Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych
9 sierpnia 2013
Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego. Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pierwotnych komórek mikrogleju z kory noworodka myszy lub rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Osiąga się to poprzez usunięcie najpierw mózgu poporodowego szczeniaka myszy zero lub dwóch myszy lub dorosłego rdzenia kręgowego. Następnie albo kora jest pobierana z tkanki noworodka, albo trawiona jest tkanka rdzenia kręgowego.
Komórki tkanki korowej i rdzeniowej są następnie hodowane do czasu użycia eksperymentalnego. Ostatecznie pobrane komórki mikrogleju noworodków i dorosłych mogą być analizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną zaletą naszego protokołu hodowli mikrogleju noworodków w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrząsanie komórkami mikrogleju w celu uzyskania mieszanych płytek korowych, jest to, że komórki łatwo wracają do stanu spoczynku i mogą zapewnić dokładniejszy obraz zachowania komórek mikrogleju in vivo.
Główną zaletą hodowli w mikrogleju z dorosłego rdzenia kręgowego jest to, że komórki można cytować w kontekście patologii, które wpływają głównie na dorosły ośrodkowy układ nerwowy Przed preparacją. Preco 10-centymetrowe naczynia do hodowli tkankowych z pięcioma mikrogramami na mililitr poli de lycyny lub PDL rozcieńczonymi w wodzie autoklawu Po trzech godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza odessać PDL i raz umyć płytki wodą z autoklawu tuż przed rozpoczęciem rozwarstwienia mikrogleju noworodków. Suszyć płytki w świetle UV w kapturze do hodowli tkankowych przez 20 minut.
Następnie użyj chusteczki Kim, nasączonej 70% etanolem, aby zdezynfekować głowy znieczulonych poporodowych dzieci od zera do dwóch szczeniąt po usunięciu głów nożyczkami. Umieść cztery główki na talerzu na 10-centymetrowych szalkach Petriego zawierających lodowaty zbuforowany roztwór soli fizjologicznej. Za pomocą zakrzywionych kleszczy zakotwicz głowy w oczodołach, a następnie użyj prostych mikrokleszczy, aby ostrożnie usunąć skórę pokrywającą czaszkę.
Następnie, zaczynając w pobliżu móżdżku, usuń kości czaszki, uważając, aby nie przebić ani nie uszkodzić kory. Użyj małej szpatułki, aby usunąć mózgi, gromadząc narządy na świeżej szalce Petriego zawierającej lodowaty HBSS. Teraz zaczynamy od brzusznej strony mózgu.
Przytrzymaj móżdżek mikrokleszkami, aby zakotwiczyć tkankę, a następnie wykonaj dwa małe nacięcia po obu stronach śródmózgowia bez przecinania całej tkanki. Delikatnie drażnij śródmózgowie i móżdżek w jednym kawałku z kory mózgowej, która powinna tworzyć wklęsły kształt. Następnie oddziel izolowaną korę i zorientuj pojedynczą korę przyśrodkową stroną do góry w celu dalszej sekcji.
Zarówno w protokole noworodkowym, jak i dorosłym, jednym z najbardziej złożonych etapów jest odpowiednie usunięcie opon mózgowych. Trudno jest również usunąć hipokamp. W protokole noworodkowym używamy lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanego przez motki, aby usztywnić tkanki, a także stosujemy powolną, metodyczną procedurę sekcji, aby zminimalizować rozdrabnianie.
Usuń hipokamp w kształcie półksiężyca znajdujący się naprzeciwko opuszki węchowej, która pojawia się jako mały guzek na spiczastym końcu kory. Następnie odwróć korę, aby wyświetlić stronę grzbietową. Następnie, używając opuszki węchowej jako punktu wyjścia, usuń wszystkie opony mózgowe i samą opuszkę węchową z kory.
Następnie wciągnij wypreparowaną korę do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 14 mililitrów lodowatego HBSS na lodzie. Teraz odessać HBSS z Cordis i użyć końcówki pipety P 1000, aby kilkakrotnie naciąć korę. Dodaj cztery mililitry trypsyny EDTA do tkanek, a następnie inkubuj tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po 15 minutach zatrzymaj reakcję enzymatyczną za pomocą czterech mililitrów kompletnej pożywki mikroglejowej, a następnie wiruj zawiesiny komórek przez pięć minut w temperaturze 1000 razy G i temperaturze pokojowej. Po drugim przemyciu czterema mililitrami kompletnej pożywki, zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach kompletnych pożywek mikroglejowych, a następnie przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko do komórek o siatce 40 mikronów. Na koniec ułóż komórki w gęstości ośmiu kory na 10 mililitrów pożywki mikroglejowej na jednej z 10-centymetrowych płytek do hodowli tkankowych pokrytych PD L i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Po 10 dniach hodowli komórkowej odłącz mikroglej, dodając 400 mikrolitrów 60-milimolowej lidokainy w HBSS do płytki do hodowli tkankowej i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Następnie zbierz ponownie zawieszone komórki. Opłucz płytkę raz za pomocą HBSS i zbierz płyn do płukania, aby odzyskać pozostały mikroglej.
