Name: Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli mikrogleju z kory mózgu noworodków oraz rdzenia kręgowego dorosłych myszy. Protokół umożliwia uzyskanie komórek w stanie spoczynkowym do badań immunofluorescencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Tsirka za ich rady i pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez R01NS42168 do SET, 12PRE12060489 do RB, NSF-3MT IGERT i stypendium Turner Dissertation do LT oraz NSF-3MT IGERT do JCN.

1. Sekcja (Dzień 0)
<ol>
	<li>Wywołaj znieczulenie u p0-2 mysich szczeniąt z hipotermią. Przetrzyj głowy szczeniąt chusteczką nasączoną 70% etanolem, aby zdezynfekować tkankę.</li>
	<li>Usuń głowy nożyczkami, używając 4 szczeniąt na 10 cm płytki hodowlanej. Umieść głowy na szalce Petriego zawierającej lodowaty bufor Hanka.</li>
	<li>Zakotwicz głowy za pomocą zakrzywionych kleszczy przez oczodoły i ostrożnie usuń skórę pokrywającą czaszkę prostymi mikrokleszkami.</li>
	<li>Usuń kości czaszki za pomocą prostych mikrokleszczyków, uważając, aby nie przebić ani nie uszkodzić kory mózgowej. Najskuteczniejszym sposobem jest rozpoczęcie usuwania zaczynając w pobliżu móżdżku, który znajduje się u podstawy głowy, ponieważ ten obszar zostanie odrzucony.</li>
	<li>Usuń mózg małą szpatułką i umieść (4) mózgi na świeżej szalce Petriego zawierającej lodowaty bufor Hanka.</li>
	<li>Wszystkie czynności od tego momentu wykorzystują mikrokleszcze i są wykonywane pod mikroskopem preparacyjnym. Zaczynając od brzusznej strony mózgu, zakotwicz tkankę, trzymając móżdżek i wykonaj dwa małe nacięcia po obu stronach śródmózgowia. Uważaj, aby nie przeciąć całej tkanki, ponieważ kora pokrywa śródmózgowie w tym obszarze.</li>
	<li>Delikatnie drażnij śródmózgowie i móżdżek w jednym kawałku z dwóch kory. Dwie kory powinny tworzyć wklęsły kształt.</li>
	<li>Oddziel dwie kory i ustaw jedną pojedynczą korę przyśrodkową stroną do góry w celu dalszej sekcji. Hipokamp może być trudny do zaobserwowania, ale znajduje się naprzeciwko opuszki węchowej, która pojawia się jako mały guzek na spiczastym końcu kory.</li>
	<li>Usuń hipokamp, który ma kształt półksiężyca. Odwróć korę, aby wyświetlić stronę grzbietową.</li>
	<li>Używając opuszki węchowej jako punktu wyjścia, usuń wszystkie opony mózgowe i samą opuszkę węchową z kory.</li>
	<li>Wypreparowaną korę należy umieścić w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z 14 ml zimnego buforu soli fizjologicznej Hanka na lodzie.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa (Dzień 0)
<ol>
	<li>Wstępnie pokryć 10-centymetrowe szalki do hodowli tkankowych 5 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) rozcieńczonej w autoklalawowanej wodzie przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać PDL i raz umyć płytki wodą z autoklawy. Suszyć płytkę w promieniowaniu UV w kapturze do hodowli tkankowych przez 20 minut. Ten krok należy wykonać tuż przed procesem preparacji.</li>
	<li>Odessać bufor Hanka z probówek zawierających korę mózgową z 4 mózgów każda, nałożyć 4 ml 1x roztworu trypsyny/EDTA, rozcierać tkankę końcówką p1000 i umieszczać probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 15 minut.</li>
	<li>Dodaj 4 ml kompletnej pożywki mikroglejowej na probówkę, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, wymieszaj i odwiruj zawartość z prędkością 1,5 tys. obr./min przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i powtórzyć płukanie 4 ml kompletnego podłoża. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnych pożywek mikrogleju (DMEM z 10% FBS, 1% pirogronianem sodu, 0,08% gentamycyny) i przefiltrować przez sitko do komórek o siatce 40 mikronów.</li>
	<li>Płytkę o gęstości 8 korowych na 10 ml umieścić na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (patrz protokół dla dorosłych mikrogleju).</li>
