Name: Test mikropłytek do oceny wpływu chemicznego na degranulację komórek tucznych RBL-2H3: wpływ triklosanu bez użycia rozpuszczalnika organicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: Poznaj metodę mikropłytek fluorescencyjnych do oceny degranulacji komórek tucznych RBL-2H3 bez użycia rozpuszczalników organicznych. Technika ta pozwala badać wpływ triklosanu na odpowiedź alergiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

L.M.W. i R.H.K są wspierane przez UMaine's Graduate School of Biomedical Science and Engineering (GSBSE); R.H.K. był również wspierany przez Maine Agricultural & Forest Experiment Station. Dodatkowe fundusze zostały zapewnione przez National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), Maine Agricultural & Forest Experiment Station (Grant Number ME08004-10, J.A.G.), University of Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) oraz Research Starter Grant in Pharmacology/Toxicology od fundacji PhRMA (J.A.G.). Dziękujemy doktorom Davidowi Holowce i Barbarze Baird za antygen i komórki. Jesteśmy wdzięczni Hinie Hashmi, Alejandro Velezowi i Andrew Abovianowi za pomoc w przygotowaniu sprzętu i zamówieniach. Jest to publikacja Rolniczej i Leśnej Stacji Doświadczalnej Maine numer 3311.

W 2004 roku Naal i wsp.W ramach projektu 1 opracowano bioczujnik komórek tucznych do wysokoprzepustowych testów degranulacji. Jest to solidny test, który dostosowaliśmy do naszych badań TCS i szczegółowo opisaliśmy w tym filmie. Przed Naal i wsp.1 test, degranulacja komórek tucznych była rutynowo oceniana za pomocą β-heksosaminidazy59-61, ale te wczesne metody wykorzystywały fluorometry, w których odczytywano jedną próbkę na raz. Co ważne, Naal i wsp. Ustalono b...