Następnie dodaj 0,5 molowego EDTA do zawiesiny komórki do pięciomilimolowego stężenia końcowego, a następnie odwiruj reus komórek. Zawieś podniebienie w jednym mililitrze DMEM z 1% FBS i określ liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trianowego. Następnie hodować komórki w pożądanej gęstości doświadczalnej.
Na przykład, do analizy za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, płytki komórek w proporcji 2,5 razy 10 do czwartej komórki na 18 milimetrów szkiełka nakrywkowego do pobrania tkanek mikrogleju dla dorosłych. Zacznij od użycia 70% etanolu do oczyszczenia kręgosłupa dorosłej myszy poddanej eutanazji. Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć skórę powyżej rdzenia kręgowego i przystąp do wycięcia rdzenia kręgowego od obszaru T 1 do T 12.
Odetnij pozostały mięsień po bokach rdzenia kręgowego, a następnie delikatnie przytrzymaj rdzeń kręgowy opuszkami palców jednej ręki. Użyj mikronożyczek, aby powoli przecinać kręgi bez nakłuwania pępowiny. Następnie użyj pary mikrokleszczyków, aby powoli usunąć rdzeń kręgowy, zanurz rdzeń w szalce Petriego zawierającej lodowaty HBSS, a następnie usuń wszystkie widoczne opony mózgowe pod mikroskopem.
Teraz przetnij rdzeń kręgowy na poprzeczne segmenty, nie grubsze niż dwa milimetry, aby ułatwić efektywne trawienie, a następnie przenieś fragmenty do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej jeden mililitr chłodzonego lodem HBSS na lodzie. Aby strawić fragmenty tkanki rdzenia kręgowego, zacznij od odessania HBS z tkanki rdzenia kręgowego, uważając, aby nie naruszyć tkanki. Następnie inkubuj tkankę w jednym mililitrze trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po 30 minutach usuń trypsynę i dodaj trzy mililitry pierwotnej pożywki mikrogleju zawierającej surowicę, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Po kilkukrotnym pipetowaniu w górę i w dół w celu usunięcia tkanki, przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko do komórek o wielkości 40 mikronów. Następnie wymieszaj podwielokrotność zawiesiny komórek z równą objętością DPI i policz komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby określić całkowitą liczbę żywych komórek.
Na koniec umieść zdysocjowane komórki tkanki rdzenia kręgowego na płytkach pokrytych PD L w odpowiedniej gęstości eksperymentalnej. Wykonaj pełną wymianę podłoża cztery godziny po posiewaniu, aby usunąć nadmiar resztek komórek. W tym pierwszym zestawie obrazów spoczynkowe i aktywowane komórki mikrogleju są pokazane 24 godziny po posianiu mikrogleju, rozgałęziona lub rdzewiejąca morfologia ekspozycji na odczynnik wstępujący bakteryjny lipopolisacharyd powoduje zmiany w morfologii mikrogleju na bardziej ameboidalny kształt, gdy komórki stają się aktywowane.
Gałka oczna barwi marker specyficzny dla makrofagów i białka powierzchniowego komórek mikrogleju, który pojawia się na zielono, ułatwia wizualizację komórek. Obraz w jasnym polu pokazuje całe populacje komórek, a DPI w kolorze niebieskim podkreśla jądra i wskazuje czystość hodowli. Na tym reprezentatywnym obrazie komórek wyizolowanych z rdzenia kręgowego dorosłej myszy uzyskano około siedem razy 10 do piątej żywotnej komórki.
Ustawienia mikroskopu jasnego pola i mikroskopu fluorescencyjnego połączono w celu wizualizacji komórek DAPI dodatnich, a także siatki cytometru hemologicznego w celu dokładnego zliczenia komórek. Mikroglej w pełni przyczepiony do płytek hodowlanych pokrytych PD L po około dwóch dniach. W tutejszej hodowli mikroglej wyizolowany z rdzenia kręgowego zielonych myszy Mac, które wykazują ekspresję GFP pod kontrolą mikrogleju i promotora makrofagów CSF jeden R, pokazano na obrazie w jasnym polu.
Mikroglej, jak wskazują niebieskie strzałki, i astrocyty, jak wskazują czerwone strzałki, można zaobserwować po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu około godziny zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak akulturacja, mikroglej z innymi typami komórek, można przeprowadzić w celu zbadania wpływu, jaki mikroglej ma na inne komórki.
