Zachodnia plama
Western Blotting to potężna technika wykorzystywana przez wielu badaczy do identyfikacji obecności określonych białek w elektroforetycznej, oddzielonej próbce za pomocą przeciwciał.
Istnieją 3 główne etapy tej techniki, które są niezbędne do uzyskania wysokiej jakości wyniku: elektroblotting, immunoblotting i wykrywanie. Przed przystąpieniem do tych etapów należy przeprowadzić SDS-PAGE, w którym zdenaturowane białka są rozdzielane według wielkości w żelu poliakrylamidowym.
Elektroblotting jest również znany jako zachodni "transfer" i wymaga kasety transferowej do trzymania razem "kanapki", a także aparatu do przenoszenia białka z żelu akrylowego na cienką membranę. Kanapka do elektrobibuły składa się z żelu i specjalistycznej membrany, umieszczonej między dwoma kawałkami bibuły filtracyjnej. Podczas transferu wykorzystywane jest pole elektryczne do przemieszczania białek przez żel, gdzie zostają one uwięzione na błonie w wyniku naładowanych i hydrofobowych interakcji.
Immunoblotting wykorzystuje przeciwciała do "sondowania" błony pod kątem określonych białek. Przeciwciała to duże białka w kształcie litery Y, które zawierają dwa fragmenty, znane również jako regiony Fab, które wiążą się z innymi białkami. Region Fab określa specyficzny epitop lub określoną część białka, z którą wiąże się przeciwciało.
Przeciwciała monoklonalne to przeciwciała, które rozpoznają pojedynczy epitop i są preferowanym typem przeciwciał stosowanym w immunoblottingu ze względu na ich specyficzność. Natomiast przeciwciała poliklonalne to seria różnych przeciwciał, które celują w wiele epitopów na tym samym antygenie – lub białku, dla którego przeciwciało ma swoistość. Preferowane są przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają epitop liniowy, ponieważ zapewnia to, że epitop można znaleźć na denaturowanym lub zlinearyzowanym białku. Jest to ważne, ponieważ wiele przeciwciał rozpoznaje tylko epitopy konformacyjne, co oznacza, że rozpoznają białka tylko w ich natywnym stanie 3D.
Oprócz fragmentów Fab przeciwciała zawierają region Fc, który jest specyficzny dla zwierzęcia, które wytworzyło przeciwciało. W immunoblottingu region ten jest głównie wykorzystywany jako epitop dla przeciwciała drugorzędowego – przeciwciała, które rozpoznaje pierwsze przeciwciało, które związało się z białkiem, które próbujesz wykryć.
Aby wytworzyć obserwowalny sygnał, przeciwciała są często połączone, poprzez region Fc, z enzymem reporterowym, takim jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa. Te enzymy reporterowe wytwarzają sygnały, reagując z substratami, powodując zmiany koloru lub wywołując zmiany światła.
Zmiany te można następnie określić ilościowo za pomocą densytometrii. Densytometria to technika stosowana do pomiaru gęstości prążka białkowego za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu obliczenia gęstości każdego prążka. Pasma mogą być następnie bezpośrednio oznaczane ilościowo przy użyciu wzorców referencyjnych lub kontrolowane wewnętrznie przy użyciu próbki kontrolnej.
Aby transfer zachodni zakończył się sukcesem, żel jest najpierw równoważony w buforze transferowym przez 15 minut. Membrana powinna być również zrównoważona zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie kanapka z żelem transferowym jest starannie przygotowywana w buforze transferowym, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków w systemie. Bąbelki uwięzione w kanapce można wypchnąć, przetaczając je po nich małą pipetą. Nawet małe pęcherzyki mogą przerwać przenoszenie białek, powodując niepełny transfer, co można zobaczyć w dolnych częściach tej błony.
Po zmontowaniu do komory transferowej wlewa się dodatkowy bufor transferowy i pracuje on pod ciśnieniem 20-30 mA przez 2-3 godziny. Bufor transferowy zawiera metanol, który zwiększa wiązanie białek z błoną.
Po zakończeniu transferu kaseta jest demontowana, a jakość transferu można sprawdzić za pomocą niespecyficznego barwnika białkowego, takiego jak Ponceau S. Zapewnia to szybkie i odwracalne wykrywanie prążków białkowych.