Komórki tuczne to wysoce granulowane komórki efektorowe układu odpornościowego, które służą jako kluczowe mediatory w astmie, alergiach, obronie przed pasożytami i kancerogenezie13-16. Znajdują się w prawie każdej unaczynionej tkance15, gdzie bezpiecznie przechowują mediatory alergiczne i zapalne w ziarnistościach cytoplazmatycznych, dopóki nie zostaną aktywowane do degranulacji. Degranulacja to egzocytoza granulek związanych z błoną, która powoduje uwalnianie farmakologicznie aktywnych mediatorów, takich jak histamina, tryptaza i leukotrieny15. Proces ten powoduje inicjację reakcji nadwrażliwości typu I, które mają kluczowe znaczenie w budowaniu obrony przed pasożytami, a także inicjowaniu reakcji alergicznych, astmatycznych i rakotwórczych15.
Komórki tuczne i bazofile wyrażają receptory FcεRI, receptory o wysokim powinowactwie do immunoglobuliny E (IgE)17. Narażenie na alergen lub antygen powoduje agregację wielu receptorów FcεRI związanych z IgE17 i to właśnie to tak zwane "sieciowanie" receptorów Fc związanych z IgE inicjuje proces degranulacji: kaskadę zdarzeń fosforylacji tyrozyny, aktywację fosfolipazy C, wypływ wapnia z wewnętrznych zapasów i napływ wapnia do komórki18. Ten napływ wapnia jest niezbędny do degranulacji, a ponadto sygnalizuje fuzję granulek z błoną przed wywołaniem egzocytozy ziarnistości15. Eksperymentalnie, jonofor wapnia może być używany do transportu wapnia bezpośrednio przez błonę komórkową19, która zasadniczo omija wszystkie etapy transdukcji sygnału przed etapem napływu wapnia20, co pozwala na identyfikację celu szlaku przez toksynę jako znajdującego się przed lub za sygnalizacją wapnia20.
Degranulacja może być mierzona szybko i skutecznie, monitorując uwalnianie β-heksosaminidazy do supernatantu komórkowego, który jest uwalniany liniowo z granulek wraz z histaminą6, ale jest znacznie łatwiejszy do wykrycia za pomocą prostej reakcji enzyma-substrat i czytnika mikropłytek do oznaczania produktu fluorescencyjnego. Ten test mikropłytek, jak szczegółowo opisano w sekcji protokołu, opiera się na solidnej metodzie pierwotnie opracowanej przez Naal i wsp.1, który określa ilościowo rozszczepienie substratu fluorogenicznego 4-metylolumbelliferyl-N-acetylo-β-D-glukozaminidu przez β-heksozaminidazę. Zmodyfikowaliśmy test, aby przetestować działanie leków i substancji toksycznych, z zaznaczonym tutaj triklosanem. Metoda ta niezawodnie określa ilościowo degranulację, stanowi niedrogą alternatywę dla np. metod wykrywania opartych na cytometrii przepływowej21 i może doskonale nadawać się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych szerokiej gamy leków przeciwalergicznych, a także immunotoksycznych lub alergizujących substancji chemicznych. Ten ostatni punkt jest szczególnie ważny w świetle raportu National Research Council z 2007 r. "Testy toksyczności w XXI wieku: wizja i strategia" (<a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a>), który opowiada się za opracowaniem wysokoprzepustowych testów toksykologicznych wykorzystujących hodowlę komórkową w celu zmniejszenia kosztownego wykorzystania tradycyjnych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy. Protokół degranulacji opracowany przez Naal i wsp.1 i zmodyfikowany przez nas2, wykorzystuje linię komórkową RBL-2H3, która jest dobrze akceptowanym modelem homologicznym do ludzkich komórek tucznych błony śluzowej lub bazofili3-5. (Metody hodowli komórek RBL-2H3 są szczegółowo opisane w Hutchinson et al.22). Ten test można prawdopodobnie dostosować do dowolnego typu przyczepionych komórek tucznych.
Triklosan (TCS) to środek przeciwdrobnoustrojowy o szerokim spektrum działania, który jest stosowany od ponad 30 lat w szpitalach, produktach higieny osobistej i dobrach konsumpcyjnych23,24. Sposobem działania przeciwdrobnoustrojowej charakterystyki TCS jest hamowanie biosyntezy kwasów tłuszczowych, prawdopodobnie poprzez hamowanie reduktazy białka nośnikowego enoilo-acylowego25,26. Można go znaleźć na całym świecie w szerokiej gamie produktów konsumenckich, takich jak żel pod prysznic, balsam do rąk, pasta do zębów, płyn do płukania jamy ustnej oraz w mydłach do rąk w stężeniach do 0,3% lub 10 mM24. Powszechne stosowanie TCS spowodowało wykrywalność TCS u ludzi wwieku 27-29 lat oraz w rzekach i strumieniach30. Badanie przeprowadzone przez Allmyr i wsp.27 wykazało, że TCS i jego metabolity są obecne zarówno w osoczu, jak i w mleku matek karmiących. Co ważne, TCS łatwo wchłania się w skórę31-37. Queckenberg i wsp.37 stwierdzono ~10% wchłanianie kremu TCS ~70 mM do ludzkiej skóry w ciągu 12 godzin, co spowodowało znaczne stężenie w skórze, gdzie znajdują się komórki tuczne.
