Name: Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Poznaj metodę śledzenia transsynaptycznego wirusem pseudowścieklizny do mapowania obwodów nerwowych i potwierdzania połączeń neuronowych w mózgu myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Toshio Terashima z Uniwersytetu Kobe w Japonii za nauczanie techniki chirurgii krtani oraz dr Lynn Enquist z Uniwersytetu Princeton za dostarczenie PRV-Bartha. Badania były wspierane przez nagrodę NIH Pioneer Award DP1 OD000448 dla Ericha D. Jarvisa oraz nagrodę NSF Graduate Research Fellowship dla Gustavo Arriaga. Ryciny z odpowiednio opatrzonych autorami wcześniejszych prac są wykorzystywane na licencji Creative Commons (CC-BY) w otwartym dostępie PLoS ONE zgodnie z polityką redakcyjną czasopisma.

UWAGA: Wszystkie procedury dla zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Duke'a.
1. Przechowywanie wirusa pseudowścieklizny
<ol>
	<li>Otrzymujemy żywego wirusa (PRV152) z laboratorium dr Lynn Enquist na Uniwersytecie Princeton w mianie 1 x 109 pfu/m. Opublikowano protokół generowania wirusa2.</li>
	<li>Porcję wirusa należy podać w ilości 20 μl na probówkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2 i przechowywać w temperaturze -80 °C w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność PRV bezpośrednio przed wstrzyknięciem.</li>
</ol>
2. Chirurgiczne przygotowanie do iniekcji w mięśnie
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie ogólne przez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy-ksylazyny (100 mg/kg ketaminy; 10 mg/kg ksylazyny) i utrzymać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia za pomocą izofluoranu.</li>
	<li>Chroń rogówki maścią okulistyczną.</li>
	<li>Przygotować miejsce operacyjne zgodnie z techniką aseptyczną, przycinając włosy i dezynfekując miejsce operacyjne naprzemiennie peelingami Betadine i 70% alkoholu (minimum 3 cykle). Pamiętaj, aby użyć sterylnych obłożeń do zakrycia obszarów chirurgicznych. Upewnij się, że przestrzegasz sterylnych technik podczas wszystkich zabiegów. </li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry i odsłoń interesujący mięsień. Na przykład, aby uzyskać dostęp do mięśnia krtaniowego tarczycy, należy najpierw usunąć leżącą nad nim część mięśnia mostkowo-gnykowego.</li>
	<li>Uszczelnij wszystkie mięśnie, przez które doszło do przecięcia, za pomocą kleju tkankowego VetBond.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie PRV do mięśnia
<ol>
	<li>Załaduj do mikrostrzykawki NanoFil o pojemności 10 μl świeżo rozmrożony roztwór PRV, przymocuj igłę ze stali nierdzewnej 34 G i ostrożnie zamontuj ją na urządzeniu stereotaktycznym.</li>
	<li>Powoli oczyść martwą przestrzeń i sprawdź, czy roztwór wydostaje się z końcówki mikrostrzykawki. Wyrzuć płyn jako odpad bioharzard.</li>
	<li>Za pomocą stereotaktycznego urządzenia do mikropozycjonowania ostrożnie umieść końcówkę mikrostrzykawki w interesującym nas mięśniu i powoli wypełniaj mięsień, aż pojawi się lekki obrzęk. Szybkość wstrzykiwania będzie się różnić w zależności od wielkości mięśnia i objętości, która ma być wstrzyknięta. Na przykład pięć wstrzyknięć po 200 nl (łącznie 1 μl) z szybkością 4 nl/s należy wykonać w odstępie 1 minuty w tym samym miejscu, aby wypełnić mięsień pierścienno-tarczowy. Przesunąć strzykawkę do następnego interesującego mięśnia (w tym przypadku bocznego pierwiastka) i powtórzyć procedurę wstrzykiwania. Nakłuj każdy mięsień tylko raz.</li>
	<li>Wycofać mikrostrzykawkę po pięciu minutach.</li>
	<li>Uszczelnij przerwę w powięzi za pomocą kleju tkankowego VetBond.</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich wstrzyknięć należy zamknąć ranę za pomocą kleju tkankowego VetBond. W zależności od lokalnych wytycznych dotyczących stosowania zwierząt, można stosować szwy lub klipsy do ran. </li>
	<li>Monitoruj zwierzę aż do opadnięcia mostka i zapewnij mu środek przeciwbólowy, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt w instytucji.</li>
	<li>Po eksperymentalnie określonym czasie przeżycia (w tym przypadku 90 godzin na znakowanie neuronów korowych 2. rzędu), należy złożyć zwierzę w ofierze przez przedawkowanie pentobarbitalu i perfuzję przezsercową z 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% formaldehydu w 0,1 M PBS.</li>
	<li>Usuń mózg i utrwal go w 4% formaldehydzie przez 24 godziny.</li>
