji dwufotonowej29 do rozdzielczości od 150 μm do 420 μm dla druku ekstruzyjnego1,12,30. Żaden pojedynczy materiał lub kombinacja materiałów nie spełni wymagań każdej metody31. W przypadku druku ekstruzyjnego kluczowymi parametrami są lepkość i czas żelowania32, gdzie pożądana jest wysoka lepkość i szybkie żelowanie.
Druk 3D to technika, która pozwala na łatwe tworzenie form ofiarnych do tworzenia skomplikowanych geometrii30,33,34. Proces ten opiera się na budowie formy przy użyciu techniki szybkiego prototypowania, takiej jak biodrukarka do wytłaczania. Utworzona forma protektorowa służy do formowania skomplikowanych struktur z materiałów, które są trudne do wydrukowania ze względu na ich niską lepkość i powolny czas żelowania. Przedstawiona tutaj metoda polega na stworzeniu formy protektorowej składającej się z materiału, który szybko rozpuszcza się w niskiej temperaturze i może być dokładnie wytłaczany. Kopolimer blokowy poli(glikol etylenowy)99-poli(glikol propylenowy)67-poli(glikol etylenowy)99 (znany również jako Pluronic F127 lub poloxamer 407) spełnia te wymagania. Był już używany w zmodyfikowanej wersji w druku ekstruzyjnym1, ale według naszej wiedzy nigdy nie był używany do drukowania w wersji niezmodyfikowanej ze względu na jego niestabilność w środowisku ciekłym. Poloxamer 407 wykazuje również odwrotną reakcję termiczną18, tzn. po schłodzeniu zmienia się z żelu w zol. Co najważniejsze, można go drukować w złożone, dowolnie zakrzywione struktury z bardzo wysoką wiernością. Pozwala to na wytworzenie strukturalnego hydrożelu z materiału o niskiej lepkości, w tym przypadku agarozy wolno żelującej, poprzez pipetowanie roztworu do wydrukowanej formy protektorowej. Połączenie nadruku formy protektorowej z wysoką wiernością i jej szybką elucją z odlewanego strukturalnego hydrożelu sprawia, że jest to szybka i elastyczna metoda tworzenia form o różnych geometriach bez użycia maski czy stempla, jak to często jest wymagane w metodach litograficznych. Odlewany hydrożel strukturalny można dodatkowo wypełnić innym materiałem, który nie nadaje się do druku ekstruzyjnego ze względu na niską lepkość. Jest to w naszym przypadku roztwór metakrylanu alginianu o niskiej lepkości. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę termoczułych odwróconych form protektorowych do modelowania hydrożelu na przykładzie układu filarowego.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Poloxamer (Pluronic F127)</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=10010015" target="_blank">10010-015</a></td><td></td></tr><tr><td>CAD oprogramowanie</td><td>regenHU</td><td>BioCAD</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylan alginianu</td><td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td><td></td><td>zsyntetyzowane przez Innovent dla projektu FP7 Nr NMP4-SL-2009-229292</td></tr><tr><td>Fibrynogen z ludzkiego osocza, Alexa Fluor 488 Koniugat</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)</td><td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td><td></td><td>Zsyntetyzowany przez Innovent dla projektu 7PR Nr NMP4-SL-2009-229292</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>regenHU</td><td>Biofactory</td><td></td></tr><tr><td>Valve</td><td>regenHU</td><td>300 &#956; m Średnica</td><td></td></tr><tr><td>igły</td><td>regenHU</td><td>150 &#956; m Średnica</td><td></td>wewnętrzna</tr><tr><td>Zeiss Axioobserver z ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Źródło światła</td><td>UVP UVP</td><td>Blak-ray B-100AP Lampa UV o wysokiej intensywności</td><td>100 W</td></tr></tbody></table>

drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3d

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting to nowa technologia, która ma swoje początki w branży szybkiego prototypowania. Różne procesy drukowania można podzielić na biodruk kontaktowy1-4 (wytłaczanie, pióro zanurzeniowe i litografia miękka), biodruk bezkontaktowy5-7 (laserowy transfer do przodu, osadzanie atramentowe) oraz techniki laserowe, takie jak fotopolimeryzacja dwufotonowa8. Może być używany do wielu zastosowań, takich jak inżynieria tkankowa9-13, mikrofabrykacja biosensorów14-16 oraz jako narzędzie do odpowiadania na podstawowe pytania biologiczne, takie jak wpływ kokulturacji różnych typów komórek17. W przeciwieństwie do popularnych metod fotolitograficznych lub miękkiej litografii, biodruk ekstruzyjny ma tę zaletę, że nie wymaga osobnej maski ani stempla. Za pomocą oprogramowania CAD projekt konstrukcji można szybko zmienić i dostosować do wymagań operatora. To sprawia, że bioprinting jest bardziej elastyczny niż podejścia oparte na litografii.
