Name: Testy żywotności komórek w hodowli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj kompleksowe testy żywotności komórek w hodowli, łączące pomiar poziomów ATP z immunobarwieniem białek cytoszkieletowych i obrazowaniem w podczerwieni. Ta metoda umożliwia obiektywną ocenę funkcji metabolicznej i integralności strukturalnej komórek w badaniach biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Juliannowi Jaumotte za pomysł zaoszczędzenia na ilości odczynników w teście ATP. Jesteśmy głęboko wdzięczni za wspaniałe wsparcie administracyjne Mary Caruso, Deb Willson i Jackie Farrer oraz Mylan School of Pharmacy za zapewnienie wsparcia finansowego dla tych badań. Podziękowania należą się również Fundacji Chorób Lękliwych Hunkele oraz Fundacji Zaburzeń Ruchowych i Parkinsona za wsparcie finansowe podstawowych badań neuronalnych.

Żaden z autorów nie ma żadnych konfliktów do ujawnienia.

Odkryliśmy, że siła sygnału we wszystkich trzech testach żywotności jest liniowa i skorelowana z gęstością posiewu. Jednak nie wszystkie testy są jednakowo wrażliwe na 2-krotne lub 1,5-krotne zmiany gęstości posiewu. W przypadku komórek N2a testy w podczerwieni są mniej czułe niż testy ATP, szczególnie przy niższych gęstościach posiewu. Chociaż testy w podczerwieni są mniej czułe niż ATP, testy DRAQ5 + Sapphire i testy α-tubuliny są zgodne, ponieważ ujawniają wysoce ochronny wpływ N-acetylocysteiny. W obu testach nastąpi...

Najczęstszym testem żywotności w naukach biologicznych jest liczenie komórek. Dowodzi tego analiza 200 najpopularniejszych (najnowszych) publikacji, które ukazały się w PubMed ze słowami kluczowymi "in vitro" lub "kultura" w dniach 29.04.2013 i 30.04.2013. Spośród tych publikacji 23,5% wykorzystywało testy zliczania komórek, w tym ręczne liczenie liczby komórek, automatyczne liczenie liczby komórek za pomocą oprogramowania do obrazowania i wykluczenie błękitu trypanowego. Test żywy/martwy został użyty w 1% tych publikacji. Liczba publikacji, w których zastosowano test MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) w celu oceny żywotności metabolicznej wyniosła 11%. To badanie literatury pokazuje również, że liczba publikacji wykorzystujących testy takie jak MTT w połączeniu z testami liczby komórek wyniosła tylko 3,5%. Pomimo tendencji do stosowania jednego testu żywotności samodzielnie, ocena funkcji komórkowej w połączeniu z liczbą komórek wydaje się najlepszym wyborem do oceny integralności komórkowej. Sama liczba komórek nie jest wystarczająca, ponieważ pozostałe komórki mogą nie być funkcjonalne lub zdrowe, mimo że są obecne w studzience1,2. I odwrotnie, miary funkcjonalne, takie jak ATP, mogą zwiększać się lub zmniejszać przy braku równoległych zmian w liczbie komórek. Rozdzielenie odczytów metabolicznych od liczby komórek sugeruje, że testy ATP i MTT nigdy nie powinny być stosowane jako jedyny test żywotności. W niniejszym raporcie opisano trzy testy żywotności, które badają zarówno struktury komórkowe, jak i funkcję metaboliczną, w celu uzyskania bardziej wszechstronnego obrazu integralności komórkowej niż jakikolwiek pojedynczy test może sobie pozwolić.

