Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Ogólnym celem tej procedury jest wydrukowanie odwróconej formy w celu stworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowej 3D. Osiąga się to poprzez najpierw wydrukowanie odwróconej formy z termoodwracalnego polimeru, który jest cieczą o temperaturze czterech stopni Celsjusza, ale miękkim żelem w temperaturze pokojowej. Tej odwróconej formy można później uniknąć.

Drugim krokiem jest wypełnienie odwróconej formy wybranym biopolimerem. Tutaj użyliśmy aros. Biopolimer może być sieciowany przez sieciowanie enzymatyczne, UV lub temperaturowe.

Następnie odwrócona forma jest nawiązywana do El, zanurzając formę w zimnej wodzie. Po tym kroku powstała forma AROS jest gotowa do dalszej obróbki. Ostatnim krokiem jest wypełnienie pustych przestrzeni drugim biopolimerem, który może zawierać komórki i może być sieciowany za pomocą enzymów, światła UV lub temperatury.

Ostatecznie opracowaliśmy powtarzalną metodę tworzenia rusztowań przestrzennie zorganizowanych do kultur komórkowych D. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy kolega zasugerował, że możemy wykorzystać właściwości termoczułe Oxr, używając go jako formy ofiarnej. Procedurę zademonstruje Misha Muah, doktorant z mojego laboratorium.

Na początek dodaj 60 mililitrów lodowatego roztworu PBS do szklanej butelki i energicznie mieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie odważ 24,5 grama Paul ER i dodaj go w niewielkich ilościach do zimnego PBS. Poczekaj, aż Paul Oxr częściowo rozpuści się w PBS, zanim dodasz więcej.

Kontynuuj mieszanie roztworu, aż cały Paul Oxr się rozpuści. Następnie dodaj dodatkowy lodowaty PBS, aż do osiągnięcia końcowej objętości 100 mililitrów, co daje końcowe stężenie 24,5% masy na objętość. Następnie mieszaj mieszaninę, aż będzie dobrze wymieszana.

Przestań mieszać roztwór i pozwól mu odpocząć w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aż znikną pęcherzyki i piana w roztworze. Bąbelki, które są uwięzione w żelu, są przenoszone do wkładu drukarki i prowadzą do wad w wydrukowanych formach ofiarnych. Sterylne Przefiltruj roztwór bezpośrednio do wkładu drukującego za pomocą wstępnie schładzonego filtra, aby usunąć wszelkie niepożądane cząsteczki, które mogłyby zatkać igłę.

Przechowuj wkład w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 30 minut przed eksperymentem. Przygotuj zawór elektromagnetyczny i igłę do drukowania, umieszczając je w oddzielnych 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych wypełnionych ultraczystą wodą i syndykując je przez 30 minut. Następnie oczyszczone zawory przepłukać etanolem i wysuszyć pistoletem do azotu.

Następnie zainstaluj czysty zawór elektromagnetyczny i igłę w drukarce. Zainstaluj również pusty, czysty nabój drukujący, aby przetestować system. Zastosuj ciśnienie trzech barów do systemu i wydmuchaj wszelkie resztki płynów z zainstalowanego zaworu i igły sprężonym powietrzem.

Do igieł o małych średnicach. Zainstaluj filtr na wylocie sprężonego powietrza, aby uniknąć przedostawania się małych cząstek, które mogłyby zatkać igłę. Następnie wyłącz ciśnienie.

Gdy ciśnienie spadnie do zera, zainstaluj wkład wstępnie załadowany z poly oxr. Wkład należy wyjąć z lodówki na około 30 minut przed zamontowaniem wkładu, aby jeszcze płynny poly oxr mógł osiągnąć temperaturę pokojową i żel przed wydrukowaniem. Sprawdź, czy poly oxr jest galaretowaty, odwracając wkład.

Następnie przyłóż ciśnienie trzech barów do systemu i dozuj Paul Emer, aż dotrze do końcówki igły i zostanie wytłoczony w ciągłym pasmie. Korzystając z oprogramowania bio CAD, narysuj pojedynczą linię o tej samej długości co struktura, którą zamierzasz wydrukować, w menu ustawień oprogramowania drukarki. Ustaw zawór elektromagnetyczny na wysoką częstotliwość 50 Hz w sekcji parametrów i ręcznie dostrój ustawienie wysokiego ciśnienia do trzech barów.

Następnie ustaw szklany mikroskop, wsuń drukarkę i zabezpiecz ją na miejscu, włączając próżnię. Następnie wydrukuj jedną warstwę pojedynczej linii z prędkością stołu montażowego 300 milimetrów na minutę. Uzyskaj żądaną szerokość linii, ręcznie zmniejszając ciśnienie i ustawienia częstotliwości w oprogramowaniu dla każdej nowej linii, upewnij się, że linia pozostaje ciągła.

