Model odwarstwienia siatkówki u gryzoni przez podsiatkówkowe wstrzyknięcie hialuronianu sodu

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie eksperymentalnego odwarstwienia siatkówki o powtarzalnej i stabilnej wysokości odwarstwienia, bez występowania krwotoku podsiatkówkowego. Osiąga się to poprzez wstępne nacięcie spojówki skroniowej w okolicy tylnego krawędzi przejścia rogówkowo-twardówkowego w celu oddzielenia spojówki od twardówki. W drugim kroku używa się czubka igły 30 G do wykonania samouszczelniającego nacięcia twardówki oraz punkcji rogówki.

Następnie do przestrzeni podsiatkówkowej wstrzykuje się uronian sodu, aby oddzielić siatkówkę neurosensoryczną od znajdującego się pod nią nabłonka pigmentowego siatkówki. W ostatnim kroku na ranę twardówki nakłada się klej cyjanoakrylowy, a spojówkę przytwierdza do jej pierwotnej pozycji, co zmniejsza ryzyko wycieku uronianu sodu. Na koniec dno oka bada się za pomocą szkiełka nakrywkowe, aby potwierdzić powstanie bolusa odwarstwienia siatkówki bez krwawienia podsiatkówkowego.

Istniejące metody redukcji odklejenia siatkówki u gryzoni mogą powodować zmienność w wysokości i trwałości odklejenia, co prowadzi do pomiaru niespójnych wskaźników obumierania komórek. Dzięki zastosowaniu tej techniki możliwe jest stworzenie powtarzalnego, pęcherzykowatego i trwałego odklejenia siatkówki przy zmniejszonym ryzyku krwawień podsiatkówkowych, co pozwala na uzyskanie wiarygodnego modelu odklejenia siatkówki u gryzoni. Eksperymentalne odklejenie siatkówki u gryzoni jest stosunkowo proste do wykonania, charakteryzuje się odpowiednim przebiegiem czasowym i jest bardzo podobne do przebiegu tej choroby u ludzi.

Jest to zatem doskonały model do badania mechanizmów śmierci komórek fotoreceptorów oraz terapii zapobiegających utracie wzroku. W przypadku degeneracyjnych schorzeń siatkówki, w których dochodzi do zróżnicowanej śmierci komórek fotoreceptorów w odwarstwionej siatkówce, korzystne jest wywołanie powtarzalnego odwarstwienia bez krwawienia podsiatkówkowego. Wynika to z faktu, że wydłużony czas odwarstwienia siatkówki lub wystąpienie krwawienia podsiatkówkowego mogą wpływać na proces śmierci komórek fotoreceptorów.

Po znieczuleniu ośmiotygodniowej myszy przyciąć wibrysy zwierzęcia, a następnie pod mikroskopem chirurgicznym rozszerzyć źrenicę roztworem zawierającym 5% fenylefryny i 0,5% tropikaminy. Odciąć rzęsy zwierzęcia i zastosować miejscowe znieczulenie w postaci 0,5% roztworu okulistycznego chlorowodorku prokainy. Umieścić mysz w pozycji bocznej nosem skierowanym w stronę chirurga, a następnie naciąć spojówkę skroniową na wysokości tylnego limbusa, oddzielając spojówkę od twardówki za pomocą pęsety.

Chwyć spojówkę w okolicy limbusa, aby ustabilizować oko. Następnie, trzymając igłę o rozmiarze 30 G ściętym otworem skierowanym do góry, użyj jej czubka do wykonania tunelu przez twardówkę, penetrując ją aż do naczyniówki, tak aby nie przebić siatkówki.

Następnie, trzymając igłę 30 G równolegle do tęczówki, nakłuj rogówkę, aby obniżyć ciśnienie wewnątrzgałkowe. Teraz, kierując ściętą końcówką igły w dół, wprowadź igłę 33 G połączoną ze strzykawką Hamiltona o pojemności 10 µL do przestrzeni podsiatkówkowej i wstrzyknij 3,5 µL uronianu sodu.

Spowoduje to odwarstwienie około 50% siatkówki neurosensorycznej od leżącego pod nią nabłonka pigmentowego siatkówki. Za pomocą pęsety uciśnij rogówkę wokół miejsca nakłucia, aby umożliwić wypłynięcie cieczy wodnistej, a następnie użyj chirurgicznego aplikatora celulozowego, aby potwierdzić brak przecieku z rany twardówki, co zredukuje ryzyko wycieku urynianu sodu. Nałóż klej cyjanoakrylanowy na ranę twardówki, a następnie przytwierdź spojówkę z powrotem do jej pierwotnego położenia.

Użyj szkiełka nakrywkowego, aby sprawdzić dno oka i potwierdzić powstanie bolusa odwarstwienia siatkówki bez krwawienia podsiatkówkowego. Na koniec nałóż na oko maść z antybiotykiem, aby zmniejszyć ryzyko infekcji. Utrzymuj mysz na podkładce grzewczej, aby zapobiec hipotermii.

Następnie obserwowano wystąpienie niskiego ciśnienia krwi. Po wybudzeniu z narkozy zwierzę zwrócono do klatki. Aby ocenić trwałość odwarstwienia siatkówki wywołanego zgodnie z tym protokołem, w trzeciej, siódmej i czternastej dobie po indukcji odwarstwienia wykonano skrawki mrożone.

Dla każdego punktu czasowego wykorzystano sześć oczu. Do wizualizacji przekrojów zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną, a każdy z nich wykazał odwarstwienie siatkówki w postaci bolusa zbliżającego się do soczewki.

W żadnym z oczu nie stwierdzono oznak infekcji ani uszkodzenia soczewki. Po opanowaniu techniki zabieg ten można przeprowadzić w około pięć minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby każdy krok realizować delikatnie, aby uniknąć wycieku sodu, znacznego krwotoku podsiatkówkowego lub uszkodzenia soczewki, gdyż czynniki te mogą wpływać na śmierć komórek receptorowych w odwarstwionej siatkówce. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać eksperymentalne odwarstwienie siatkówki u gryzoni, zapewniając powtarzalną i stałą wysokość odwarstwienia bez wystąpienia krwotoku podsiatkówkowego.