Dwa z naszych testów wymagają kamery na podczerwień, która mierzy fluorescencję w kanałach 700 i 800 nm. Szum jest niski w podczerwieni, co prowadzi do wyższych stosunków sygnału do szumu3. Używany przez nas imager Odyssey ma zakres dynamiki 4,5 log i głębię bitową 16, co przekłada się na 2,16 lub 65 536 odcieni podczerwieni. Można to skontrastować z 8-bitowym obrazowaniem kolorów, które zapewnia tylko 2,8 lub 256 odcieni kolorów dla każdej długości fali. Dzięki temu obrazowanie 16-bitowe ma lepszą rozdzielczość. Należy zauważyć, że oryginalne obrazy w podczerwieni są często pseudokolorowe na zielono (800 nm) i czerwono (700 nm) w opublikowanych raportach do prezentacji. Obrazowanie Odyssey jest powszechnie używane zarówno w westernach blotting, jak i w westernach In-Cell4-7. Westerny w komórkach na komórkach utrwalonych formaldehydem wykorzystują pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko dowolnemu białku będącemu przedmiotem zainteresowania i znakują je kolejno drugorzędowymi przeciwciałami fluorescencyjnymi w podczerwieni. Wiadomo, że technika ta jest szczególnie przydatna w przypadku punktów końcowych fosforylacji6. W naszych In-Cell Western barwimy utrwalone komórki pod kątem białek cytoszkieletu α-tubuliny lub białka związanego z mikrotubulami neuronalnymi 2 (MAP2) w kanale 800 nm. Białka te są wystarczająco obfite, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu. Barwimy również nasze płytki w kanale 700 nm dla jąder za pomocą barwienia DRAQ5 oraz dla cytoplazmy za pomocą barwienia szafirowego. Zarówno białka cytoszkieletu, jak i barwienia DRAQ5 + Sapphire odzwierciedlają zatem struktury komórkowe.

Trzeci test żywotności mierzy funkcję metaboliczną i nazywa się "Miano komórek Glo." W tym teście opartym na lucyferazie, wartości luminescencji są wprost proporcjonalne do poziomów ATP. Testy ATP są powszechnie stosowane do ilościowego oznaczania żywotnych komórek8-12. Jednak włączenie słowa "miano" do nazwy testu jest nieco mylące, ponieważ wartość wyjściowa ATP na komórkę może się zmieniać w funkcji leczenia toksynami i dlatego nie zawsze jest proporcjonalna do komórki numer8. Na poziom ATP mogą również wpływać rytmy okołodobowe13 oraz podział komórki14 i różnicowaniekomórek15. Niemniej jednak pokazany tutaj test ATP jest prosty do wykonania i użyteczny, ponieważ ATP jest solidną miarą żywotności metabolicznej16-21, jeśli nie liczby komórek jako takich. Użycie tego testu jako uzupełnienia podczerwieni In-Cell Westerns daje zatem bardziej wszechstronny obraz integralności komórkowej niż jakikolwiek pojedynczy test osobno.

<table><tbody><tr><td>Miano komórek Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Kup w ilości 100 ml i podwielokrotności, zamiast kupować droższą ilość 10 ml. Rozpuszczone, niewykorzystane odczynniki można ponownie zamrozić w temperaturze -20 & stopni; C przez co najmniej 21 tygodni</td></tr><tr><td>18% Formalina</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>Zakup tego utrwalacza pozwala uniknąć ważenia proszków formaldehydu i wrzenia roztworu; w ten sposób minimalizuje się narażenie na opary</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td> Nie <td>jest konieczne dodawanie tego do roztworów formaldehydu, ale poprawia wygląd komórek stałych:</td></tr><tr><td>Blok Odyssey</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Tę rybią surowicę można kupić luzem i zamrozić w temperaturze -20 & deg; C do długotrwałego stosowania</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Roztwór podstawowy 10% Triton-X 100 przechowujemy w sterylnej wodzie o temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Fosforan sodu Monobasic</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>Można również kupić tabletki PBS lub 10x roztwory PBS, ale są one droższe</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Patrz wyżej</td></tr><tr><td>Azydek sodu (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Nie kupuj proszku, ponieważ azydek sodu jest bardzo toksyczny. Wszystkie nasze zużyte przeciwciała przechowujemy w 1x azydku sodu w temperaturze 4 & stopni; C, dopóki nie zostaną skażone szczątkami</td></tr><tr><td>Mysia anty-&alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>To przeciwciało jest drogie, ale może być znacznie rozcieńczone i jest wysoce specyficzne</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>To przeciwciało jest drogie, ale jest wysoce specyficzne (warunek wstępny dla westernów w komórkach)</td></tr> <tr><td>800 nm Kozia anty-mysia IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Inne firmy również sprzedają przeciwciała drugorzędowe w podczerwieni. Pamiętaj, aby zakupić przeciwciała o wysokiej adsorpcji krzyżowej i pamiętać, że stężenia IgG mogą się różnić w zależności od źródła</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Związek ten był sprzedawany przez LI-COR w ilości 1 mM</td></tr><tr><td>Szafir</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 licznik wieloetykietowy</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>Shaker/Mixer</td><td>Research Products International</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

