Western Blot

Western blotting jest potężną techniką wykorzystywaną przez wielu badaczy do identyfikacji obecności specyficznych białek w próbce rozdzielonej elektroforetycznie przy użyciu przeciwciał.

Istnieją 3 główne etapy tej techniki, które są niezbędne dla uzyskania wysokiej jakości wyniku: elektrotransfer, immunoblotting oraz detekcja. Przed przystąpieniem do tych etapów należy przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE, w której zdenaturowane białka są rozdzielane według wielkości w żelu poliakrylamidowym.

Elektrotransfer, znany również jako „transfer” w metodzie Western, wymaga kasety transferowej do utrzymania struktury typu „kanapka” oraz urządzenia do przenoszenia białka z żelu akrylamidowego na cienką membranę. Kanapka do elektrotransferu składa się z żelu i specjalistycznej membrany, umieszczonych pomiędzy dwoma arkuszami papieru filtrującego. Podczas transferu wykorzystuje się pole elektryczne, aby przemieścić białka przez żel, gdzie zostają one uwięzione na membranie dzięki oddziaływaniom jonowym i hydrofobowym.

Immunoblotting wykorzystuje przeciwciała do „sondowania” membrany w poszukiwaniu specyficznych białek. Przeciwciała to duże białka w kształcie litery Y, które zawierają dwa fragmenty, znane również jako regiony Fab, które wiążą się z innymi białkami. Region Fab definiuje specyficzny epitop, czyli konkretną część białka, z którą wiąże się przeciwciało.

Przeciwciała monoklonalne to przeciwciała rozpoznające pojedynczy epitop; ze względu na swoją specyficzność są one preferowanym typem przeciwciał stosowanych w immunoblottingu. Z kolei przeciwciała poliklonalne to seria różnych przeciwciał, które celują w wiele epitopów tego samego antygenu – czyli białka, względem którego przeciwciało wykazuje specyficzność. Preferowane są przeciwciała monoklonalne rozpoznające epitop liniowy, co zapewnia możliwość znalezienia epitopu na białku zdenaturowanym lub zlinearyzowanym. Jest to istotne, ponieważ wiele przeciwciał rozpoznaje wyłącznie epitopy konformacyjne, co oznacza, że rozpoznają one białka tylko w ich natywnym stanie 3D.

Oprócz fragmentów Fab, przeciwciała zawierają region Fc, który jest specyficzny dla zwierzęcia, u którego przeciwciało zostało wytworzone. W immunoblottingu region ten jest wykorzystywany głównie jako epitop dla przeciwciała wtórnego – przeciwciała, które rozpoznaje pierwsze przeciwciało związane z białkiem, które staramy się wykryć.

W celu uzyskania obserwowalnego sygnału, przeciwciała są często łączone, poprzez swój region Fc, z enzymem reporterowym, takim jak fosfataza zasadowa lub peroksydaza chrzanowa. Enzymy reporterowe te generują sygnały poprzez reakcję z substratami, co powoduje zmianę barwy lub emisję światła.

Zmiany te można następnie poddać kwantyfikacji za pomocą densytometrii. Densytometria to technika stosowana do pomiaru gęstości prążka białkowego przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu w celu obliczenia gęstości każdego prążka. Prążki można następnie bezpośrednio skwantyfikować przy użyciu wzorców referencyjnych lub kontrolować wewnętrznie za pomocą próbki kontrolnej.

Aby zapewnić prawidłowy transfer w metodzie Western, żel jest najpierw równoważony w buforze do transferu przez 15 minut. Membrana również powinna zostać poddana równoważeniu zgodnie z instrukcją producenta.

Następnie, w buforze do transferu, starannie przygotowuje się kanapkę transferową, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza wewnątrz układu. Pęcherzyki uwięzione w kanapce można usunąć, przesuwając nad nimi małą pipetą. Nawet niewielkie pęcherzyki mogą zakłócić transfer białek, powodując jego niepełny przebieg, co widać na dolnych częściach tej membrany.

Po złożeniu układu do komory transferowej dolewany jest dodatkowy bufor do transferu, a następnie proces prowadzi się przy natężeniu 20-30 mA przez 2-3 godziny. Bufor do transferu zawiera metanol, który zwiększa wiązanie białek z membraną.