TCS wykazano klinicznie, że radzi sobie z alergiczną chorobą skóryu ludzi 7-11, ale mechanizm, dzięki któremu TCS łagodzi alergiczne choroby skóry, jest nieznany38. Korzystając z testu mikropłytek fluorescencyjnych szczegółowo opisanego w tym filmie, wykazaliśmy niedawno, że TCS, w stężeniach tak niskich jak 2 μM, znacznie tłumi funkcję komórek tucznych i degranulację, co stanowi potencjalne wyjaśnienie tych danych klinicznych2. Oprócz wyjaśnienia tych danych klinicznych, nasze odkrycia w Palmer i wsp.2 sugerują, że TCS celuje w cząsteczki sygnałowe znajdujące się za napływem wapnia. Ze względu na znaczenie sygnalizacji wapniowej w wielu procesach immunologicznych i innych procesach biologicznych, TCS może potencjalnie mieć niekorzystny wpływ na wiele różnych niezbędnych procesów biologicznych. W rzeczywistości Udoji i wsp.39 wykazało, że TCS hamuje aktywność lityczną ludzkich komórek NK (ang. natural killer cell human natural killer cell), która jest kolejną ważną wrodzoną funkcją immunologiczną.
Poza swoim potencjałem jako pomoc terapeutyczna w alergicznej chorobie skóry (lub, odwrotnie, jako immunotoksyczny), TCS może być również substancją zaburzającą gospodarkę hormonalną40-49. W związku z tym jasna procedura przygotowania tej substancji chemicznej w roztworze jest interesująca dla toksykologów. Ponieważ TCS jest małą cząsteczką hydrofobową, często stosuje się nośniki organiczne, aby uczynić go bardziej rozpuszczalnym w wodzie. W większości badań toksyczności, w których testowano TCS, przygotowanie obejmowało rozpuszczenie w wodzie za pomocą rozpuszczalnika organicznego, takiego jak etanol, aceton lub olej2,50,51. Często jednak rozpuszczalniki te same w sobie są biologicznie czynne, co komplikuje interpretację danych dotyczących badanej substancji chemicznej51. W rzeczywistości, według Rufli i wsp.52 i in.53 zaleca się, aby roztwory testowe do eksperymentów toksyczności dla organizmów wodnych były przygotowywane przy użyciu metod fizycznych, a nie metod chemicznych, ze względu na potencjał rozpuszczalników chemicznych do tworzenia artefaktów toksyczności. Wcześniej wykazaliśmy, że TCS rozpuszczony w 0,24% etanolu/wody (vol/vol) i sonikowany przez 30 minut tłumi degranulację komórek tucznych RBL2. Wykazano, że etanol w stężeniach wyższych niż 0,24% tłumi degranulację komórek tucznych54,55 – przykłady potencjalnie mylącego wpływu rozpuszczalników organicznych na badania toksyczności.
Nie tylko ważne jest rozważenie wpływu rozpuszczalników na organizm lub komórki użyte do badań, ale także ważne jest monitorowanie wpływu rozpuszczalnika na samą badaną substancję chemiczną. Na przykład Skaare i wsp.51 wykazało, że rozpuszczenie TCS w glikolu polietylenowym (powszechnie występującym w pastach do zębów i płynach do płukania jamy ustnej) osłabiło działanie przeciwbakteryjne i przeciw płytce nazębnej u zdrowych kobiet, podczas gdy rozpuszczenie w olejach spowodowało całkowitą utratę funkcji. W związku z tym przy projektowaniu testu należy wziąć pod uwagę zdolność różnych rozpuszczalników do modulowania skutków działania substancji toksycznych i leków, w tym TCS. Stosowanie olejów lub dodatków smakowych może zakłócać działanie TCS w różnych produktach50,51.
Aby wyeliminować potrzebę używania rozpuszczalników organicznych, ulepszyliśmy naszą metodę rozpuszczania TCS2, eliminując użycie rozpuszczalnika organicznego. W niniejszym protokole rozpuszczamy granulki TCS bezpośrednio w buforze wodnym za pomocą ciepła (≤50 °C), a następnie weryfikujemy stężenie tego wsadu TCS za pomocą spektrofotometrii UV-Vis. Ulepszenia te są możliwe, ponieważ TCS jest rozpuszczalny w wodzie do 40 μM (<a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a>) i wykazano, że jest odporny na degradację po podgrzaniu do 50 °C (<a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a>)56,57. Dodatkową zaletą spektrofotometrii UV-Vis jest to, że TCS jest również znany z silnej absorpcji przy 280 nm58 ze współczynnikiem ekstynkcji molowej 4200 L/mol/cm12.
Ten protokół zapewnia prosty, ale skuteczny sposób rozpuszczania granulek TCS w buforze bez pomocy rozpuszczalnika organicznego, w tym tanią i szybką weryfikację stężenia, oraz opisuje potężny test mikropłytek fluorescencyjnych do monitorowania wpływu chemicznego na degranulację komórek tucznych.

