Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

Ogólnym celem tej procedury jest odkrycie centralnej sieci przedruchowej rozproszonych komórek, które uderzają w określony cel obwodowy, a następnie potwierdzenie specyficznych połączeń między tymi komórkami w mózgu. Osiąga się to poprzez pierwsze wsteczne zakażenie obwodów przedruchowych transsynaptycznym wektorem wirusowym, który jest dostarczany obwodowo przez mięsień. Drugim etapem zabiegu jest wizualizacja zakażonych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Trzecim krokiem jest potwierdzenie określonych połączeń w mózgu poprzez wstrzyknięcie znaczników monosynaptycznych skierowanych do wcześniej zidentyfikowanych węzłów w obwodzie przedmotorycznym. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, w jaki sposób komórki w rozproszonej sieci przedruchowej są ze sobą połączone poprzez połączenie transsynaptycznego śledzenia wirusów i tradycyjnych monosynaptycznych technik neuroanatomicznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne monosynaptyczne śledzenie neurologiczne, jest to, że węzły rozproszonej sieci neurologicznej można zidentyfikować, a określone połączenia między komórkami w tej sieci można rozwiązać na znieczulonej myszy.

Przygotuj miejsce operacji, przycinając włosy i dezynfekując skórę co najmniej trzema naprzemiennymi peelingami Betadine i 70% alkoholu. Teraz wykonaj nacięcie skóry w okolicy gardła i odsłoń interesujący Cię mięsień. Na przykład, aby uzyskać dostęp do mięśnia krtaniowego tarczycy, należy najpierw usunąć leżącą nad nim część mięśnia gnykowego mostka, uszczelniając wszelkie mięśnie przecięte za pomocą kleju tkankowego vet bond.

Następnie załaduj system mikrostrzykawek o pojemności 10 mikrolitrów nano świeżo rozmrożonym roztworem PR RV. Powoli oczyść martwe miejsce i sprawdź, czy roztwór opuszcza końcówkę mikrostrzykawki. Wyrzuć płyn jako odpad niebezpieczny biologicznie i ostrożnie zamontuj go na urządzeniu stereotaktycznym.

Za pomocą urządzenia do mikropozycjonowania ostrożnie umieść końcówkę igły w interesującym Cię mięśniu. Następnie powoli wypełniaj mięsień, aż pojawi się lekki obrzęk. Teraz przenieś strzykawkę do następnego interesującego mięśnia, w tym przypadku bocznego cricoarytenoid i powtórz.

Procedura iniekcji polega tylko na nakłuciu każdego mięśnia. Raz szybkość wstrzykiwania będzie się różnić w zależności od wielkości mięśnia i objętości, która ma być wstrzyknięta. Na przykład pięć zastrzyków po 200 nanolitrów w tempie czterech nanolitrów na sekundę powinno być wykonanych w odstępie jednej minuty w tym samym miejscu, aby wypełnić mięsień tarczycy.

Po wyjęciu mikrostrzykawki uszczelnij przerwę w powięzi za pomocą kleju tkankowego vet bond. Po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć zamknij ranę za pomocą kleju tkankowego vet bond. Monitoruj zwierzę, aż pokaże, że mostek jest leżący.

Następnie zapewnij znieczulenie, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wymaganiami zwierzęcia w placówce. Korzystaj z wytycznych. Procedura analizy ekspresji EGFP i neuronów zakażonych PRV jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym.

Przetwarzanie tkanek jest bardzo podobne do tego, które zostało omówione w dalszej części tego filmu. Zacznij od znieczulenia dorosłej myszy, chroniąc jej oczy i ustalając pozycję jej głowy. Następnie przygotuj miejsce operacji zgodnie z wcześniejszymi opisami, stosując naprzemiennie peelingi z betadyny i 70% alkoholu.

Teraz wykonaj nacięcie skóry głowy i cofnij skórę głowy nad mózgiem. Obszar zainteresowania. Wykonaj małą kraniotomię z wiertłem w odpowiednich współrzędnych stereotaktycznych.

Na przykład współrzędne kory ruchowej połączonej z krtanią zidentyfikowanej przez śledzenie PRV u dorosłej myszy wynoszą 1,2 milimetra w bok i 0,2 milimetra w kierunku rostralnym od bgma. Następnie przygotuj 7,5% roztwór biotynylowanych amin dekstranu w sterylnej wodzie. Następnie załaduj do systemu nano jet dwie mikropipety wystarczającą ilość roztworu BDA do planowanych wstrzyknięć.

Powoli oczyść martwe miejsce i sprawdź, czy roztwór wydostaje się z końcówki mikropipety. Korzystając z urządzenia do mikropozycjonowania, ostrożnie opuść końcówkę mikropipety do obszaru mózgu zainteresowania i powoli wstrzyknij roztwór BDA. Dostosuj szybkość w zależności od rozmiaru obszaru, który ma być oznaczony etykietą.

Na przykład 12 zastrzyków po 4,6 nanolitra powinno być wykonanych w czterech różnych miejscach w odstępach 0,2 milimetra. Stro coddle do pokrycia kory ruchowej połączonej krtani u dorosłej myszy.

Ostateczna objętość wstrzyknięcia powinna być dostosowana do wielkości obszaru zainteresowania. Mając na uwadze, że etykieta może dyfundować z rdzenia iniekcji przez tkankę mózgową i wzdłuż procesów znakowanych neuronów. Oczyść i zwilż kraniotomię sterylną solą fizjologiczną i zamknij ranę skóry głowy za pomocą kleju tkankowego vet bond.