Po tej procedurze powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić delikatną sekcję niezbędną do hodowli komórek kory nowej, a także dorosłych komórek rdzenia kręgowego i wykorzystać te komórki w dalszych zastosowaniach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
Artykuł ten przedstawia metody efektywnej izolacji i hodowli żywych mikrogleju z tkanek noworodków i dorosłych myszy. Procedura umożliwia dissekcję i rozłożenie mikrogleju korowego w ciągu 90 minut, przy czym zbiór mikrogleju następuje po około 10 dniach.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórkowa
- Badania nad mikroglejem
Wprowadzenie
- Mikroglej to główne komórki układu odpornościowego w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Izolacja mikrogleju jest kluczowa dla badania jego roli w neurozapaleniu i neurodegeneracji.
- Istniejące metody mogą nie odzwierciedlać dokładnie zachowania mikrogleju in vivo.
- W badaniu tym przedstawiono nowatorskie podejście do hodowli mikrogleju, które utrzymuje jego stan spoczynku.
Cel badania
- Izolacja komórek mikrogleju pierwszorzędowego z tkanek noworodków i dorosłych myszy.
- Dostarczenie niezawodnej metody badania zachowania mikrogleju.
- Ulepszenie istniejących protokołów hodowli mikrogleju.
Wykorzystane metody
- Dissekcja kory noworodkowych myszy lub dorosłego rdzenia kręgowego.
- Zbiór tkanki korowej lub rdzeniowej do hodowli komórkowej.
- Trawienie tkanki w celu izolacji komórek mikrogleju.
- Hodowla izolowanych komórek mikrogleju aż do użycia w eksperymentach.
Główne wyniki
- Komórki mikrogleju można efektywnie izolować i hodować.
- Protokół umożliwia komórkom powrót do stanu spoczynku.
- Zebrane komórki można analizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Metoda zapewnia dokładniejsze odzwierciedlenie zachowania mikrogleju.
Wnioski
- Przedstawiony protokół stanowi znaczne ulepszenie w stosunku do tradycyjnych metod.
- Umożliwia naukowcom badanie komórek mikrogleju w stanie bardziej fizjologicznie istotnym.
- Podejście to może poprawić nasze zrozumienie funkcji mikrogleju w zdrowiu i chorobie.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Culturing primary microglia from neonatal and adult CNS tissues enables physiologically relevant models for neuroimmunology and neurodegeneration research. This approach supports target validation by providing a reproducible system to study microglial activation states and compound effects. The method enhances predictive confidence in preclinical screening by maintaining microglial resting states and minimizing culture artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways in disease-relevant neonatal and adult systems.
- Operational Value: Provides purified microglial cultures with minimal confounding cell types for target de-risking.
- Scientific Value: Supports functional validation of immunomodulatory targets through direct compound testing on primary microglia.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates scalable primary microglial cultures suitable for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Enables quantitative immunofluorescent readouts for activation state and morphology screening.
- Scientific Value: Facilitates dose-response testing of compounds that inhibit or promote microglial activation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Adult spinal cord microglia model postnatal pathologies affecting the CNS, improving translational relevance.
- Operational Value: Neonatal and adult microglia systems allow age-stratified preclinical modeling of neuroinflammatory conditions.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking microglial behavior to disease outcomes in development, MS, and spinal cord injury.
Pipeline & Workflow Integration
The microglial culture workflow fits within early discovery to preclinical stages, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity in neuroimmunology programs.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of microglial roles in CNS maturation, injury response, and synaptic plasticity.
- Screening: Delivers reproducible primary cell cultures with defined activation states for compound library screening.
- Analytics: Provides immunofluorescent microscopy and cell counting outputs for quantitative assessment of microglial phenotypes.
- Translational Research: Adult spinal cord microglia model supports preclinical studies of CNS pathologies like MS and spinal cord injury.
- Enterprise Reuse: Standardized dissection and plating process enables scalable microglial production across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through physiologically relevant microglial resting states and activation modeling.
- Operational Value: Reproducible isolation from defined CNS regions (cortex, spinal cord) minimizes variability across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling direct testing of immunomodulatory compounds on primary microglia.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of neuroinflammatory targets using validated microglial culture systems.
Implementation Considerations
- Expertise in neonatal and adult mouse tissue dissection under sterile conditions.
- Access to trypsin, EDTA, poly-D-lysine coating, and microglial culture media.
- Standardized protocols for meninges removal and tissue digestion to ensure consistency.
- Adaptation considerations for scaling cortical vs. spinal cord microglial yields.
- Limitations include manual dissection variability and 10-day culture timeline for experimental use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Neonatal Microglia Dissection: Day 0
4:24
Cell Culture: Day 0
5:31
Cell Culture: Day 10
6:40
Adult Microglia: Tissue Colection
9:07
Results: Representative Images of Neonatal and Adult Microglia
10:50
Conclusion
7:56
Digestion of Spinal Cord Tissue