</ol>
(Dzień 3)
<ol>
	<li>Zmień pożywkę we wszystkich szalkach do hodowli komórkowych z kompletnymi pożywkami mikrogleju.</li>
</ol>
(Dzień 10)
<ol>
	<li>Dodaj 400 mikrolitrów 60 mM lidokainy w HBSS (w celu odłączenia mikrogleju) do pożywki z 10-centymetrowych płytek do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-15 minut.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę pożywki/ogniwa z płytki i umyć płytkę raz buforem Hanka. Zebrać bufor do płukania, aby odzyskać pozostały mikroglej.</li>
	<li>Dodać 5 mM EDTA (pH 8,0) do zawiesiny komórek do końcowego stężenia 50 μM lub w rozcieńczeniu 1:100.</li>
	<li>Odwiruj zawiesinę komórkową przy 1,000 x g (1,500 obr./min) przez 5 minut i ponownie zawieś w 1 ml DMEM z 1% FBS.</li>
	<li>Policz liczbę żywotnych komórek (zgodnie z dorosłym mikroglejem 3.1/3.2) i podziel komórki na płytki do hodowli tkankowych o pożądanej gęstości doświadczalnej. Około 1x106 mikrogleju pobiera się z 10-centymetrowej płytki zawierającej korę z 4 mózgów. Do immunofluorescencji zalecana jest gęstość 2,5x104 komórki na 18 mm szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 24 godziny, aby komórki mikrogleju w pełni powróciły do rozgałęzionego, spoczynkowego stanu przed użyciem.</li>
</ol>
Tekst protokołu: (Dorosły mikroglej)
1. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Płytki do hodowli tkankowych należy pokryć poli-D-lizyną (PDL) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem umyć płytki wodą z autoklawizu.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 i upewnij się, że eutanazja jest zakończona. Oczyść obszar rdzenia kręgowego 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek przeciąć skórę na górze rdzenia kręgowego, a następnie przystąp do wycinania rdzenia kręgowego od obszaru T1 do T12. Odetnij pozostały mięsień po bokach rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Powoli przecinaj kręgi za pomocą mikronożyczek, delikatnie trzymając rdzeń kręgowy opuszkami palców. Uważaj, aby nie przebić rdzenia kręgowego, ponieważ tkanka jest bardzo miękka. Powoli wyprowadź rdzeń kręgowy za pomocą mikrokleszczy.</li>
	<li>Zanurz rdzeń kręgowy na szalce Petriego zawierającej lodowaty HBSS. Za pomocą mikroskopu świetlnego usuń wszystkie widoczne opony mózgowe za pomocą mikrokleszczy</li>
	<li>Przetnij rdzeń kręgowy na segmenty poprzeczne wystarczająco małe, aby wytworzyć kilka fragmentów. Grubość fragmentów nie powinna być większa niż 2 mm, aby ułatwić sprawne trawienie. Przenieść fragmenty rdzenia kręgowego do stożkowej rurki o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml lodowatego HBSS. Trzymaj probówkę na lodzie aż do etapu trawienia.</li>
</ol>
2. Trawienie tkanek
<ol>
	<li>Odessać HBSS z 15 ml stożkowej rurki zawierającej tkankę rdzenia kręgowego. Uważaj, aby nie zassać żadnego kawałka tkanki.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny (2,5 g/l napromieniowanej trypsyny wieprzowej i 0,2 g/l EDTA w HBSS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Aby zatrzymać trawienie, usuń trypsynę i dodaj 3 ml pierwotnej pożywki dla mikrogleju, która zawiera surowicę, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół, aby usunąć tkankę. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o wielkości 40 μm.</li>
</ol>
3. Liczenie komórek i powlekanie
<ol>
	<li>Wymieszać równą objętość zawiesiny komórkowej i roztworu DAPI.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Płytka o gęstości między 5-7x105 komórek/ml w szalkach 35 x 10 mm pokrytych PDL. Posiew o mniejszej gęstości zapobiegał wzrostowi komórek, nawet gdy komórki były hodowane na płytkach 12-dołkowych, które mają mniejszą powierzchnię w porównaniu z szalkami o wymiarach 35 x 10 mm.</li>
</ol>