Tutaj demonstrujemy drukowanie formy ofiarnej w celu stworzenia wielomateriałowej struktury 3D, używając jako przykładu szeregu filarów w hydrożelu. Filary te mogą reprezentować puste struktury sieci naczyniowej lub rurki w przewodzie prowadzącym nerwy. Materiałem wybranym do wykonania formy protektorowej był poloksamer 407, termoczuły polimer o doskonałych właściwościach drukarskich, który jest ciekły w temperaturze 4 °C i ma temperaturę ciała stałego powyżej temperatury żelowania ~20 °C dla roztworów 24,5% w/v18. Ta właściwość pozwala na elucję formy protektorowej na bazie poloksamera na żądanie i ma przewagę nad powolnym rozpuszczaniem materiału stałego, szczególnie w przypadku wąskich geometrii. Poloxamer został wydrukowany na szkiełkach mikroskopowych w celu stworzenia formy ofiarnej. Agarozę pipetowano do formy i schładzano aż do żelowania. Po elucji poloksamera w lodowatej wodzie, puste przestrzenie w formie agarozy wypełniono metakrylanem alginianu, wzbogaconym fibrynogenem znakowanym FITC. Wypełnione puste przestrzenie zostały następnie usieciowane promieniowaniem UV, a konstrukcja została zobrazowana za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Reprezentatywne wyniki pokazują, że technika odlewu odwróconego (przedstawiona na Rysunku 2) pozwala na stworzenie strukturalnego żelu, który może zostać wypełniony drugim materiałem. Na początku każdego procesu drukowania parametry druku są najpierw optymalizowane. Stopniowe dostrajanie parametrów prowadzi do uzyskania wydrukowanych struktur wielowarstwowych przedstawionych na Rysunku 3 i Rysunku 4 w przypadku drukowania pojedynczych linii. Jeśli grubość warstwy (podnie...

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej. Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydrukowanie negatywowej formy w celu stworzenia wzorcowanych hydrożeli dwuskładnikowych do hodowli komórek w 3D. Osiąga się to poprzez wydrukowanie negatywowej formy z polimeru termoodwracalnego, który w temperaturze 4 °C jest cieczą, a w temperaturze pokojowej miękkim żelem. Tę negatywową formę można w późniejszym czasie usunąć.Drugim krokiem jest wypełnienie formy odwróconej wybranym biopolimerem. W tym przypadku zastosowano aros. Biopolimer można sieciować enzymatycznie, za pomocą promieniowania UV lub termicznie.Następnie formę odwrócono poprzez zanurzenie jej w zimnej wodzie. Po tym etapie otrzymana forma AROS jest gotowa do dalszej obróbki. Ostatnim krokiem jest wypełnienie pustych przestrzeni drugim biopolimerem, który może zawierać komórki i może zostać usieciowany za pomocą enzymów, światła UV lub temperatury.W rezultacie opracowaliśmy powtarzalną metodę tworzenia przestrzennie zorganizowanych rusztowań do hodowli komórek D. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy kolega zasugerował, że możemy wykorzystać właściwości termoreaktywne Oxr, stosując go jako formę poświęcalną. Procedurę tę zaprezentuje Misha Muah, doktorant z mojego laboratorium.Aby rozpocząć, należy wlać 60 milliliters lodowatego roztworu PBS do szklanej butelki i intensywnie mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie odważyć 24,5 grams Paul ER i dodawać go małymi porcjami do zimnego PBS. Należy odczekać, aż Paul Oxr częściowo rozpuści się w PBS przed dodaniem kolejnej porcji.Nadal mieszaj roztwór, aż cały Paul Oxr zostanie rozpuszczony. Następnie dodaj lodowaty PBS do uzyskania końcowej objętości 100 milliliters, co zapewni końcowe stężenie 24.5%weight per volume. Następnie mieszaj mieszaninę do momentu jej dokładnego połączenia.Zaprzestań mieszania roztworu i pozostaw go w temperaturze 4 °C przez noc, aż pęcherzyki powietrza i piana z