Separacja typów komórek spermatogennych za pomocą sedymentacji prędkości STA-PUT
9 października 2013
Metoda STA-PUT pozwala na rozdzielanie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie wielkości i gęstości.
Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie różnych typów komórek znajdujących się w jądrach. Najpierw zbierz mieszaną populację komórek od myszy. Jądra ładują komórki i gradient BSA do aparatu podtrzymującego.
Teraz pozwól komórkom osiadać przez gradient BSA. Następnie zbierz frakcje i połącz je w oparciu o skład komórek. Ostatecznie sedymentacja prędkości z pobytem w miejscu służy do oddzielania różnych typów komórek od jąder na podstawie różnic w wielkości i gęstości.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak fakty, jest to, że można wyizolować duże ilości różnych typów komórek o dość wysokiej czystości przy użyciu prostego szkła i grawitacji. Przymocuj dwa, dwulitrowe butle i komorę ładowania ogniw do górnej platformy i połącz wszystko za pomocą dwóch małych kawałków rurki z zaciskami rurowymi. Zaciśnij wszystkie rurki i uszczelnij wylewkę na skrajnym prawym dwulitrowym cylindrze.
Umieść małe mieszadło w komorze ładowania komórki, a większe mieszadło w skrajnym lewym cylindrze o pojemności dwóch litrów. Następnie umieść dwulitrową komorę sedymentacyjną na platformie. Umieść metalową przegrodę bezpośrednio na otworze w dnie komory sedymentacyjnej, aby zapobiec wirowaniu cieczy i zakłóceniu gradientu komórek podczas zbierania frakcji.
Teraz załóż pokrywkę na komorę sedymentacyjną. Nanieść bardzo małą ilość smaru próżniowego na szlifowane szklane złącze trójdrożnego kurka odcinającego. Następnie zacisnąć kurek odcinający na dnie komory sedymentacyjnej, łącząc szklane złącza kurka odcinającego i komory sedymentacyjnej.
Następnie podłącz komorę ładowania ogniw do prawego wylotu kurka odcinającego za pomocą wężyka. Zamknij kurek odcinający, a następnie przymocuj rurkę frakcjonowania komórek do lewego wylotu kurka odcinającego i zaciśnij małą rurkę na samym dole. Wlej 2% roztwór BSA do lewego dwulitrowego cylindra.
Wlej 4% roztwór BSA do prawego dwulitrowego cylindra. Upewnij się, że w rurkach łączących te cylindry nie ma dużych pęcherzyków. Wlej bufor Krebsa do komory ładowania komórek i napełnij rurkę łączącą tę komorę z komorą sedymentacyjną.
Sprawdź, czy nie ma dużych pęcherzyków, które mogłyby zakłócić gradient. W razie potrzeby delikatnie ściśnij lub potrząśnij rurką, aby usunąć pęcherzyki. Upewnij się, że wszystkie kreby znajdują się w probówce, a nie w komorze komórki.
Pozwolić, aby niewielka ilość buforu Krebsa spłynęła do komory sedymentacyjnej. Następnie spuść prawie cały bufor do rurki do frakcjonowania komórek. W celu napełnienia probówki i usunięcia wszelkich dużych pęcherzyków należy umieścić kolektor frakcji bezpośrednio pod komorą sedymentacyjną.
Sprawdź, czy wszystkie probówki z frakcją są na swoim miejscu i przykryj folią, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Odenkapsulować jądra w osobnej płytce zawierającej osiem mililitrów Krebsa. Wykonaj nacięcie w cienkiej błonie otaczającej kanaliki nasienne za pomocą jednej pary kleszczy.
Przytrzymaj teraz membranę za pomocą innej pary kleszczy. Wypchnij kanaliki na zewnątrz i z membrany. Przenieś cztery mililitry Krebsa zawierające kanaliki do każdej stożkowej probówki zawierającej 25 mililitrów roztworu kolagenazy.
Wstrząsaj w temperaturze 33 stopni Celsjusza przez 10 minut, aż kanaliki nabiorą wyglądu przypominającego spaghetti. Następnie pozwól kanalikom osiąść na pięć minut na dnie probówki. Wylać supernatant i przemyć dwukrotnie 25 mililitrami Krebsa w temperaturze pokojowej, pozwalając kanalikom za każdym razem osiąść na dnie probówki.