Pierwszym etapem immunoblottingu jest pokrycie pozostałych obszarów błony rozcieńczonym roztworem białek. Ten etap nazywa się blokowaniem i jest wykonywany w celu zablokowania błony i zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciała z błoną. Zazwyczaj roztwór blokujący składa się z albuminy surowicy bydlęcej lub odtłuszczonego mleka w proszku rozpuszczonego w buforowanym roztworze soli fizjologicznej. Ten krok jest zwykle wykonywany przez 1 godzinę do nocy na shakerze.
Następnym krokiem jest inkubacja błony z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w roztworze blokującym. Ten krok może trwać od 30 minut do nocy i powinien być wykonywany z delikatnym mieszaniem.
Następnie membrana jest dokładnie płukana w celu zmniejszenia niespecyficznego barwienia tła, a przeciwciało drugorzędowe jest dodawane jako bufor blokujący do membrany. Po krótkiej inkubacji membrana jest ponownie dokładnie płukana.
Przeciwciała drugorzędowe są wykrywalne dzięki enzymom reporterowym, które są z nimi połączone. Po dodaniu odpowiedniego podłoża można zobrazować zmiany kolorymetryczne lub chemiluminescencyjne, a następnie zmierzyć je za pomocą technik densytometrycznych. Ponadto drabinka białkowa stanowi cenne odniesienie do rozmiaru, dzięki czemu liniowy rozmiar każdego białka można oszacować na podstawie tego, jak daleko migrowało ono w żelu w stosunku do markerów wielkości w drabince. Obserwacja wielkości białek wykrytych za pomocą immunoblottingu jest dobrym sposobem na sprawdzenie, czy przeciwciało rozpoznaje właściwe białko i czy jest to monomer, czy wiele kopii białka, które są obserwowane.
Istnieją tysiące dostępnych na rynku przeciwciał pierwotnych, które pozwalają na wykrycie i ilościowe określenie określonych białek w próbce. Tutaj badacz używa przeciwciała przeciwko HIF-1α do pomiaru ilości tego czynnika transkrypcyjnego reagującego na tlen w kulturach komórkowych w celu zbadania niedotlenienia. Użyli również przeciwciała przeciwko beta-aktynie, które działało jako kontrola obciążenia. Jak widać, komórki hodowane w normalnych warunkach tlenowych wytwarzały znacznie mniej HIF-1 niż te hodowane w warunkach niskiego poziomu tlenu.
Połączenie elektroforezy żelowej 2D i immunoblottingu może dostarczyć cennych informacji na temat obecności kompleksów białkowych. W tym przypadku próbki były najpierw badane według wielkości kompleksu białkowego, a następnie denaturowane, tak aby każde pojedyncze białko w kompleksie można było oddzielić według ich indywidualnej wielkości. Przeciwciała dla trzech różnych białek wykazują trzy unikalne kompleksy zawierające różną liczbę tych białek, z których każdy jest ułożony w linii pionowej. Skrajna lewa kolumna zawiera beta-2 i MCP-21, a także inne białko, którego nie wykazują te markery. Środkowa kolumna pokazuje kompleks, który zawierał wszystkie 3 białka, a prawa kolumna zawierała tylko beta-2 i MCP-21.
Immunoblotting może być również stosowany do wizualizacji interakcji białko-białko. Odbywa się to poprzez najpierw przeniesienie białek z żelu na błonę nitrocelulozową, a następnie sondowanie tej błony dodatkowymi białkami. Immunoblotting jest następnie stosowany do wykrywania, czy dodane białka są skompleksowane z którymkolwiek z białek, które zostały unieruchomione na błonie.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat immunoblottingu. Powinieneś teraz zrozumieć, jak przenosić białka do błony, sondować błonę za pomocą przeciwciał i wykrywać sygnał. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Western Blotting służy do identyfikacji obecności określonych białek w próbkach oddzielonych elektroforetycznie. Po rozdzieleniu techniką znaną jako e…
Western Blotting to potężna technika wykorzystywana przez wielu badaczy do identyfikacji obecności określonych białek w elektroforetycznej, oddzielonej próbce za pomocą przeciwciał.
Istnieją 3 główne etapy tej techniki, które są niezbędne do uzyskania wysokiej jakości wyniku: elektroblotting, immunoblotting i wykrywanie. Przed przystąpieniem do tych etapów należy przeprowadzić SDS-PAGE, w którym zdenaturowane białka są rozdzielane według wielkości w żelu poliakrylamidowym.