roztworu znikną. Pęcherzyki uwięzione w żelu zostaną przeniesione do wkładu drukarki, co doprowadzi do powstania wad w wydrukowanych formach ofiarnych. Przefiltruj roztwór sterylnie bezpośrednio do wkładu drukującego, używając schłodzonego wcześniej filtra, aby usunąć wszelkie niepożądane cząsteczki, które mogłyby zapchać igłę.Przechowywać wkład w temperaturze 4 °C do 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotować zawór elektromagnetyczny oraz igłę do drukowania, umieszczając je w osobnych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wypełnionych wodą ultrapure i sonikując je przez 30 minut. Następnie wypłukać oczyszczone zawory etanolem i osuszyć je za pomocą pistoletu azotowego.Następnie zainstaluj w drukarce czysty zawór elektromagnetyczny i igłę. Zainstaluj również pusty, czysty wkład drukujący w celu przetestowania systemu. Przyłóż do systemu ciśnienie 3 bar i przedmuchaj sprężonym powietrzem wszelkie pozostałości cieczy z zainstalowanego zaworu i igły.Dla małych średnic igieł. Zainstaluj filtr na wylocie sprężonego powietrza, aby zapobiec dostawaniu się małych cząstek, które mogłyby zapchać igłę. Następnie wyłącz ciśnienie.Gdy ciśnienie spadnie do zera, zamontuj wkład z uprzednio napełnionym poly oxr. Wkład należy wyjąć z lodówki około 30 minut przed montażem, aby wciąż płynny poly oxr mógł osiągnąć temperaturę pokojową i zgeliować przed drukowaniem. Sprawdź, czy poly oxr zgeliował, obracając wkład do góry nogami.Następnie przyłóż do układu ciśnienie trzech bar i dozuj Paul Emer, aż dotrze on do końcówki igły i zostanie wydrukowany w postaci ciągłej nici. Używając oprogramowania bio CAD, narysuj w menu ustawień drukarki pojedynczą linię o długości zbliżonej do struktury, którą zamierzasz wydrukować. W sekcji parametrów ustaw zawór elektromagnetyczny na wysoką częstotliwość 50 hertz i ręcznie dostrój ustawienie wysokiego ciśnienia do trzech bar.Następnie umieść szkiełko przedmiotowe w drukarce i zabezpiecz je, włączając podciśnienie. Następnie wydrukuj jedną warstwę pojedynczej linii przy prędkości przesuwu 300 millimeters per minute. Uzyskaj pożądaną szerokość linii, ręcznie zmniejszając ciśnienie oraz dostosowując ustawienia częstotliwości w oprogramowaniu dla każdej nowej linii, upewniając się, że linia pozostaje ciągła.Jeśli narysowana linia jest przerywana, oznacza to osiągnięcie dolnej granicy. Po uzyskaniu ciągłej linii o pożądanej szerokości należy określić optymalną prędkość stołu oraz grubość warstwy, sprawdzając wydrukowane konstrukcje pod kątem defektów. W celu precyzyjnego dostrojenia grubości warstwy może być konieczna również niewielka korekta ciśnienia i częstotliwości.Aby przetestować ustawienie grubości warstwy, wydrukuj kilka warstw jedna na drugiej i upewnij się, że igła znajduje się w odpowiedniej pozycji nad poprzednią warstwą. Dostosuj grubość warstwy tak, aby każda kolejna była drukowana bezpośrednio na poprzedniej. W celu optymalizacji prędkości stolika rozpocznij od stopniowego zmniejszania prędkości stolika z wartości 300 millimeters per minute, tak aby ekstrudowane warstwy rozpoczynały się i kończyły w tych samych pozycjach co poprzednie.Jeśli stolik porusza się zbyt szybko, na górnej powierzchni warstwy pojawi się wzór przypominający fale. W celu wydrukowania struktur filarowych, w oprogramowaniu CAD należy narysować pojedynczy punkt zamiast linii. Następnie należy precyzyjnie dostroić ciśnienie i częstotliwość, aby uregulować grubość warstwy i średnicę filara, a także czas kroku głowicy drukującej, aby zmaksymalizować prędkość druku.Po optymalizacji należy zapisać parametry do późniejszego wykorzystania. Najpierw wydrukuj strukturę