Pozostaw około pięciu mililitrów Krebsa w każdej tubce. Po inkubacji kanalików z trypsyną. Użyj pipety o szerokim otworze, aby wymieszać roztwór zawierający kanaliki.
Pipetowanie ich około 10 razy. Roztwór powinien zacząć wyglądać bardziej jak zawiesina pojedynczej komórki. Teraz przefiltruj każdą 30-mililitrową zawiesinę jednokomórkową przez sitko o siatce 100 mikronów.
Po połączeniu zawiesin komórkowych policz całkowitą liczbę komórek. Upewnij się, że kurek odcinający jest ustawiony tak, aby kierować przepływ z komory komórkowej do komory sedymentacyjnej. Ustaw obie płytki mieszadła na niskim poziomie.
Następnie wlej zawiesinę komórek do komory komórkowej. Otwórz kurek odcinający, aby komórki powoli przepływały do komory sedymentacyjnej z szybkością 10 mililitrów na minutę. Następnie zamknij kurek odcinający, aby wypłukać komórki z komory ogniwa.
Wlej pięć mililitrów 0,5% roztworu BSA i odcedź do komory sedymentacyjnej z szybkością 10 mililitrów na minutę. Zamknij kran i powtórz mycie BSA jeszcze cztery razy. Teraz otwórz zaciski między komorą celi a dwoma dwulitrowymi cylindrami, aby natychmiast spuścić ciecz do komory sedymentacyjnej z szybkością 40 mililitrów na minutę, wyreguluj natężenie przepływu tak, aby załadowanie gradientu BSA do komory sedymentacyjnej zajęło około 20 do 30 minut.
Monitorować, czy na powierzchni gradientu BSA znajduje się cienka, niezakłócona warstwa komórek. Po załadowaniu większości BSA zamknij kurek odcinający i przekręć go do pozycji, która umożliwi spływanie cieczy z komory sedymentacyjnej do rurki frakcjonującej. Teraz wyłącz płytki mieszające i pozwól komórkom osiadać przez godzinę i 45 minut.
Po zakończeniu sedymentacji przymocuj rurkę frakcji do kolektora frakcji. Wyreguluj natężenie przepływu za pomocą kurka odcinającego tak, aby co 45 sekund zbierano 10 mililitrów na probówkę zbiorczą. Po zebraniu wszystkich frakcji pod mikroskopem przeanalizuj frakcje dla różnych populacji komórek.
Można rozróżnić różne typy komórek na podstawie wielkości komórki i morfologii jądra, aby określić czystość każdej frakcji. Przenieś 10 mikrolitrów komórek barwionych DPI na szkiełko. Umieść szkiełko nakrywkowe i przeanalizuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Wyciągnij frakcje o podobnej wielkości i morfologii jądra, aby utworzyć populacje komórek. Typowy preparat składający się z około 22 jąder. Dzięki tej procedurze stay put daje około 10 do ósmych komórek.
Frakcje komórek metagenicznych Perper można szybko analizować przy użyciu kombinacji mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej. Komórki mioticzne, spermatogonia i diploidalne komórki somatyczne są największymi komórkami znajdującymi się w jądrach i będą zawierać duże jądra, które barwią się stosunkowo jednorodnie z dpi. Okrągłe spermatydy to mniejsze komórki z mniejszymi okrągłymi jądrami, na ogół z jaskrawo barwiącym się centrum chromo, kondensujące, wydłużające się spermatydy to małe komórki, które mają jądra w kształcie sierpa.
Po połączeniu frakcji komórkowych czystość można dalej określić za pomocą zachodniej analizy lizatów komórkowych we krwi. Typowymi markerami komórek mięśniowych są białka Synap Neal Complex one. Typowymi markerami kondensacji spermatyd są białka przejściowe lub protamina.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo po jej opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się spermatogenezą do zbadania procesów komórkowych w różnych typach komórek z jąder.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda STA-PUT umożliwia rozdzielenie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie ich wielkości i gęstości. Technika ta jest niezbędna do izolowania konkretnych typów komórek z jąder dla dalszych analiz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wprowadzenie
- Zrozumienie procesu spermatogenezy jest kluczowe dla zdrowia reprodukcyjnego.
- Różne typy komórek w jądrach posiadają odmienne role i charakterystyki.
- Techniki separacji usprawniają badanie tych typów komórek.
- Metoda STA-PUT wykorzystuje różnice w wielkości i gęstości do separacji komórek.