Elektroblotting jest również znany jako zachodni "transfer" i wymaga kasety transferowej do trzymania razem "kanapki", a także aparatu do przenoszenia białka z żelu akrylowego na cienką membranę. Kanapka do elektrobibuły składa się z żelu i specjalistycznej membrany, umieszczonej między dwoma kawałkami bibuły filtracyjnej. Podczas transferu wykorzystywane jest pole elektryczne do przemieszczania białek przez żel, gdzie zostają one uwięzione na błonie w wyniku naładowanych i hydrofobowych interakcji.
Immunoblotting wykorzystuje przeciwciała do "sondowania" błony pod kątem określonych białek. Przeciwciała to duże białka w kształcie litery Y, które zawierają dwa fragmenty, znane również jako regiony Fab, które wiążą się z innymi białkami. Region Fab określa specyficzny epitop lub określoną część białka, z którą wiąże się przeciwciało.
Przeciwciała monoklonalne to przeciwciała, które rozpoznają pojedynczy epitop i są preferowanym typem przeciwciał stosowanym w immunoblottingu ze względu na ich specyficzność. Natomiast przeciwciała poliklonalne to seria różnych przeciwciał, które celują w wiele epitopów na tym samym antygenie – lub białku, dla którego przeciwciało ma swoistość. Preferowane są przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają epitop liniowy, ponieważ zapewnia to, że epitop można znaleźć na denaturowanym lub zlinearyzowanym białku. Jest to ważne, ponieważ wiele przeciwciał rozpoznaje tylko epitopy konformacyjne, co oznacza, że rozpoznają białka tylko w ich natywnym stanie 3D.
Oprócz fragmentów Fab przeciwciała zawierają region Fc, który jest specyficzny dla zwierzęcia, które wytworzyło przeciwciało. W immunoblottingu region ten jest głównie wykorzystywany jako epitop dla przeciwciała drugorzędowego – przeciwciała, które rozpoznaje pierwsze przeciwciało, które związało się z białkiem, które próbujesz wykryć.
Aby wytworzyć obserwowalny sygnał, przeciwciała są często połączone, poprzez region Fc, z enzymem reporterowym, takim jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa. Te enzymy reporterowe wytwarzają sygnały, reagując z substratami, powodując zmiany koloru lub wywołując zmiany światła.
Zmiany te można następnie określić ilościowo za pomocą densytometrii. Densytometria to technika stosowana do pomiaru gęstości prążka białkowego za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu obliczenia gęstości każdego prążka. Pasma mogą być następnie bezpośrednio oznaczane ilościowo przy użyciu wzorców referencyjnych lub kontrolowane wewnętrznie przy użyciu próbki kontrolnej.
Aby transfer zachodni zakończył się sukcesem, żel jest najpierw równoważony w buforze transferowym przez 15 minut. Membrana powinna być również zrównoważona zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie kanapka z żelem transferowym jest starannie przygotowywana w buforze transferowym, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków w systemie. Bąbelki uwięzione w kanapce można wypchnąć, przetaczając je po nich małą pipetą. Nawet małe pęcherzyki mogą przerwać przenoszenie białek, powodując niepełny transfer, co można zobaczyć w dolnych częściach tej błony.
Po zmontowaniu do komory transferowej wlewa się dodatkowy bufor transferowy i pracuje on pod ciśnieniem 20-30 mA przez 2-3 godziny. Bufor transferowy zawiera metanol, który zwiększa wiązanie białek z błoną.
Po zakończeniu transferu kaseta jest demontowana, a jakość transferu można sprawdzić za pomocą niespecyficznego barwnika białkowego, takiego jak Ponceau S. Zapewnia to szybkie i odwracalne wykrywanie prążków białkowych.
Pierwszym etapem immunoblottingu jest pokrycie pozostałych obszarów błony rozcieńczonym roztworem białek. Ten etap nazywa się blokowaniem i jest wykonywany w celu zablokowania błony i zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciała z błoną. Zazwyczaj roztwór blokujący składa się z albuminy surowicy bydlęcej lub odtłuszczonego mleka w proszku rozpuszczonego w buforowanym roztworze soli fizjologicznej. Ten krok jest zwykle wykonywany przez 1 godzinę do nocy na shakerze.
Następnym krokiem jest inkubacja błony z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w roztworze blokującym. Ten krok może trwać od 30 minut do nocy i powinien być wykonywany z delikatnym mieszaniem.
Następnie membrana jest dokładnie płukana w celu zmniejszenia niespecyficznego barwienia tła, a przeciwciało drugorzędowe jest dodawane jako bufor blokujący do membrany. Po krótkiej inkubacji membrana jest ponownie dokładnie płukana.