<table><tbody><tr><td> RBL-2H3 Cells </td><td>ATCC</td><<td>p align="center">CRL-2256</td><td> Komórki, których użyliśmy, były prezentem, ale są również dostępne w ATCC </td></tr><tr><td> Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> Powinien być przechowywany w środowisku o niskiej wilgotności </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Surowica bydlęca </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> Siarczan gentamycyny </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> Albumina, surowica bydlęca </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% roztwór) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T Baker</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> Chlorek magnezu </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glukoze </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> Kryształ chlorku potasu </td><td>J.T Baker</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> Dihyrdate chlorku wapnia </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> Glycine </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-&beta;-D-glukozaminid (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4</td><td> Zawiń w folię &ndash; jest światłoczuły </td></tr><tr><td> Anty-DNP Mouse IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> Odczynnik ma stężenie 1 mg/ml. Porcja 25 &mikro; l&nbsp; odczynnika do oddzielnych probówek do mikrowirówek i parafilmu. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C, które nie są używane, i przechowują używaną podwielokrotność w temperaturze 2-8 &; C nie dłużej niż 1 miesiąc. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>Prezent od dr Davida Holowki i dr Barbary Baird, Cornell University<</td><td>p align="center"></td><td> Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# <a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </td></tr><tr><td> Calcium Ionophore A23187 </td><td>Sigma</td><td>C75-22-1mg</td><td> Jonofor został wykonany z proszku przez dodanie 400 &mikro; l&nbsp; świeżego 100% DMSO do fiolki jonoforowej i jest utrzymywany w temperaturze -20 &deg; C Uwaga: użyliśmy jonoforu po upływie 3 miesięcy jego daty ważności </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> Kwas octowy </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> Bezwodny węglan sodu </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> Chlorek sodu </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> Kwas solny </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> Reference Buffer, pH 7 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> Bufor referencyjny, pH 10 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Bufor referencyjny, pH 4 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> Elektroda pH rozwiązanie do przechowywania </td><td>VWR</td><<td>p align="center">14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment:</td></tr><tr><td> Spektrofotometr DU 7500 </td><td>Beckmann</td><td>Już nie sprzedawane</td><td> </td></tr><tr><td> Czytnik płytek Synergy 2 Korzysta z oprogramowania do zbierania i analizy danych mikropłytek Gen5 </td><td>BioTek</td><td>Module S</td><td> </td></tr><tr><td> Hematocytometr </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</td><td> </td></tr><tr><td> 7 x&nbsp; 7 CER HOT/STIR 120 V Kombinacja płyty grzejnej/magnetycznej płyty mieszającej </td><td>VWR</td><<td>p align="center">97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Wirówka </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> Kąpiel wodna do hodowli tkankowych </td><td>VWR</td><<td>p align="center">Model# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> Gabinet bezpieczeństwa biologicznego hodowli tkankowej SafeGARD (TC hood) </td><td>The Baker Company</td><td>Model# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> Inkubator kultur tkankowych </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><<td>p align="center"></td><td> Zakres: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> miernik pH </td><td>Symphony/VWR</td><<td>p align="center">Model# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td> </td></tr><tr><td> Dozownik końcówek Combitip </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Recipes:</td></tr><tr><td> Bufor octanowy, pH 4,4 </td><td>Przygotować 0,12 M kwasu octowego i miareczkować do pH 4,4 za pomocą 10 N NaOH. Jest to 5,3 ml lodowatego kwasu octowego w 1 l wody MilliQ: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml, ponieważ gęstość lodowca wynosi 1,37 g/ml</td><td>Sterylny filtr do autoklawowanej szklanej butelki</td><td></td></tr><tr><td> Substrate (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Przechowywać w temperaturze -20&deg; C Zapas: 0,12 M w DMSO (46 mg w 1 ml DMSO), rozgrzany do 37 & deg; C, wir, sonikacja 10 minut w kąpieli wodnej z ciepłą wodą, ponownie wirować</td><td>Dla każdego eksperymentu przygotuj świeży roztwór substratu w buforze octanowym (100x rozcieńczenie), dla końcowego stężenia 1,2 mM w buforze octanowym </td><td></td></tr><tr><td> Bufor węglanowy glicyny, pH 10 </td><td>26,7 g glicyny 47,1 g bezwodnego węglanu sodu Dodaj wodę dejonizowaną na 1 l, i dostosuj pH do 10</td><td>Sterylny filtr do autoklawowanej szklanej butelki</td><td></td></tr><tr><td> Tyrodes (2 L), pH 7,4 </td><td>135 mM NaCl: 15,78 g (lub 270 ml 1 M) 5 mM KCl: 10 ml 1 M zapasu 1,8 mM CaCl2: 7,20 ml 0,5 M zapasu 1 mM MgCl2: 4,00 ml 0,5 M bulionu 5,6 mM glukozy: 2,02 g (11,2 ml 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml 1 M bulionu Stosowanie stężonego pH HCl od ~9,7-7,4</td><td>Sterylny filtr do autoklawowanej szklanej butelki</td><td></td></tr><tr><td> Pożywka komórkowa RBL </td><td>Rozmrozić płodową surowicę bydlęcą (FBS, przechowywaną w temperaturze -20 & C) przez około 4 godziny w 37 stopniach; C Łaźnia wodna Postępuj zgodnie ze standardową techniką sterylną Wyjmij 1 l minimum niezbędnego podłoża (MEM) z L-glutaminą (z Earle' s sole) Odlej trochę MEM, aby uzyskać 800 ml MEM, dodaj 200 ml ciepłego FBS Dodaj 1 ml antybiotyku siarczanowego gentamycyny do 1 l pożywki za pomocą sterylnej pipety Używaj wyłącznie butelek z pożywkami, które zostały autoklawowane i oznaczone wyłącznie do użytku w hodowlach komórkowych.</td><td>Sterylny filtr (0,2 mm) do autoklawowanej szklanej butelki</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Użyty materiał z tworzywa sztucznego:</strong</td></tr><tr><td>> 200 &micro; l&nbsp; Jednorazowe sterylne końcówki do pipet z podziałką w stojaku 96 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">53509-009</td><td> polipropylen </td></tr><tr><td> 1,000 &micro; l&nbsp; Sterylne końcówki do pipet aerozolowych z HighRecovery </td><td>VWR</td><<td>p align="center">89003-420</td><td> polietylen </td></tr><tr><td> 10 &micro; l&nbsp; mikrokońcówka o niskim stopniu wiązania sterylna </td><td>VWR</td><<td>p align="center">14217-704</td><td> polipropylen </td></tr><tr><td> Jednorazowe/stożkowe probówki do mikrowirówek o dużym przeciążeniu </td><td>VWR</td><<td>p align="center">20170-038</td><td> polipropylen </td></tr><tr><td> Jednorazowe/z podziałką/stożkowe/sterylne 50 ml&nbsp; Probówki wirówkowe z nakrętkami </td><td>VWR</td><<td>p align="center">21008-178</td><td> polipropylen </td></tr><tr><td> Jednorazowe/z podziałką/stożkowe/sterylne 15 ml&nbsp; Probówki wirówkowe z nakrętkami </td><td>VWR</td><<td>p align="center">21008-103</td><td> polipropylen </td></tr><tr><td> Kolba T-25 do hodowli tkankowych CELLSTAR z nasadką filtra </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> Kolba T-75 poddawana hodowli tkankowej CELLSTAR z nasadką filtra </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp; Pipeta serologiczna owinięta papierem/tworzywem sztucznym </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp; Pipeta serologiczna owinięta papierem/tworzywem sztucznym </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp; Pipeta serologiczna owinięta papierem/tworzywem sztucznym </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp; Pipeta serologiczna owinięta papierem / plastikiem </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> Kuwety 1 cm </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated,, z pokrywką Płytka 96-dołkowa </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> polistyren </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501</td><td> Polipropylen/ polietylen </td></tr></tbody></table>