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Physiology%3A+Unique+Stimuli%2C+Specialized+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Env.+Res.+Pub.+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li>
<li>Emmetsberger, J., Tsirka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+inhibitory+factor+%28MIF%2FTKP%29+mitigates+secondary+damage+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury.</a> Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).</li>
<li>Gao, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+MS+Reveal+Multiple+Roles+of+Microglia+in+Disease+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis.</a> Neurol Res. Int. , 383087(2011).</li>
<li>Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4R%2B+microglia+drive+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">P2X4R+ microglia drive neuropathic pain.</a> Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).</li>
<li>Olson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+by+microglia+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune response by microglia in the spinal cord.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).</li>
<li>Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+inflammation+in+the+brain+and+spinal+cord+following+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury.</a> J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).</li>
<li>Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ex+vivo+nitric+oxide+production+by+acutely+isolated+neonatal+and+adult+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia.</a> J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).</li>
<li>Brannan, C. A., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+microglia+from+adult+mice+are+refractory+to+nitric+oxide-inducing+stimuli+due+to+impaired+NOS2+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression.</a> Glia. 48, 120-131 (2004).</li>
<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> J. Vis. Exp. (66), e3814(2012).</li>
<li>Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).</li>
<li>Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+regulate+the+number+of+functional+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microglia actively regulate the number of functional synapses.</a> PLoS One. 8, e56293(2013).</li>
<li>Tremblay, M. -È, Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microglia+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Comm.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for microglia in synaptic plasticity.</a> Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).</li>
<li>DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+microglial+phagocytosis+of+senile+plaque+cores+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expt.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease.</a> Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).</li>
<li>Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-12+production+by+central+nervous+system+microglia+is+inhibited+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes.</a> J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).</li>
<li>Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+induce+hemeoxygenase-1+expression+in+microglia%3A+a+feasible+mechanism+for+preventing+excessive+brain+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation.</a> J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).</li>
<li>Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101, 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ekdahl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+-+tuning+and+pruning+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis.</a> Front Pharmacol. 3, 14(2012).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55, 412-424 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroglej moduluje normalne funkcjonowanie OUN, a także reakcje zapalne na różne patologie. Funkcjonalna przebudowa synaps przez mikroglej jest zaangażowana w utrzymanie prawidłowej homeostazy mózgu 15. Podczas kaskady neurogennej uczestniczą w usuwaniu nerwowych komórek progenitorowych z zakrętu zębatego hipokampa 4, 16. Dlatego konieczne jest opracowanie systemu hodowli, w którym można by badać mikroglej noworodków i dorosłych, który obejmie ogromny obszar rozwoju i dorosłości, w którym mikroglej ...