testy żywotności komórek w hodowli

Viability Assays for Cells in Culture

Ręczne liczenie komórek pod mikroskopem jest czułym sposobem oceny żywotności komórek, ale jest czasochłonne i dlatego kosztowne. Skomputeryzowane testy żywotności są drogie pod względem sprzętu, ale mogą być szybsze i bardziej obiektywne niż ręczne liczenie komórek. W niniejszym sprawozdaniu opisano zastosowanie trzech takich testów żywotności. Dwa z tych testów są w podczerwieni, a jeden luminescencyjny. Oba testy w podczerwieni opierają się na 16-bitowym obrazie Odyssey. Jeden test w podczerwieni wykorzystuje barwienie DRAQ5 dla jąder w połączeniu z barwieniem szafirowym dla cytozolu i jest wizualizowane w kanale 700 nm. Drugi test w podczerwieni, In-Cell Western, wykorzystuje przeciwciała przeciwko białkom cytoszkieletu (α-tubulina lub białko związane z mikrotubulami 2) i znakuje je w kanale 800 nm. Trzeci test żywotności jest powszechnie stosowanym testem luminescencyjnym dla ATP, ale używamy jednej czwartej zalecanej objętości, aby zaoszczędzić na kosztach. Wszystkie te pomiary są liniowe i korelują z liczbą platerowanych komórek, ale różnią się czułością. Wszystkie trzy testy pozwalają uniknąć czasochłonnej mikroskopii i pobierają próbki z całej studni, zmniejszając w ten sposób błąd pobierania próbek. Wreszcie, wszystkie testy można łatwo wykonać w ciągu jednego dnia od zakończenia eksperymentu, co pozwala na przeprowadzenie większej liczby eksperymentów w krótkich ramach czasowych. Jednak wszystkie opierają się na założeniu, że liczba komórek pozostaje proporcjonalna do siły sygnału po leczeniu, założenie, które czasami nie jest spełnione, zwłaszcza w przypadku komórkowego ATP. Ponadto, jeśli komórki zwiększają się lub zmniejszają po leczeniu, może to wpłynąć na siłę sygnału bez wpływu na liczbę komórek. Dochodzimy do wniosku, że wszystkie testy żywotności, w tym ręczne liczenie, są obarczone szeregiem zastrzeżeń, ale skomputeryzowane testy żywotności są warte początkowej inwestycji. Połączenie wszystkich trzech testów daje kompleksowy obraz struktury i funkcji komórek.

Czynnikiem ograniczającym tempo w tych eksperymentach jest barwienie podczerwone, ponieważ test ATP trwa stosunkowo krótko. W przypadku analiz podczerwonych przewidujemy, że w ciągu jednego dnia można zabarwić i zeskanować osiem płytek 96-dołkowych, wprowadzając kaskadowo dwie serie po cztery płytki każda (patrz Rycina 1). Szacunek ten zakłada 20 min fiksacji, 30 min płukania, 30 min blokowania, 2 h inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie 30 min płukania, 1 h inkubacji z przeciwciałem dru...