test mikropłytek do oceny wpływu chemicznego na degranulację komórek tucznych rbl-2h3: wpływ triklosanu bez użycia rozpuszczalnika organicznego

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Komórki tuczne odgrywają ważną rolę w chorobach alergicznych i obronie immunologicznej przed pasożytami. Po aktywacji (np. przez alergen) ulegają degranulacji, w wyniku czego dochodzi do egzocytozy mediatorów alergicznych. Modulacja degranulacji komórek tucznych przez leki i substancje toksyczne może mieć pozytywny lub niekorzystny wpływ na zdrowie człowieka. Funkcja komórek tucznych została szczegółowo przeanalizowana przy użyciu komórek tucznych białaczki bazofilnej szczura (RBL-2H3), powszechnie akceptowanego modelu komórek tucznych ludzkiej błony śluzowej3-5. Składnik granulki komórek tucznych i alergiczny mediator β-heksozaminidaza, który jest uwalniany liniowo w połączeniu z histaminą z komórek tucznych6, można łatwo i niezawodnie zmierzyć poprzez reakcję z substratem fluorogennym, uzyskując mierzalną intensywność fluorescencji w teście mikropłytki, który jest podatny na badania wysokoprzepustowe1. Pierwotnie opublikowane przez Naal et al.1, dostosowaliśmy ten test degranulacji do badań przesiewowych leków i substancji toksycznych i demonstrujemy jego zastosowanie tutaj.
Triklosan to środek przeciwbakteryjny o szerokim spektrum działania, który jest obecny w wielu produktach konsumenckich i został uznany za pomoc terapeutyczną w ludzkiej alergicznej chorobie skóry7-11, chociaż mechanizm tego efektu jest nieznany. Tutaj pokazujemy test wpływu triklosanu na degranulację komórek tucznych. Niedawno wykazaliśmy, że triklosan silnie wpływa na funkcję komórek tucznych2. Aby uniknąć użycia rozpuszczalnika organicznego, triklosan rozpuszcza się bezpośrednio w buforze wodnym za pomocą ciepła i mieszania, a uzyskane stężenie potwierdza się za pomocą spektrofotometrii UV-Vis (przy użyciu ε280 = 4 200 L/M/cm)12. Protokół ten może być potencjalnie stosowany z różnymi substancjami chemicznymi w celu określenia ich wpływu na degranulację komórek tucznych, a szerzej, ich potencjału alergicznego.