Przeciwciała drugorzędowe są wykrywalne dzięki enzymom reporterowym, które są z nimi połączone. Po dodaniu odpowiedniego podłoża można zobrazować zmiany kolorymetryczne lub chemiluminescencyjne, a następnie zmierzyć je za pomocą technik densytometrycznych. Ponadto drabinka białkowa stanowi cenne odniesienie do rozmiaru, dzięki czemu liniowy rozmiar każdego białka można oszacować na podstawie tego, jak daleko migrowało ono w żelu w stosunku do markerów wielkości w drabince. Obserwacja wielkości białek wykrytych za pomocą immunoblottingu jest dobrym sposobem na sprawdzenie, czy przeciwciało rozpoznaje właściwe białko i czy jest to monomer, czy wiele kopii białka, które są obserwowane.
Istnieją tysiące dostępnych na rynku przeciwciał pierwotnych, które pozwalają na wykrycie i ilościowe określenie określonych białek w próbce. Tutaj badacz używa przeciwciała przeciwko HIF-1α do pomiaru ilości tego czynnika transkrypcyjnego reagującego na tlen w kulturach komórkowych w celu zbadania niedotlenienia. Użyli również przeciwciała przeciwko beta-aktynie, które działało jako kontrola obciążenia. Jak widać, komórki hodowane w normalnych warunkach tlenowych wytwarzały znacznie mniej HIF-1 niż te hodowane w warunkach niskiego poziomu tlenu.
Połączenie elektroforezy żelowej 2D i immunoblottingu może dostarczyć cennych informacji na temat obecności kompleksów białkowych. W tym przypadku próbki były najpierw badane według wielkości kompleksu białkowego, a następnie denaturowane, tak aby każde pojedyncze białko w kompleksie można było oddzielić według ich indywidualnej wielkości. Przeciwciała dla trzech różnych białek wykazują trzy unikalne kompleksy zawierające różną liczbę tych białek, z których każdy jest ułożony w linii pionowej. Skrajna lewa kolumna zawiera beta-2 i MCP-21, a także inne białko, którego nie wykazują te markery. Środkowa kolumna pokazuje kompleks, który zawierał wszystkie 3 białka, a prawa kolumna zawierała tylko beta-2 i MCP-21.
Immunoblotting może być również stosowany do wizualizacji interakcji białko-białko. Odbywa się to poprzez najpierw przeniesienie białek z żelu na błonę nitrocelulozową, a następnie sondowanie tej błony dodatkowymi białkami. Immunoblotting jest następnie stosowany do wykrywania, czy dodane białka są skompleksowane z którymkolwiek z białek, które zostały unieruchomione na błonie.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat immunoblottingu. Powinieneś teraz zrozumieć, jak przenosić białka do błony, sondować błonę za pomocą przeciwciał i wykrywać sygnał. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Western Blotting to potężna technika wykorzystywana przez wielu badaczy do identyfikacji obecności określonych białek w elektroforetycznej, oddzielonej próbce za pomocą przeciwciał.
Istnieją 3 główne etapy tej techniki, które są niezbędne do uzyskania wysokiej jakości wyniku: elektroblotting, immunoblotting i wykrywanie. Przed przystąpieniem do tych etapów należy przeprowadzić SDS-PAGE, w którym zdenaturowane białka są rozdzielane według wielkości w żelu poliakrylamidowym.
Elektroblotting jest również znany jako zachodni "transfer" i wymaga kasety transferowej do trzymania razem "kanapki", a także aparatu do przenoszenia białka z żelu akrylowego na cienką membranę. Kanapka do elektrobibuły składa się z żelu i specjalistycznej membrany, umieszczonej między dwoma kawałkami bibuły filtracyjnej. Podczas transferu wykorzystywane jest pole elektryczne do przemieszczania białek przez żel, gdzie zostają one uwięzione na błonie w wyniku naładowanych i hydrofobowych interakcji.
Immunoblotting wykorzystuje przeciwciała do "sondowania" błony pod kątem określonych białek. Przeciwciała to duże białka w kształcie litery Y, które zawierają dwa fragmenty, znane również jako regiony Fab, które wiążą się z innymi białkami. Region Fab określa specyficzny epitop lub określoną część białka, z którą wiąże się przeciwciało.