Po zakończeniu transferu kaseta jest rozbierana, a jakość transferu można sprawdzić, stosując niespecyficzne barwienie białek, np. Ponceau S. Pozwala to na szybką i odwracalną detekcję prążków białkowych.

Pierwszym krokiem immunoblottingu jest pokrycie pozostałych obszarów błony rozcieńczonym roztworem białek. Krok ten nazywa się blokowaniem i jest on wykonywany w celu zablokowania błony oraz ograniczenia niespecyficznego wiązania przeciwciał z błoną. Zazwyczaj roztwór blokujący składa się z albuminy surowicy bydlęcej lub odtłuszczonego mleka w proszku rozpuszczonego w buforze solnym. Ten etap trwa zazwyczaj od 1 godziny do całej nocy na wytrząsarce.

Kolejnym krokiem jest inkubacja błony z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym. Ten proces może trwać od 30 minut do całej nocy i powinien być przeprowadzony przy łagodnym mieszaniu.

Następnie błonę dokładnie płucze się, aby zmniejszyć niespecyficzne barwienie tła, po czym do błony dodaje się przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym. Po krótkiej inkubacji błonę ponownie dokładnie płucze się.

Przeciwciała drugorzędowe są wykrywalne dzięki przyłączonym do nich enzymom reporterowym. Po dodaniu odpowiedniego substratu można obrazować kolorymetryczne lub chemiluminescencyjne zmiany, a następnie zmierzyć je za pomocą technik densytometrii. Ponadto marker wielkości białek stanowi cenny punkt odniesienia, dzięki czemu można oszacować liniowy rozmiar każdego białka na podstawie odległości jego migracji w żelu względem markerów wielkości w drabinie. Obserwacja rozmiaru białek wykrytych za pomocą immunoblottingu jest dobrym sposobem na weryfikację, czy przeciwciało rozpoznaje właściwe białko oraz czy widoczny jest monomer, czy wielokrotne kopie białka.

Dostępne są tysiące przeciwciał pierwszorzędowych w sprzedaży, co umożliwia detekcję i kwantyfikację specyficznych białek w próbce. W tym przypadku badacz wykorzystuje przeciwciało przeciwko HIF-1α, aby zmierzyć ilość tego czynnika transkrypcyjnego reagującego na tlen w kulturach komórkowych w celu przesiewowego badania hipoksji. Zastosowano również przeciwciało przeciwko beta-aktynie jako kontrolę wsadu. Jak widać, komórki hodowane w normalnych warunkach tlenowych wytworzyły znacznie mniej HIF-1 niż te hodowane w warunkach niskiego poziomu tlenu.

Połączenie dwuwymiarowej elektroforezy żelowej i immunoblotingu może dostarczyć cennych informacji o obecności kompleksów białkowych. Tutaj próbki zostały najpierw rozdzielone według wielkości kompleksów białkowych, a następnie zdenaturowane, aby każde pojedyncze białko w kompleksie mogło zostać rozdzielone według własnej wielkości. Przeciwciała przeciwko trzem różnym białkom wykazują trzy unikalne kompleksy zawierające różną liczbę tych białek, przy czym każdy kompleks jest ułożony w linii pionowej. Kolumna najbardziej po lewej zawiera beta-2 i MCP-21, a także inne białko niewykryte przez te markery. Środkowa kolumna pokazuje kompleks zawierający wszystkie 3 białka, a kolumna prawa zawierała tylko beta-2 i MCP-21.

Immunoblotting może być również wykorzystany do wizualizacji oddziaływań białko-białko. Jest to realizowane poprzez najpierw przeniesienie białek z żelu na membranę nitrocelulozową, a następnie inkubację tej membrany z dodatkowymi białkami. Immunoblotting jest następnie stosowany, aby wykryć, czy dodane białka utworzyły kompleksy z którymkolwiek z białek unieruchomionych na membranie.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat immunoblotingu. Powinni Państwo teraz rozumieć, jak przenosić białka na membranę, poddawać membranę inkubacji z przeciwciałami oraz wykrywać sygnał. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!