Po podgrzaniu do temperatury 50 °C przez 90 minut, widmo absorbancji UV-Vis dla TCS tworzy silną, gładką krzywą między ~260 a 300 nm, ze szczytem przy 280 nm, jak pokazano na rysunku 1. Spektrofotometria UV-Vis jest zatem ważnym narzędziem, które można wykorzystać do obliczenia stężenia, ponieważ opublikowany molowy współczynnik absorpcji przy 280 nm wynosi 4200 l/mol/cm12. Stwierdziliśmy, że TCS nie wypada z roztworu w czasie całego eksperymentu degranulacji, po podgrzaniu w temperaturze 50 °C (dane nie pokazane)...

Degranulacja komórek tucznych, uwalnianie alergicznych mediatorów, jest ważna w obronie przed alergią, astmą i pasożytami. Tutaj pokazujemy techniki1 do oceny wpływu leków i substancji toksycznych na degranulację, metodologię ostatnio wykorzystaną do wykazania silnego hamującego działania środka przeciwbakteryjnego triklosanu2.

Test mikropłytek do oceny wpływu chemicznego na degranulację komórek tucznych RBL-2H3: wpływ triklosanu bez użycia rozpuszczalnika organicznego

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie testu mikropłytki fluorescencyjnej do oceny wpływu chemicznego na degranulację komórek tucznych. W tym protokole wykazano hamujące działanie środka przeciwdrobnoustrojowego triklosanu bez użycia rozpuszczalnika organicznego. Osiąga się to poprzez uprzednie posiew komórek tucznych na 96-dołkowej płytce, aby umożliwić im przyczepienie się przez noc, a następnie przygotowanie triklosanu w roztworze wodnym bez użycia rozpuszczalników organicznych poprzez ogrzewanie.Stężenie roztworu trianu jest następnie szybko oznaczane za pomocą spektroskopii ultrafioletowej w świetle widzialnym. W drugim etapie komórki są stymulowane antygenem IgE lub jonoforem wapniowym w obecności lub bez trianu, co spowoduje uwolnienie markera degranulacji komórek tucznych beta heksozaminidazy do supernatantu. Uwalnianie beta heksozaminidazy do supernatantu komórki określa się ilościowo za pomocą substratu beta heksozaminidazy, którego produkt fluorescencyjny jest oznaczany ilościowo w czytniku mikropłytek.W celu zmierzenia wpływu triklosanu lub innych badanych substancji chemicznych na wyniki degranulacji komórek tucznych uzyskuje się wyniki. To pokazuje, ż