Jeśli narysowana linia jest przerwana, oznacza to, że dolna granica została osiągnięta. Po uzyskaniu ciągłej linii o żądanej szerokości określ optymalną prędkość stolika i grubość warstwy, sprawdzając, czy w wydrukowanych konstrukcjach nie ma wad. Aby precyzyjnie dostroić grubość warstwy, może być również konieczne nieznaczne dostosowanie ciśnienia i częstotliwości.

Aby przetestować ustawienie grubości warstwy, wydrukuj kilka warstw jedna na drugiej i obserwuj, czy igła znajduje się we właściwej pozycji nad poprzednią warstwą. Dostosuj grubość warstwy tak, aby każda warstwa była drukowana bezpośrednio na poprzedniej. Aby zoptymalizować prędkość stołu montażowego, należy zacząć od stopniowego zmniejszania prędkości stołu montażowego z 300 milimetrów na minutę, tak aby warstwy wytłaczane zaczynały się i kończyły w tych samych pozycjach, co poprzednie.

Jeśli stół montażowy porusza się zbyt szybko, na górze warstwy pojawi się wzór przypominający falę. W przypadku drukowania konstrukcji słupów należy narysować pojedynczy punkt zamiast linii w oprogramowaniu CAD. Następnie dostosuj ciśnienie i częstotliwość, aby regulować grubość warstwy i średnicę słupka oraz czas kroku głowicy drukującej, aby zmaksymalizować prędkość drukowania.

Po zoptymalizowaniu zapisz parametry do późniejszego wykorzystania. Najpierw wydrukuj wewnętrzną strukturę, taką jak ten układ słupków, na szklanym szkiełku mikroskopowym i pozostaw do wyschnięcia. Suszenie przez noc zmniejsza rozmiar i grubość struktur oraz zapewnia lepszą przyczepność między strukturą a podłożem.

Następnego dnia narysuj strukturę, która składa się z zewnętrznego muru otaczającego konstrukcje, które zamierzasz usunąć i wypełnić. Ścianka polimerowa powinna być wydrukowana w odległości co najmniej 3,5 milimetra od struktur wewnętrznych ze względu na wymiary igły. Następnie przygotuj mieszaninę 1% aros w wodzie dejonizowanej, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej po całkowitym rozpuszczeniu.

Schłodzić roztwór agro do temperatury od 35 do 45 stopni Celsjusza. Następnie napełnij formę ofiarną roztworem agro za pomocą pipety. Należy to robić powoli, aby uniknąć zniszczenia konstrukcji wewnątrz ściany.

Po napełnieniu umieść formę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zestalić żel. Po około 10 minutach wyjmij żel z lodówki i umieść go w łaźni lodowej na 10 minut, aby wymyć strukturę polimeru. Następnie ostrożnie usuń strukturę i usuń resztki wody, osuszając ją chusteczką papierową.

Ostrożnie dociśnij strukturę do nowego szklanego szkiełka mikroskopowego, aby uzyskać dobre uszczelnienie zapobiegające wyciekom trzeciego hydrożelu. Następnie przygotuj 1% roztwór metakrylanu alginianu w 0,15 molowym chlorku sodu. Zwirować roztwór, aby rozpuścić metakrylan alginianu.

Następnie dodaj 2,5% głośności do objętości. Alexa, 4 88 sprzężony fibrynogen i 0,05% masy na objętość. Fosforan litu fenylu 2 4 6 trimetylobenzoilu w celu uzyskania trzeciego hydrożelu, który można łatwo uwidocznić za pomocą fluorescencji.

Umieścić ten roztwór w strzykawce o pojemności 0,3 mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30. Następnie za pomocą strzykawki wypełnij puste przestrzenie pozostawione przez wymykający się polimer. Upewnij się, że całkowicie wypełniłeś każdą kolumnę, wyrzucając polimer podczas wyciągania igły z każdej kolumny.

Na koniec należy fotopolimeryzować wstrzyknięty polimer lampą UV o wysokiej intensywności przez pięć minut, a następnie zobrazować konstrukt za pomocą epifluorescencji lub mikroskopu konfokalnego. Pokazana tutaj jest rekonstrukcja 3D Zacka konstrukcji podobnej do tej, która została właśnie wyprodukowana, fluorescencyjnie znakowanego alginianu używanego do zasypywania. Kształty filarów są wyświetlane jako zielone kolumny, a zewnętrzna część konstrukcji jest przezroczysta.

Techniki pokazane w tym filmie można w dużym stopniu dostosować do wielu różnych układów 3D, takich jak koncentryczne okręgi pokazane tutaj. Rozdzielczość zależy od średnicy igły. Igła o średnicy 150 mikronów użyta w tym projekcie może wytwarzać pasma o średnicy od 120 do 200 mikronów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć kroki związane z drukowaniem oxr. Wykazaliśmy zastosowanie oxr jako formy protektorowej do tworzenia hydrożeli wzorcowych, ale oxr może być również stabilizowany promieniami UV, jeśli używana jest wersja polimeru związana z produkcją.