Separacja typów komórek spermatogennych za pomocą sedymentacji prędkości STA-PUT
October 9th, 2013
Metoda STA-PUT pozwala na rozdzielanie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie wielkości i gęstości.
Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie różnych typów komórek znajdujących się w jądrach. Najpierw zbierz mieszaną populację komórek od myszy. Jądra ładują komórki i gradient BSA do aparatu podtrzymującego.
Teraz pozwól komórkom osiadać przez gradient BSA. Następnie zbierz frakcje i połącz je w oparciu o skład komórek. Ostatecznie sedymentacja prędkości z pobytem w miejscu służy do oddzielania różnych typów komórek od jąder na podstawie różnic w wielkości i gęstości.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak fakty, jest to, że można wyizolować duże ilości różnych typów komórek o dość wysokiej czystości przy użyciu prostego szkła i grawitacji. Przymocuj dwa, dwulitrowe butle i komorę ładowania ogniw do górnej platformy i połącz wszystko za pomocą dwóch małych kawałków rurki z zaciskami rurowymi. Zaciśnij wszystkie rurki i uszczelnij wylewkę na skrajnym prawym dwulitrowym cylindrze.
Umieść małe mieszadło w komorze ładowania komórki, a większe mieszadło w skrajnym lewym cylindrze o pojemności dwóch litrów. Następnie umieść dwulitrową komorę sedymentacyjną na platformie. Umieść metalową przegrodę bezpośrednio na otworze w dnie komory sedymentacyjnej, aby zapobiec wirowaniu cieczy i zakłóceniu gradientu komórek podczas zbierania frakcji.
Teraz załóż pokrywkę na komorę sedymentacyjną. Nanieść bardzo małą ilość smaru próżniowego na szlifowane szklane złącze trójdrożnego kurka odcinającego. Następnie zacisnąć kurek odcinający na dnie komory sedymentacyjnej, łącząc szklane złącza kurka odcinającego i komory sedymentacyjnej.
Następnie podłącz komorę ładowania ogniw do prawego wylotu kurka odcinającego za pomocą wężyka. Zamknij kurek odcinający, a następnie przymocuj rurkę frakcjonowania komórek do lewego wylotu kurka odcinającego i zaciśnij małą rurkę na samym dole. Wlej 2% roztwór BSA do lewego dwulitrowego cylindra.
Wlej 4% roztwór BSA do prawego dwulitrowego cylindra. Upewnij się, że w rurkach łączących te cylindry nie ma dużych pęcherzyków. Wlej bufor Krebsa do komory ładowania komórek i napełnij rurkę łączącą tę komorę z komorą sedymentacyjną.
Sprawdź, czy nie ma dużych pęcherzyków, które mogłyby zakłócić gradient. W razie potrzeby delikatnie ściśnij lub potrząśnij rurką, aby usunąć pęcherzyki. Upewnij się, że wszystkie kreby znajdują się w probówce, a nie w komorze komórki.
Pozwolić, aby niewielka ilość buforu Krebsa spłynęła do komory sedymentacyjnej. Następnie spuść prawie cały bufor do rurki do frakcjonowania komórek. W celu napełnienia probówki i usunięcia wszelkich dużych pęcherzyków należy umieścić kolektor frakcji bezpośrednio pod komorą sedymentacyjną.
Sprawdź, czy wszystkie probówki z frakcją są na swoim miejscu i przykryj folią, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Odenkapsulować jądra w osobnej płytce zawierającej osiem mililitrów Krebsa. Wykonaj nacięcie w cienkiej błonie otaczającej kanaliki nasienne za pomocą jednej pary kleszczy.
Przytrzymaj teraz membranę za pomocą innej pary kleszczy. Wypchnij kanaliki na zewnątrz i z membrany. Przenieś cztery mililitry Krebsa zawierające kanaliki do każdej stożkowej probówki zawierającej 25 mililitrów roztworu kolagenazy.
Wstrząsaj w temperaturze 33 stopni Celsjusza przez 10 minut, aż kanaliki nabiorą wyglądu przypominającego spaghetti. Następnie pozwól kanalikom osiąść na pięć minut na dnie probówki. Wylać supernatant i przemyć dwukrotnie 25 mililitrami Krebsa w temperaturze pokojowej, pozwalając kanalikom za każdym razem osiąść na dnie probówki.
Pozostaw około pięciu mililitrów Krebsa w każdej tubce. Po inkubacji kanalików z trypsyną. Użyj pipety o szerokim otworze, aby wymieszać roztwór zawierający kanaliki.
Pipetowanie ich około 10 razy. Roztwór powinien zacząć wyglądać bardziej jak zawiesina pojedynczej komórki. Teraz przefiltruj każdą 30-mililitrową zawiesinę jednokomórkową przez sitko o siatce 100 mikronów.
Po połączeniu zawiesin komórkowych policz całkowitą liczbę komórek. Upewnij się, że kurek odcinający jest ustawiony tak, aby kierować przepływ z komory komórkowej do komory sedymentacyjnej. Ustaw obie płytki mieszadła na niskim poziomie.
Następnie wlej zawiesinę komórek do komory komórkowej. Otwórz kurek odcinający, aby komórki powoli przepływały do komory sedymentacyjnej z szybkością 10 mililitrów na minutę. Następnie zamknij kurek odcinający, aby wypłukać komórki z komory ogniwa.
Wlej pięć mililitrów 0,5% roztworu BSA i odcedź do komory sedymentacyjnej z szybkością 10 mililitrów na minutę. Zamknij kran i powtórz mycie BSA jeszcze cztery razy. Teraz otwórz zaciski między komorą celi a dwoma dwulitrowymi cylindrami, aby natychmiast spuścić ciecz do komory sedymentacyjnej z szybkością 40 mililitrów na minutę, wyreguluj natężenie przepływu tak, aby załadowanie gradientu BSA do komory sedymentacyjnej zajęło około 20 do 30 minut.