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test płytki mikrotytrajowej do oceny wpływu związków chemicznych na degranulację komórek tucznych RBL-2H3: Wpływ triklosanu bez stosowania rozpuszczalnika organicznego

W tym filmie opisujemy metodę in vitro do oceny potencjału alergicznego antygenu do wywołania degranulacji bazofilów. β-heksosaminidaza jest używana jako wskaźnik uwalniania chemicznego mediatora, a aktywność enzymatyczna β-heksosaminidazy jest mierzona za pomocą substratu fluorogenicznego.

Humanizowany test uwalniania enzymu mediatorowego: immunochemiczna metoda badania potencjału alergicznego antygenu testowego poprzez monitorowanie odpowiedzi degranulacji bazofili in vitro

Ten film demonstruje test kolorymetryczny do określenia aktywności degranulacyjnej komórek tucznych. Enzym uwalniany przez komórki tuczne hydrolizuje substrat i wytwarza kolorowy produkt. Aktywność degranulacyjną komórek tucznych mierzono jako procentowe uwalnianie enzymów na zewnątrz komórki znormalizowane całkowitą zawartością enzymów w komórce.

Test degranulacji komórek tucznych w celu zbadania wpływu docelowej substancji chemicznej

Ten film ilustruje test komórkowy z udziałem komórek glejaka wyrażających receptory chemokiny CXCR4. Test wykorzystuje barwnik wrażliwy na wapń do pomiaru zmian fluorescencji po interakcji z czynnikiem, oferując wgląd w dynamikę sygnalizacji komórkowej.

Test komórkowy do identyfikacji czynników oddziałujących z CXCR4

Ten film demonstruje test do monitorowania aktywacji neutrofili i egzocytozy granulek za pomocą testu degranulacji. Po aktywacji przez związki prozapalne, ziarnistości cytoplazmatyczne w neutrofilach zawierających żelatynazę łączą się z błoną komórkową, uwalniając swój ładunek. Obecność żelatynazy w supernatancie ocenia się poprzez hydrolizę substratu żelatyny sprzężonego z fluoroforem, potwierdzając aktywację i degranulację neutrofili.

Test degranulacji w celu monitorowania aktywacji neutrofili i uwalniania żelatynazy

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek tucznych otrzewnej. Opisujemy również dwa protokoły ich funkcjonalnej charakterystyki: obrazowanie fluorescencyjne wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego Ca2 + oraz test degranulacji oparty na kolorymetrycznej ocenie ilościowej uwolnionej β-heksozaminidazy.

Izolacja komórek tucznych pochodzących z otrzewnej i ich charakterystyka funkcjonalna za pomocą Ca2+-obrazowania i testów degranulacji

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół testu chemotaksji. Celem tego protokołu jest zmniejszenie liczby etapów i kosztów tradycyjnych metod chemotaksji bakteryjnej oraz służenie jako cenne źródło informacji o interakcjach między roślinami a mikroorganizmami.

Ulepszony test chemotaksji do szybkiej identyfikacji chemoatraktantów ryzo bakteryjnych w wysiękach korzeniowych

Poznaj metodę mikropłytek fluorescencyjnych do oceny degranulacji komórek tucznych RBL-2H3 bez użycia rozpuszczalników organicznych. Technika ta pozwala badać wpływ triklosanu na odpowiedź alergiczną.

Test mikropłytek do oceny wpływu chemicznego na degranulację komórek tucznych RBL-2H3: wpływ triklosanu bez użycia rozpuszczalnika organicznego (Wideo) | JoVE Journal

Test mikropłytek do oceny wpływu chemicznego na degranulację komórek tucznych RBL-2H3: wpływ triklosanu bez użycia rozpuszczalnika organicznego

Przeglądaj więcej filmów