Przeciwciała monoklonalne to przeciwciała, które rozpoznają pojedynczy epitop i są preferowanym typem przeciwciał stosowanym w immunoblottingu ze względu na ich specyficzność. Natomiast przeciwciała poliklonalne to seria różnych przeciwciał, które celują w wiele epitopów na tym samym antygenie – lub białku, dla którego przeciwciało ma swoistość. Preferowane są przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają epitop liniowy, ponieważ zapewnia to, że epitop można znaleźć na denaturowanym lub zlinearyzowanym białku. Jest to ważne, ponieważ wiele przeciwciał rozpoznaje tylko epitopy konformacyjne, co oznacza, że rozpoznają białka tylko w ich natywnym stanie 3D.
Oprócz fragmentów Fab przeciwciała zawierają region Fc, który jest specyficzny dla zwierzęcia, które wytworzyło przeciwciało. W immunoblottingu region ten jest głównie wykorzystywany jako epitop dla przeciwciała drugorzędowego – przeciwciała, które rozpoznaje pierwsze przeciwciało, które związało się z białkiem, które próbujesz wykryć.
Aby wytworzyć obserwowalny sygnał, przeciwciała są często połączone, poprzez region Fc, z enzymem reporterowym, takim jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa. Te enzymy reporterowe wytwarzają sygnały, reagując z substratami, powodując zmiany koloru lub wywołując zmiany światła.
Zmiany te można następnie określić ilościowo za pomocą densytometrii. Densytometria to technika stosowana do pomiaru gęstości prążka białkowego za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu obliczenia gęstości każdego prążka. Pasma mogą być następnie bezpośrednio oznaczane ilościowo przy użyciu wzorców referencyjnych lub kontrolowane wewnętrznie przy użyciu próbki kontrolnej.
Aby transfer zachodni zakończył się sukcesem, żel jest najpierw równoważony w buforze transferowym przez 15 minut. Membrana powinna być również zrównoważona zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie kanapka z żelem transferowym jest starannie przygotowywana w buforze transferowym, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków w systemie. Bąbelki uwięzione w kanapce można wypchnąć, przetaczając je po nich małą pipetą. Nawet małe pęcherzyki mogą przerwać przenoszenie białek, powodując niepełny transfer, co można zobaczyć w dolnych częściach tej błony.
Po zmontowaniu do komory transferowej wlewa się dodatkowy bufor transferowy i pracuje on pod ciśnieniem 20-30 mA przez 2-3 godziny. Bufor transferowy zawiera metanol, który zwiększa wiązanie białek z błoną.
Po zakończeniu transferu kaseta jest demontowana, a jakość transferu można sprawdzić za pomocą niespecyficznego barwnika białkowego, takiego jak Ponceau S. Zapewnia to szybkie i odwracalne wykrywanie prążków białkowych.
Pierwszym etapem immunoblottingu jest pokrycie pozostałych obszarów błony rozcieńczonym roztworem białek. Ten etap nazywa się blokowaniem i jest wykonywany w celu zablokowania błony i zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciała z błoną. Zazwyczaj roztwór blokujący składa się z albuminy surowicy bydlęcej lub odtłuszczonego mleka w proszku rozpuszczonego w buforowanym roztworze soli fizjologicznej. Ten krok jest zwykle wykonywany przez 1 godzinę do nocy na shakerze.
Następnym krokiem jest inkubacja błony z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w roztworze blokującym. Ten krok może trwać od 30 minut do nocy i powinien być wykonywany z delikatnym mieszaniem.
Następnie membrana jest dokładnie płukana w celu zmniejszenia niespecyficznego barwienia tła, a przeciwciało drugorzędowe jest dodawane jako bufor blokujący do membrany. Po krótkiej inkubacji membrana jest ponownie dokładnie płukana.
Przeciwciała drugorzędowe są wykrywalne dzięki enzymom reporterowym, które są z nimi połączone. Po dodaniu odpowiedniego podłoża można zobrazować zmiany kolorymetryczne lub chemiluminescencyjne, a następnie zmierzyć je za pomocą technik densytometrycznych. Ponadto drabinka białkowa stanowi cenne odniesienie do rozmiaru, dzięki czemu liniowy rozmiar każdego białka można oszacować na podstawie tego, jak daleko migrowało ono w żelu w stosunku do markerów wielkości w drabince. Obserwacja wielkości białek wykrytych za pomocą immunoblottingu jest dobrym sposobem na sprawdzenie, czy przeciwciało rozpoznaje właściwe białko i czy jest to monomer, czy wiele kopii białka, które są obserwowane.