Monitorować, czy na powierzchni gradientu BSA znajduje się cienka, niezakłócona warstwa komórek. Po załadowaniu większości BSA zamknij kurek odcinający i przekręć go do pozycji, która umożliwi spływanie cieczy z komory sedymentacyjnej do rurki frakcjonującej. Teraz wyłącz płytki mieszające i pozwól komórkom osiadać przez godzinę i 45 minut.
Po zakończeniu sedymentacji przymocuj rurkę frakcji do kolektora frakcji. Wyreguluj natężenie przepływu za pomocą kurka odcinającego tak, aby co 45 sekund zbierano 10 mililitrów na probówkę zbiorczą. Po zebraniu wszystkich frakcji pod mikroskopem przeanalizuj frakcje dla różnych populacji komórek.
Można rozróżnić różne typy komórek na podstawie wielkości komórki i morfologii jądra, aby określić czystość każdej frakcji. Przenieś 10 mikrolitrów komórek barwionych DPI na szkiełko. Umieść szkiełko nakrywkowe i przeanalizuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Wyciągnij frakcje o podobnej wielkości i morfologii jądra, aby utworzyć populacje komórek. Typowy preparat składający się z około 22 jąder. Dzięki tej procedurze stay put daje około 10 do ósmych komórek.
Frakcje komórek metagenicznych Perper można szybko analizować przy użyciu kombinacji mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej. Komórki mioticzne, spermatogonia i diploidalne komórki somatyczne są największymi komórkami znajdującymi się w jądrach i będą zawierać duże jądra, które barwią się stosunkowo jednorodnie z dpi. Okrągłe spermatydy to mniejsze komórki z mniejszymi okrągłymi jądrami, na ogół z jaskrawo barwiącym się centrum chromo, kondensujące, wydłużające się spermatydy to małe komórki, które mają jądra w kształcie sierpa.
Po połączeniu frakcji komórkowych czystość można dalej określić za pomocą zachodniej analizy lizatów komórkowych we krwi. Typowymi markerami komórek mięśniowych są białka Synap Neal Complex one. Typowymi markerami kondensacji spermatyd są białka przejściowe lub protamina.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo po jej opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się spermatogenezą do zbadania procesów komórkowych w różnych typach komórek z jąder.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Metoda STA-PUT pozwala na separację różnych populacji komórek spermatogenetycznych na podstawie wielkości i gęstości. Technika ta jest niezbędna do izolowaniu określonych typów komórek z jąder w celu dalszej analizy.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Tło
- Rozumienie spermatogenezy jest kluczowe dla zdrowia rozrodczego.
- Różne typy komórek w jądrach mają odmienne role i cechy.
- Techniki separacji wspomagają badania tych typów komórek.
- Metoda STA-PUT wykorzystuje różnice wielkości i gęstości do separacji komórek.
Cel badania
- Isolowanie różnych populacji komórek spermatogenetycznych.
- Poprawa zrozumienia składu komórkowego jąder.
- Fascynacja dalszymi badaniami nad funkcjami komórek spermatogenetycznych.
Zastosowane metody
- Zbieranie mieszanych populacji komórek z jąder myszy.
- Ładowanie komórek i gradientu BSA do urządzenia STA-PUT.
- Zezwolone na sedymentację komórek przez gradient BSA.
- Zbieranie i łączenie frakcji w oparciu o skład komórkowy.
Główne wyniki
- Skuteczne oddzielenie różnych typów komórek spermatogenetycznych.
- Wykazanie skuteczności metody STA-PUT.
- Identyfikacja populacji komórek na podstawie wielkości i gęstości.
- Potencjalne zastosowania do dalszych badań nad spermatogenezą.
Wnioski
- Metoda STA-PUT jest niezawodną techniką separacji komórek.
- Ta metoda poprawia zrozumienie różnorodności komórek spermatogenetycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na wyniku tego badania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient separation of spermatogenic cell types is critical for dissecting the molecular mechanisms underlying mammalian spermatogenesis, a process not yet recapitulated in vitro. The STA-PUT velocity sedimentation method enables high-yield, scalable enrichment of distinct testicular cell populations, supporting early discovery and mechanistic de-risking in reproductive biology pipelines. This capability is particularly valuable for R&D teams lacking access to advanced cell sorting infrastructure, facilitating robust target validation and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific pathways in spermatogenesis using enriched populations.
- Supports biological de-risking by isolating functionally distinct germ cell stages for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in target validation by providing sufficient cell numbers for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, enriched cell fractions for quantitative and reproducible assay development.
- Supports assay standardization by enabling consistent isolation of defined cell types across experiments.
- Delivers high-yield outputs suitable for scalable compound screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cell populations for translational biomarker discovery in reproductive biology.
- Enables continuity from early discovery to preclinical validation by supplying primary cells for functional studies.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by allowing precise cell-type attribution of observed effects.
Pipeline & Workflow Integration
The STA-PUT method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially where in vitro differentiation systems are lacking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific spermatogenic stages.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell fractions for downstream functional assays.
- Analytics: Enables measurement of cell-type specific markers and outputs via microscopy and immunoblotting.
- Translational Research: Supplies primary cell populations for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, equipment-light solution adaptable across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive target validation.
- Operational Value: Delivers high-yield, reproducible cell fractions using accessible instrumentation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of reproductive biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in testis dissection, cell handling, and gradient sedimentation.
- Needs specialized but widely available glassware and cold-room or large refrigerator access.
- Demands cross-team standardization for fraction collection and purity assessment.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for other species.
- Fraction purity is moderate; downstream validation (e.g., microscopy, immunoblotting) is essential.