Związki terapeutyczne są często najpierw badane in vitro za pomocą testów żywotności. Zliczanie ślepych komórek przez ludzkiego obserwatora może być bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany liczby komórek, ale nie ocenia funkcji. Komputerowe testy żywotności, jak opisano tutaj, mogą ocenić zarówno strukturę, jak i funkcję w obiektywny sposób.

Testy żywotności komórek w hodowli

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie wielu testów żywotności, które zapewniają bardziej kompleksowy obraz kondycji komórkowej niż jakikolwiek pojedynczy test. Osiąga się to poprzez pomiar poziomów ATP w wysianych komórkach w celu oceny funkcji metabolicznej. Drugim krokiem jest immunostynowanie białek cytoszkieletu, takich jak alfa-tubulina lub białko MAP2 (microtubule-associated protein 2), przy użyciu przeciwciał podczerwonych o długości fali 800 nanometrów.Następnie komórki są znakowane barwnikami infrared Drac5 oraz Sapphire w celu zabarwienia jądra komórkowego i cytoplazmy przy 700 nanometrach. Ostatnim krokiem jest obrazowanie alfa-tubuliny lub MAP2 oraz Drac5 wraz z Sapphire przy długościach fal 700 i 800 nanometrów za pomocą obrazera podczerwieni. W rezultacie te testy luminescencyjne i podczerwone dostarczają informacji zarówno o strukturach anatomicznych, jak i funkcji fizjologicznej.Główną zaletą tych technik w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test żywotności MTT, jest szybki i czuły pomiar wielu aspektów integralności komórkowej. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach neuronauki i farmakologii, na przykład czy związ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Testy żywotności dla komórek w hodowli

Oznaczanie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. W tym filmie demonstrujemy sposób zliczania komórek przy użyciu hemacytometru.

Liczenie i określanie żywotności hodowli komórkowych

Zastosowanie testu kolonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest uznane od ponad 50 lat. W niniejszym materiale przedstawiamy ogólną procedurę przeprowadzania testu kolonogennego z wykorzystaniem komórek adherentnych.

Test klonogenny: komórki adherentne

Przedstawiono zmodyfikowany trójwymiarowy układ in vitro, w którym charakterystyka wzrostu kilku linii komórkowych nowotworu w zrekonstytuowanej błonie podstawnej koreluje z uśpionym lub proliferacyjnym zachowaniem komórek nowotworowych w wtórnym miejscu przerzutowym in vivo.

System In Vitro do badania uśpienia nowotworów i przejścia w wzrost przerzutny

Ten film opisuje technikę opartą na impedancji komórkowej do badania kinetyki przetrwania wirusów wywołujących efekty cytopatyczne. Metoda mierzy impedancję elektryczną zakażonych wirusem przylegających komórek wstępnie potraktowanych solą fizjologiczną.

Test kinetyki przeżycia oparty na impedancji komórkowej w celu oceny przeżycia wirusa

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Ten protokół przedstawia powszechnie stosowane testy cytotoksyczności (testy Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red i MTT) dostosowane do oceny cytotoksyczności w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na 96-dołkowych płytkach.

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Przedstawiamy tutaj protokół mającycy mierzenie przeżycia po stresie w próbkach drożdży. Test wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne, SYTO 9 i jodek propidiu (PI), do ilościowego określenia integralności błony plazmatycznej. Wykorzystuje cytometrię przepływową do dostarczania ilościowych i powtarzalnych szacunków ułamków żywych, martwych i uszkodzonych komórek dla próbek po stresie utlencyjnym.

Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

Poznaj kompleksowe testy żywotności komórek w hodowli, łączące pomiar poziomów ATP z immunobarwieniem białek cytoszkieletowych i obrazowaniem w podczerwieni. Ta metoda umożliwia obiektywną ocenę funkcji metabolicznej i integralności strukturalnej komórek w badaniach biologii komórkowej.

Testy żywotności komórek w hodowli

Przeglądaj więcej filmów