Monitoruj zwierzę, aż pokaże, że mostek jest leżący. Następnie zapewnij znieczulenie, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wymaganiami zwierzęcia w placówce. Korzystaj z wytycznych.

Sześć dni później podjednostka B toksyny może zostać wstrzyknięta do mięśni zwierzęcia. Następnie w ciągu trzech dni zwierzę powinno zostać uśmiercone do analizy. Wytnij skrawki o grubości 40 mikronów na kriostacie i zachowaj pływające sekcje w 0,1 molowym PBS, zaspokój skrawki 0,3% nadtlenkiem wodoru w PBS przez 30 minut, wstrząsając i chroniąc przed światłem.

Umyj sekcje trzy razy w PBS przez pięć minut na pranie. Następnie reaguj je przez godzinę w świeżo przygotowanym roztworze A, b, C w temperaturze pokojowej. Teraz umyj sekcje trzy razy w buforze fosforanowym przez 10 minut na pranie.

Następnie rozwijać skrawki przez osiem minut, mieszając w buforze fosforanowym o pH 7,4 zawierającym nadtlenek wodoru DAB i chlorek niklu. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być.

Następnie zablokuj sekcje, wstrząsając przez 30 minut w PBS zawierającym 0,3% tween 20 z normalną surowicą króliczą z zestawu vector stain elite. Następnie inkubować zablokowane sekcje w kozie anty CTB, potrząsając przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj sekcje jeszcze trzy razy w PBS przez pięć minut na pranie.

Zastosować przeciwciało wtórne antygo królika z zestawu VE i inkubować sekcje, wstrząsając przez godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez pięć minut na pranie, a następnie reagować przez 30 minut w świeżo przygotowanym roztworze A, b, C w temperaturze pokojowej. Przemyć sekcje trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i inkubować sekcje przez osiem minut.

W roztworze rozwojowym produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być brązowy. Teraz zamontuj sekcje na super frostach plus szkiełka na szkiełkach, odwodnij tkankę za pomocą serii stopniowanych alkoholi, a następnie wykonaj dwa płukania oczyszczające w ksylenie. Następnie nakryj szkiełka z paramountem i przystąp do obrazowania.

Barwienie pod kątem EGFP powinno rozpocząć się wykazując słaby sygnał w pierwotnych neuronach ruchowych 72 godziny po wstrzyknięciu P RV 1, 52, a barwienie stanie się silne po 90 godzinach. To jądro niejednoznaczne, w którym znajdują się neurony ruchowe krtani, jest widoczne 94 godziny po wstrzyknięciu P RV 1 52 do dwóch z siedmiu mięśni krtani. Ponieważ wirus dostał się do mózgu przez neurony, które unerwiają zainfekowane mięśnie.

Inne pule neuronów ruchowych, takie jak jądro podjęzykowe, nie wykazują ekspresji EGFP po 90 godzinach. EGFP można zobaczyć w komórkach drugiego rzędu. Te neurony pnia mózgu zostały zabarwione po pierwotnej infekcji w jądrze niejednoznacznym.

Wstrzyknięcie było jednostronne, a powstały wzór etykiety w pniu mózgu wskazuje na zakażenie jądra ipsilateralnego. Niejednoznaczne i pojedyncze jądro siatkowate międzyneurony również zostały zainfekowane i silnie zabarwiają się na EGFP. Te neurony łączą różne struktury, w tym pule neuronów ruchowych i jądro przeciwne. Dwuznaczny.

Jednak ich cele eferentne pozostają nieoznakowane, ponieważ wirus rozprzestrzenia się tylko w kierunku wstecznym. Czas przeżycia z PRV jest ograniczony, ale może wykazywać barwienie EGFP w komórkach trzeciego i wyższego rzędu zakażonych neuronami przedruchowymi w korze ruchowej, które wyrażają EGFP przeciwlegle do obwodowego miejsca wstrzyknięcia. Przypuszczalnie zakażona była tylko populacja komórek, które składały się na reprezentację kory ruchowej mięśni krtani.

Aksony znakowane BDA na poziomie jądra niejednoznacznego oznaczone grotami strzałek, nawiązują kontakt z CTB dodatnimi neuronami ruchowymi wstecznie znakowanymi przez wstrzyknięcia w mięśnie krtani widoczne na brązowo, aksony tworzą żylaki i przypuszczalne końcowe batony w pobliżu dendrytów neuronów ruchowych krtani i w pobliżu somy neuronów ruchowych krtani. Konieczne są dalsze eksperymenty z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej lub elektrofizjologii, aby ustalić, czy te żylaki reprezentują synaptyczne. Obustronne wstrzyknięcie BDA umieszczone w korze ruchowej połączonej krtani jest widoczne na czarno, ponieważ BDA nie jest kierunkowo specyficzne, zarówno połączenia aferentne, jak i odprowadzające mogą być oznaczone.

Na przykład we wzgórzu widoczne jest zarówno pole projekcyjne o etykiecie następczej, jak i ciała komórkowe oznaczone wstecznie. Komórki wzgórza są identyfikowane za pomocą grotu strzałki, a wewnętrzna kapsułka jest oznaczona w celu orientacji. Nie zapominaj, że praca z wirusem pseudo wścieklizny i DAB może być bardzo niebezpieczna i środki ostrożności, takie jak sterylizacja.

Wszystkie materiały, które miały kontakt z PRV lub DAB przy użyciu 10% roztworu wybielacza. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podjąć odpowiednią utylizację niebezpiecznych biologicznie odpadów stałych i płynnych zgodnie z przepisami Twojej instytucji.