Cel badania
- Izolacja różnych populacji komórek spermatogennych.
- Poprawa zrozumienia składu komórkowego jąder.
- Ułatwienie dalszych badań nad funkcjami komórek spermatogennych.
Zastosowane metody
- Izolowanie mieszanych populacji komórek z jąder myszy.
- Ładowanie komórek i gradientu BSA do aparatu STA-PUT.
- Sedymentacja komórek przez gradient BSA.
- Zbieranie i łączenie frakcji w zależności od składu komórkowego.
Główne wyniki
- Skuteczne rozdzielenie różnych typów komórek spermatogennych.
- Wykazanie efektywności metody STA-PUT.
- Identyfikacja populacji komórek na podstawie ich wielkości i gęstości.
- Potencjalne zastosowania w dalszych badaniach nad spermatogenezą.
Wnioski
- Metoda STA-PUT jest niezawodną techniką separacji komórek.
- Metoda ta pogłębia zrozumienie różnorodności komórek spermatogennych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na wynikach uzyskanych w niniejszym badaniu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna separacja typów komórek spermatogennych jest kluczowa dla analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw spermatogenezy u ssaków, procesu, którego nie udało się jeszcze odtworzyć in vitro. Metoda sedymentacji prędkościowej STA-PUT umożliwia wysokowydajne i skalowalne wzbogacanie odrębnych populacji komórek jąder, wspierając wczesne odkrycia i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych z zakresu biologii rozrodu. Możliwość ta jest szczególnie cenna dla zespołów badawczo-rozwojowych nieposiadających dostępu do zaawansowanej infrastruktury sortowania komórek, co ułatwia rzetelną walidację celów oraz badania funkcjonalne.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie specyficznych dla typów komórek szlaków w spermatogenezie z wykorzystaniem populacji wzbogaconych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację funkcjonalnie odmiennych stadiów komórek linii płciowej do badań mechanistycznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez zapewnienie wystarczającej liczby komórek do dalszych analiz.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych, wzbogaconych frakcji komórkowych do ilościowego i powtarzalnego opracowywania testów.
- Wspiera standaryzację testów poprzez umożliwienie spójnej izolacji określonych typów komórek w różnych eksperymentach.
- Zapewnia wysoką wydajność, odpowiednią do skalowalnego przesiewania związków i ponownego wykorzystania platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia populacje komórek istotne dla przebiegu chorób w celu translacyjnego odkrywania biomarkerów w biologii rozrodu.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od wczesnej fazy odkryć po walidację przedkliniczną poprzez dostarczanie komórek pierwotnych do badań funkcjonalnych.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach przedklinicznych, umożliwiając precyzyjne przypisanie zaobserwowanych efektów do konkretnych typów komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda STA-PUT integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnej walidacji celu, poprzez rozwój testów, aż po badania przedkliniczne, szczególnie w przypadkach, gdy brakuje systemów różnicowania in vitro.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację konkretnych etapów spermatogenezy.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe frakcje komórek do dalszych analiz funkcjonalnych.
- Analityka: Umożliwia pomiar markerów specyficznych dla danego typu komórek oraz analizę wyników za pomocą mikroskopii i immunoblottingu.
- Badania translacyjne: Dostarcza populacje pierwotnych komórek do dopasowania biomarkerów i modelowania chorób.
- Wykorzystanie w skali instytucjonalnej: Oferuje skalowalne rozwiązanie niewymagające zaawansowanego sprzętu, które można dostosować do wielu programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych związanych z rozrodczością.
- Wartość operacyjna: Umożliwia uzyskanie wysokowydajnych, powtarzalnych frakcji komórek przy użyciu dostępnej aparatury.
- Wartość strategiczna: Pozwala na podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wspieranie generowania solidnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację programów biologii rozrodu z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymagana jest wiedza z zakresu sekcji jąder, pracy z komórkami oraz sedymentacji gradientowej.
- Niezbędne jest specjalistyczne, lecz powszechnie dostępne szkło laboratoryjne oraz dostęp do chłodni lub dużej lodówki.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie zbierania frakcji i oceny czystości.
- Metoda jest dostosowalna do różnych modeli gryzoni, lecz może wymagać optymalizacji dla innych gatunków.
- Czystość frakcji jest umiarkowana; niezbędna jest walidacja metodami analitycznymi (np. mikroskopią, immunoblottingiem).