Mikroglej to rezydujące komórki odpornościowe OUN, najbardziej przypominające obwodowe makrofagi pod względem budowy i funkcji 1. Niedawno wykazano, że postnatalne komórki mikrogleju pochodzą od prymitywnych przodków szpiku i są generowane przed ósmym dniem embriogenezy, co obala wcześniejszy pogląd, że pourodzeniowi przodkowie hematopoezy są źródłem mikrogleju w dorosłym mózgu 2. Odgrywają kluczową rolę w wielu chorobach neurologicznych i mogą szybko reagować na infekcję lub uraz, uwalniając cytokiny prozapalne lub przeciwzapalne 3. W związku z tym mikroglej obejmuje samodzielną jednostkę w OUN, którą można manipulować w celu wpływu na postęp choroby. Opracowanie solidnych i powtarzalnych metod izolowania i hodowli komórek mikrogleju noworodków lub dorosłych jest ważne dla przyszłych badań.
Mikroglej jest znany z tego, że odgrywa kluczową rolę w wielu patologiach mózgu. Ostatnio pojawiają się role komórek w prawidłowym rozwoju mózgu i funkcjonują jako nadmiar fagocytozy mikrogleju z nerwowych komórek progenitorowych z zakrętu zębatego hipokampa 1, 4. Mikroglej może również modulować kilka stanów neurologicznych, które wpływają na rdzeń kręgowy, takich jak stwardnienie rozsiane, ból neuropatyczny i uraz rdzenia kręgowego 5-7. Mikroglej rdzenia kręgowego reaguje inaczej niż mikroglej mózgu w odpowiedzi na sygnały aktywacji 8, 9, prawdopodobnie z powodu różnic w środowisku lokalnym. Dlatego ważne jest, aby stworzyć odpowiedni system in vitro do hodowli i badania mikrogleju rdzenia kręgowego. Mikroglej noworodków wytwarza znacznie więcej prozapalnego tlenku azotu cytokin w porównaniu z dorosłymi komórkami po stymulacji in vitro IFN-γ lub TNF-a10,11, co dodatkowo podkreśla potrzebę wykorzystania dorosłych komórek do badania mikrogleju w kontekście niektórych chorób.
Protokół, który stosujemy w laboratorium do hodowli mikrogleju noworodków, jest odmianą najnowszych metod, które wykorzystują wstrząsanie mieszanych kultur glejowych w celu usunięcia mikrogleju z powierzchni kolby do hodowli komórkowej 12. Opisujemy również metodę hodowli mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy w oparciu o protokół po raz pierwszy opisany przez Yipa i wsp. 13. Ta metoda zapewnia szybszy sposób hodowli dorosłych komórek w porównaniu z innymi dostępnymi protokołami 14. Powstały preparat składa się w 70% z mikrogleju; Pozostały procent składa się z astrocytów. Chociaż czystość naszej kultury jest niższa w porównaniu z innymi opublikowanymi metodami 13, ten system hodowli jest przydatny do badania reakcji mikrogleju w kulturze na różne bodźce aktywujące, a także do badania chorób, które wpływają głównie na rdzeń kręgowy i w których główną cechą jest silna reakcja zapalna.
Wszystkie opisane protokoły zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Stony Brook.

<table><tbody><tr><td>EDTA, 5mM</td><td>Invitrogen</td><td>15567-028</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina, 60mM</td><td>Sigma</td><td>L-5647</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1X</td><td>Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Cellgro</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Biowittaker</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10mm naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna, 100 &mu; g/ml</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczony 1:20</td></tr><tr><td>HBSS, 1X</td><td>Cellgro</td><td>20-023-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Mikroglej są komórkami rezydującymi w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i jako takie odgrywają niezwykle ważną rolę w procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak dojrzewanie OUN w rozwoju, stwardnienie rozsiane i uszkodzenie rdzenia kręgowego. Mikroglej może być aktywowany i rekrutowany do działania przez uszkodzenie neuronów lub stymulację, taką jak uszkodzenie aksonów obserwowane w stwardnieniu rozsianym lub niedokrwienny uraz mózgu wynikający z udaru. Uważa się również, że ci immunokompetentni członkowie OUN odgrywają rolę w plastyczności synaptycznej w warunkach niepatologicznych. Stosujemy protokoły hodowli mikrogleju z tkanek noworodków i dorosłych, które mają na celu maksymalizację liczby żywotnych komórek przy jednoczesnej minimalizacji zmiennych zakłócających, takich jak obecność innych typów komórek OUN i pozostałości po hodowli komórkowej. Wykorzystujemy duże i łatwo rozpoznawalne elementy OUN (np. korę, segmenty rdzenia kręgowego), co sprawia, że cały proces jest wykonalny i powtarzalny. Wykorzystanie dorosłych komórek jest odpowiednią alternatywą dla stosowania mikrogleju mózgu u noworodków, ponieważ wiele badanych patologii dotyczy głównie pourodzeniowego rdzenia kręgowego. Te systemy hodowli są również przydatne do bezpośredniego testowania wpływu związków, które mogą hamować lub promować aktywację mikrogleju. Ponieważ aktywacja mikrogleju może wpływać na wyniki choroby w ośrodkowym układzie nerwowym u dorosłych, istnieje zapotrzebowanie na systemy in vitro, w których można hodować i badać mikroglej noworodków i dorosłych.

