Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla niezróżnicowanych komórek nabłonka nosa na granicy faz cieczy. Osiąga się to poprzez uprzednie uzyskanie powierzchownych komórek nabłonka nosa od ludzkiego ochotnika. Drugim krokiem jest wysianie komórek na płytkach do hodowli tkankowych, a następnie namnażanie komórek w kolbach.

Następnie rozprężone komórki są wysiewane do transwelli i hodowane do współpłynności. Ostatnim krokiem jest usunięcie wierzchołkowej pożywki do hodowli tkankowej z zlewających się kultur komórkowych na transwellach w celu ustalenia warunków hodowli na granicy faz powietrze-ciecz. Ostatecznie komórki hodowane na granicy faz powietrza i cieczy przez trzy do czterech tygodni ponownie zróżnicują się w hodowlę komórek nabłonka błony śluzowo-rzęskowej nosa, naśladując fenotyp nabłonka nosa in vivo.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak hodowla, komórki nabłonka oskrzeli lub uzyskiwanie dostępnych na rynku komórek nabłonka oddechowego, jest zdolność badacza do ustalenia a priori populacji, z której mają zostać pobrane komórki nabłonka nosa. Biopsje nosa są znacznie mniej inwazyjne niż biopsje szczoteczki oskrzelowej podczas bronchoskopii, dlatego można pobierać próbki z populacji chorobowych o nasileniu umiarkowanym do ciężkiego bez żadnych znaczących skutków ubocznych. Chociaż ważne jest, aby pamiętać, że ta technika jest bardzo przydatna do badania wpływu czynników wziewnych na prawidłowy nabłonek oddechowy, ważne jest również, aby pamiętać, że każda z tych próbek pochodzi z unikalnego zestawu genetycznego, co czyni je ważnymi zasobami do badania chorób genetycznych, takich jak mukowiscydoza i pierwotna dyskineza rzęsek.

Procedurę zademonstruje Missy Brighton, technik z mojego laboratorium. W ramach przygotowań do biopsji skrobania nosa, osoba wyprostowana na krześle z prostym oparciem z głową odchyloną do tyłu, lekko powierzchowne komórki nabłonkowe wyściełające zakończenia nosa zostaną uzyskane pod bezpośrednim widzeniem przez dziewięciomilimetrowy polipropylenowy wziernik nosowy wielokrotnego użytku na operacyjnym autoscope ze wziernikiem. Urządzenie to zapewnia optymalną wizualizację zakończeń nosa i elastyczność ruchu.

Włóż wziernik autoskopu do nozdrza, a dolny koniec uwidoczniony za pomocą oświetlenia. Wprowadzić sterylną kiretę termoplastyczną przez wziernik z końcówką wysuniętą dystalnie do tyłu zakończenia, delikatnie uciskając dolną powierzchnię zakończenia. Przeciągnij łyżeczkę po powierzchni błony śluzowej pięć razy, a następnie wycofaj łyżeczkę.

Udane odzyskanie komórek błony śluzowej utrzymywanych przez działanie kapilarne będzie widoczne w filiżance kireta. Umieść łyżeczkę z komórkami w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów zawierającej osiem mililitrów RPMI 1 6 4 0 i umieść na lodzie w celu transportu do laboratorium. Użyj kleszczy, aby pobrać łyżeczkę z komórkami, a następnie użyj pipety P 1000, aby usunąć komórki z łyżeczki.

Wyrzuć kiretę. Komórki nabłonka nosa uzyskane w wyniku biopsji skrobania nosa są następnie umieszczane w czystej, zakodowanej na zimno 12-dołkowej płytce. Aby rozpocząć tę procedurę przy minimalnej objętości pożywki do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli lub BEGM plus plus około 80 do 100 mikrolitrów na studzienkę do jednego do czterech dołków powlekanej płytki, w zależności od wielkości biopsji.

Następnie za pomocą pipety P 1000 ostrożnie usuń osad tkanki biopsyjnej z probówki, nie odsysając zbyt dużej ilości pożywki. Przenieś pelety do środka studzienek zawierających media. Utrzymuj biopsję razem jako skupisko komórek.

Nie rozbijaj tego. Aby zrobić zawiesinę pojedynczej komórki. Dobra biopsja powinna dać do czterech studzienek, które można wysiać.

Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowej. Komórki umieszczone na płytce 12-dołkowej są monitorowane codziennie, aż osiągną płynność 80 do 90% CO, po czym są przenoszone do kolb w celu ekspansji. Ostrożnie odessać pożywkę z każdej studzienki, a następnie dodać 500 mikrolitrów punktu 25% trypsyny na. Studnia.

Utrzymuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki zostaną odłączone. Zwykle zajmuje to od dwóch do trzech minut, usuwa komórki poprzez pipetowanie w górę iw dół, a następnie przenosi oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej inhibitor trypsyny sojowej lub wirówkę SBTI do granulek po zasysaniu. S natin Resus zawiesić w jednym mililitrze, BEGM plus pożywkę i wirować rurkę, rozszerzać komórki w kolbie T 25 lub T 75, w zależności od wielkości granulki.

W tej demonstracji używana jest kolba T 75. Dodać pięć mililitrów, BEGM plus pożywkę do kolby, a następnie dodać zawiesinę komórek do kolby. Przenieść kolbę do inkubatora do hodowli tkankowych.

Po rozprężeniu NEC w kolbach, następnym krokiem jest wysiewanie komórek na wkładkach do hodowli tkankowych. Wyjąć pożywkę z kolby T 75 i dodać cztery mililitry. Trypsyna inkubuje komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut, aż komórki zostaną odłączone.

Usunąć komórki, stukając w kolbę i pipetując w górę i w dół. Przenieść do 15-mililitrowej probówki zawierającej SBTI. Przepłukać kolbę dwoma mililitrami.

Hanka, zrównoważyć roztwór soli i dodać do 15-mililitrowej probówki, odwirować granulkę, a następnie usunąć supra natin. Ostrożnie przygotuj płytki z 12 dołkami. Po podjęciu decyzji, ile talerzy zostanie wysianych, oznacz je tym samym kodem i numerem, numerem przejścia i datą.

Dodaj 700 mikrolitrów, BEGM plus pożywkę do komory podstawowej każdego z nich. Dobrze zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze, B-E-G-M-A-L-I. Media poprzez wirowanie rurki.

Policz komórki za pomocą hemocytometru, a ja zapętlam zawiesinę komórek za pomocą pożywki B-E-G-M-A-L-I do całkowitej objętości potrzebnej do ilości płytek, które powinny zostać wysiane. Dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na wierzchołkową stronę każdej niepowlekanej. Wkładka do ogniw 12-dołkowych.

Przenieś płytki do inkubatora do hodowli tkankowych w celu utrzymania kultur komórkowych. Zmieniaj nośnik co drugi dzień. Użyj pożywki B-E-G-M-A-L-I, 700 mikrolitrów na komorę podstawową i 200 mikrolitrów na komorę wierzchołkową.

Wkładki muszą być utrzymywane zanurzone, aż komórki całkowicie się zlewają. Dwa do sześciu dni po wysiewie na wkładkach do hodowli tkankowych komórki powinny być całkowicie zlewające się, bez widocznych w monowarstwie w celu ustanowienia granicy faz powietrze-ciecz lub LI 48 godzin po indukcji kwasem retinowym. Usuń wszystkie podłoża i dodaj 700 mikrolitrów pneumocykalnego, LI, pożywki konserwacyjnej tylko po stronie podstawno-bocznej.

Po stronie wierzchołkowej nie ma pożywki. Utrzymuj kultury komórkowe przez cztery tygodnie. W A LI.Proszę zapoznać się z załączonym tekstem protokołu, aby uzyskać więcej informacji na temat procedury ustanawiania i utrzymywania LI, ludzkie NEC hodowane zgodnie z protokołem pokazanym w tym filmie ponownie różnicują się w niejednorodną warstwę ECS składającą się z komórek rzęskowych i nieocenionych reprezentujących sytuację in vivo.

NEC utrwalono w 4% FA i zatopiono w parafinowych NEC. Kultury barwione hematyną i eozyną pokazano w panelu A. Niektóre ze zróżnicowanych NEC to komórki kubkowe wytwarzające śluz, zidentyfikowane na niebiesko w panelu B przez Iana Blue. Okresowe przesunięcie kwasu barwi ten obraz sekcji zatopionej w parafinie hematyny i eozyny w kulturze NEC pokazuje przykłady nieoptymalnych, niezróżnicowanych NEC przy użyciu innego protokołu i preparatów pożywek.

W przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano na poprzednim rysunku, komórki w tym miejscu są płaskonabłonkowe i nie są ani prostopadłościenne, ani stowarzyszone, i nie naśladują pseudos-warstwowego nabłonka oddechowego. Kluczowym punktem we wszystkich tych procedurach jest ten pierwszy, a jest nim pobranie naprawdę dobrej próbki nabłonka nosa. Prowadzi to do rozwoju całego systemu hodowli i rozwoju dobrego zróżnicowanego nabłonka in vitro Po tej procedurze.

Metody takie jak R-T-P-C-R, Western blotting, EIA, a także wiele innych technik komórkowych i biochemicznych można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na pytania związane z reakcjami wywołanymi przez czynniki wziewne lub patogeny. Nie każda biopsja skrobania z nosa przyniesie udane posiewy. Będzie to zależało od stanu pacjenta, a także od stanu pobranej tkanki.