wewnętrzną, taką jak ta macierz filarów, na szklanym szkiełku przedmiotowym i pozostaw do wyschnięcia. Suszenie przez noc zmniejsza rozmiar i grubość struktur oraz zapewnia lepszą adhezję między strukturą a podłożem.Następnego dnia narysuj strukturę składającą się z zewnętrznej ścianki otaczającej elementy, które mają zostać usunięte i wypełnione. Ze względu na wymiary igły, ścianka polimerowa powinna zostać wydrukowana w odległości co najmniej 3,5 mm od struktur wewnętrznych. Następnie przygotuj mieszaninę 1% aros w wodzie dejonizowanej, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej po całkowitym rozpuszczeniu.Ostudzić roztwór agro do temperatury od 35 do 45 stopni Celsjusza. Następnie, używając pipety, wypełnić formę poświęcalną roztworem agro. Należy to robić powoli, aby uniknąć zniszczenia struktury wewnątrz ścianki.Po napełnieniu umieść formę w temperaturze 4 °C, aby żel zastygł. Po około 10 minutach wyjmij żel z lodówki i umieść go w łaźni lodowej na 10 minut, aby wymyć strukturę polimerową. Następnie ostrożnie wyjmij strukturę i usuń pozostałą wodę, osuszając ją papierowym ręcznikiem.Ostrożnie dociśnij strukturę do nowego szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć szczelną blokadę zapobiegającą wyciekowi trzeciego hydrożelu. Następnie przygotuj 1% roztwór metakrylanu alginianu w 0,15 molarnym chlorku sodu. Wymieszaj roztwór w wirówce laboratoryjnej (vortex), aby rozpuścić metakrylan alginianu.Następnie dodaj 2,5% obj./obj. koniugatu fibrynogenu z Alexa Fluor 488 oraz 0,05% mas./obj. fosforanu litu fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilowego, aby otrzymać trzeci hydrożel, który można łatwo zwizualizować za pomocą fluorescencji.Przenieś ten roztwór do strzykawki o pojemności 0.3 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 G. Następnie za pomocą strzykawki wypełnij pustki powstałe po wypłukanym polimerze. Upewnij się, że każda kolumna została całkowicie wypełniona, wstrzykując polimer podczas wycofywania igły z każdej z nich.Na koniec przeprowadź fotopolimeryzację wstrzykniętego polimeru za pomocą lampy UV o wysokiej intensywności przez pięć minut, a następnie zobrazuj konstrukt za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Przedstawiona tutaj trójwymiarowa rekonstrukcja typu Zack dotyczy konstruktu podobnego do właśnie wykonanego, w którym do wypełnienia tła użyto alginianu znakowanego fluorescencyjnie. Kształty filarów widoczne są jako zielone kolumny, natomiast zewnętrzna część konstruktu jest przezroczysta.Techniki przedstawione w tym filmie można w szeroki sposób zaadaptować do wielu różnych układów 3D, takich jak pokazane tutaj kręgi koncentryczne. Rozdzielczość zależy od średnicy igły. Igła o średnicy 150 micronów użyta w tym projekcie może wytwarzać pasma o średnicy od 120 do 200 micronów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat etapów związanych z drukowaniem oxr. Zademonstrowaliśmy zastosowanie oxr jako formy poświęcalnej do tworzenia wzorowanych hydrożeli, jednak oxr może zostać również ustabilizowany za pomocą promieniowania UV, jeśli zastosowana zostanie wersja polimeru przeznaczona do produkcji.

printing-thermoresponsive-reverse-molds-for-creation-patterned-two

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Drukowanie termoorzeźwialnych form odwrotnych do stworzenia wzorcowanych dwuskładnikowych hydrożeli do 3D kultury komórek

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Poznaj metodę drukowania termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę architektury materiałów biologicznych.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Przeglądaj więcej filmów