Przykład komórek mikrogleju w stanie spoczynku i aktywowanych przedstawiono na Rysunku 1. Mikroglej został zobrazowany 24 h po wysianiu (Rysunek 1a) i wykazuje morfologię rozgałęzioną (spoczynkową). Ekspozycja na odczyn prymujący, bakteryjny lipopolisacharyd (LPS), prowadzi do zmian w morfologii mikrogleju w miarę aktywacji komórek (Rysunek 1b).
Przykład liczenia komórek przed wysianiem przedstawiono na Rysunku 2. Ze względu n...

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego. Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pierwotnych komórek mikrogleju z kory mózgu noworodka myszy lub rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie mózgu mysiego noworodka w zerowym lub drugim dniu po urodzeniu lub usunięcie rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Następnie pobiera się korę z tkanki noworodkowej lub poddaje się trawieniu tkankę rdzenia kręgowego.Komórki tkanki kory i rdzenia kręgowego są następnie hodowane do czasu wykorzystania w eksperymentach. Ostatecznie pobrane mikrogleje noworodkowe i dorosłe mogą zostać poddane analizie za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną zaletą naszego protokołu hodowli mikroglejów noworodkowych w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrząsanie komórek mikrogleju w mieszanych płytkach korowych, jest fakt, że komórki łatwiej powracają do stanu spoczynku, co pozwala na uzyskanie bardziej dokładnego obrazu zachowania komórek mikrogleju in vivo.Główną zaletą hodowli mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłych osobników jest możliwość analizy komórek w kontekście patologii dotykających głównie dorosły ośrodkowy układ nerwowy. Przed przeprowadzeniem sekcji, przygotuj 10-centymetrowe naczynia

culturing-microglia-from-the-neonatal-and-adult-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Hodowla mikrogleju z nowonarodzonego i dorosłego otoczenia ośrodkowego układu nerwowego

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Rozwój bólu neuropatycznego wiąże się z patologicznymi zmianami komórek glejowych rdzenia kręgowego. Brakuje niezawodnego systemu hodowli glejowej pochodzącego z dorosłej tkanki rdzenia kręgowego i przeznaczonego do badania tych komórek in vitro. Dlatego pokazujemy tutaj, jak ustalić pierwotne mieszane kultury glejowe z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Opisujemy zmodyfikowaną metodę ekstrakcji gorącym wodnym fenolem w celu oczyszczania lipopolisacharydu (LPS) z bakterii Gram-ujemnych. Po ekstrakcji LPS można następnie poddać analizie za pomocą SDS-PAGE i zwizualizować poprzez bezpośrednie barwienie lub Western immunoblot.

Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącą mieszaniną wodno-fenolową

Poznaj metodę izolacji i hodowli mikrogleju z kory mózgu noworodków oraz rdzenia kręgowego dorosłych myszy. Protokół umożliwia uzyskanie komórek w stanie spoczynkowym do badań immunofluorescencyjnych.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Przeglądaj więcej filmów