Istnieją tysiące dostępnych na rynku przeciwciał pierwotnych, które pozwalają na wykrycie i ilościowe określenie określonych białek w próbce. Tutaj badacz używa przeciwciała przeciwko HIF-1α do pomiaru ilości tego czynnika transkrypcyjnego reagującego na tlen w kulturach komórkowych w celu zbadania niedotlenienia. Użyli również przeciwciała przeciwko beta-aktynie, które działało jako kontrola obciążenia. Jak widać, komórki hodowane w normalnych warunkach tlenowych wytwarzały znacznie mniej HIF-1 niż te hodowane w warunkach niskiego poziomu tlenu.
Połączenie elektroforezy żelowej 2D i immunoblottingu może dostarczyć cennych informacji na temat obecności kompleksów białkowych. W tym przypadku próbki były najpierw badane według wielkości kompleksu białkowego, a następnie denaturowane, tak aby każde pojedyncze białko w kompleksie można było oddzielić według ich indywidualnej wielkości. Przeciwciała dla trzech różnych białek wykazują trzy unikalne kompleksy zawierające różną liczbę tych białek, z których każdy jest ułożony w linii pionowej. Skrajna lewa kolumna zawiera beta-2 i MCP-21, a także inne białko, którego nie wykazują te markery. Środkowa kolumna pokazuje kompleks, który zawierał wszystkie 3 białka, a prawa kolumna zawierała tylko beta-2 i MCP-21.
Immunoblotting może być również stosowany do wizualizacji interakcji białko-białko. Odbywa się to poprzez najpierw przeniesienie białek z żelu na błonę nitrocelulozową, a następnie sondowanie tej błony dodatkowymi białkami. Immunoblotting jest następnie stosowany do wykrywania, czy dodane białka są skompleksowane z którymkolwiek z białek, które zostały unieruchomione na błonie.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat immunoblottingu. Powinieneś teraz zrozumieć, jak przenosić białka do błony, sondować błonę za pomocą przeciwciał i wykrywać sygnał. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the three main stages of the Western blot technique?
The three principal stages are electroblotting, immunoblotting, and detection. Electroblotting transfers proteins from a polyacrylamide gel onto a membrane using an electric field. Immunoblotting uses antibodies to probe the membrane for specific proteins. Detection uses reporter enzymes linked to antibodies that produce measurable signals through color or light changes.
Q2: How does the electroblotting sandwich work during protein transfer?
The electroblotting sandwich consists of a gel and specialized membrane sandwiched between two filter paper pieces. An electric field moves proteins through the gel, where they become trapped on the membrane via charged and hydrophobic interactions. Bubbles must be removed during assembly, as they interrupt protein transfer and cause incomplete results on the membrane.
Q3: Why are monoclonal antibodies preferred for Western blotting?
Monoclonal antibodies recognize a single epitope, or specific protein portion, providing high specificity for detecting target proteins. Monoclonal antibodies recognizing linear epitopes are especially preferred because they bind denatured proteins. This contrasts with polyclonal antibodies, which target multiple epitopes, and conformational antibodies, which only recognize native 3D protein structures.
Q4: What is the purpose of blocking in the immunoblotting process?
Blocking covers remaining membrane areas with a dilute protein solution to reduce nonspecific antibody binding. Blocking solutions typically contain bovine serum albumin or non-fat dry milk dissolved in buffered saline. This step, performed for one hour to overnight with gentle agitation, prevents background staining and improves signal specificity.
Q5: How do reporter enzymes enable protein detection in Western blots?
Reporter enzymes like alkaline phosphatase or horseradish peroxidase are linked to antibodies through their Fc region. Upon substrate addition, these enzymes produce colorimetric or chemiluminescent signals that can be imaged. The resulting signal intensity is then measured using densitometry, which quantifies protein band density through image analysis software.
Q6: What information does the protein ladder provide in a Western blot?
The protein ladder provides size reference markers that allow researchers to estimate each detected protein's molecular weight based on migration distance in the gel. This helps verify that the antibody recognizes the correct protein and determines whether a monomer or multiple protein copies are present, confirming the specificity of antibody binding.
Q7: How can Western blotting reveal protein-protein interactions?
Proteins are transferred from a gel onto a nitrocellulose membrane, then probed with additional proteins. Immunoblotting detects whether added proteins complex with immobilized membrane proteins. This approach, combined with 2D gel electrophoresis separating protein complexes by size then individual proteins, visualizes protein interactions and identifies complex composition.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:22
Principal Stages of Immunoblotting
3:30
Electroblotting
4:41
Immunoblotting
6:30
Applications
8:26
Summary