	<li>Krioprotektoratuj mózg w buforze fosforanowym zawierającym 30% sacharozy przez co najmniej 48 godzin.</li>
</ol>
4. Immunochemiczne wykrywanie eGFP
<ol>
	<li>Wycinaj sekcje z prędkością 40 μm na przesuwnym mikrotomie i zapisuj sekcje pływające w 0,1 m PBS. Cieńsze sekcje, na przykład 30 μm, mogą być stosowane do barwienia zamontowanych sekcji.</li>
	<li>Sekcje hartowania przez 30 min w 0,3% H2O2 w PBS chronione przed światłem.</li>
	<li>Blokować nieswoiste antygeny w skrawkach przez 30 minut w PBS zawierającym 0,3% Tween 20 z normalną kozią surowicą z zestawu VECTASTAIN Elite Kit (zestaw VE).</li>
	<li>Inkubować zablokowane sekcje przez 3,5 godziny w króliczym anty-eGFP (1:1,000) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie inkubować je przez 1 godzinę w kozim przeciwciałie drugorzędowym przeciwko królikowi z zestawu VE w RT.</li>
	<li>Przygotuj roztwór ABC z zestawu VE zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie reagować przez 1 godzinę w roztworze ABC z zestawu VE w RT.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i rozwijać przez 8 minut w buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 0,05% DAB (3,3'-diaminobenzydyny) i 0,015%H2O2.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na prowadnicach SuperFrost Plus i odwadniaj je za pomocą serii stopniowanych alkoholi (70%, 95%, 100% i 100% przez 5 minut każda).</li>
	<li>Oczyść skrawki przez dwie płukanki ksylenowe (każde po 5 minut) i nakryj szkiełka za pomocą środka montażowego Permount.</li>
	<li>Zobrazuj zamontowane sekcje pod mikroskopem. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być brązowy. Zdigitalizowane obrazy można odwrócić kolorami, aby podkreślić drobne procesy.</li>
</ol>
5. Chirurgiczne przygotowanie do wstrzykiwania znaczników w obszary mózgu odkryte przez śledzenie PRV
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie ogólne przez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy-ksylazyny (100 mg/kg ketaminy; 10 mg/kg ksylazyny) i utrzymać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia za pomocą izofluoranu.</li>
	<li>Chroń rogówki maścią okulistyczną.</li>
	<li>Zamocuj głowę w odpowiedniej ramie stereotaktycznej.</li>
	<li>Przygotować miejsce operacji zgodnie z techniką aseptyczną, przycinając włosy i dezynfekując miejsce naprzemiennie peelingami z betadyny i 70% alkoholu (minimum 3 cykle).</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry głowy i cofnij skórę nad interesującym obszarem mózgu.</li>
	<li>Wykonaj małą kraniotomię przy odpowiednich współrzędnych stereotaktycznych. Na przykład współrzędne kory ruchowej połączonej krtaniowo zidentyfikowanej przez śledzenie PRV u dorosłej myszy to 1,2 mm boczny i 0,2 mm rostralny do Bregmy.</li>
</ol>
6. Wstrzykiwanie biotynylowanych amin dekstranowych do mózgu
<ol>
	<li>Przygotować 7,5% biotynylowanych amin dekstranowych (BDA), rozpuszczając 25 mg BDA (10 000 MW) w 333 μl sterylnej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Napełnić system mikropipet Nanoject II roztworem BDA w ilości wystarczającej do planowanych wstrzyknięć.</li>
	<li>Powoli oczyść martwą przestrzeń i sprawdź, czy roztwór wydostaje się z końcówki mikropipety.</li>
	<li>Za pomocą stereotaktycznego urządzenia do mikropozycjonowania ostrożnie opuść końcówkę mikropipety do obszaru mózgu zainteresowania i powoli wstrzyknij BDA. Dostosuj szybkość wstrzykiwania w zależności od rozmiaru obszaru, który ma być oznaczony. Na przykład 12 wstrzyknięć 4,6 nl powinno być wykonanych w czterech różnych miejscach oddalonych od siebie o 0,2 mm (kierunek rostro-ogonowy), aby pokryć korę ruchową połączoną krtaniowo u dorosłych myszy. Ostateczna objętość wstrzyknięcia powinna być dostosowana do wielkości obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, pamiętając, że etykieta może rozprzestrzeniać się z rdzenia iniekcji poprzez dyfuzję przez tkankę mózgową i wzdłuż procesów znakowanych neuronów.</li>
	<li>Uszczelnij kraniotomię za pomocą cementu dentystycznego i zamknij ranę skóry głowy za pomocą kleju tkankowego VetBond.</li>
	<li>Monitoruj zwierzę aż do opadnięcia mostka i zapewnij mu środek przeciwbólowy, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt w instytucji.</li>
</ol>
7. Wstrzyknięcie podjednostki b toksyny do mięśni
<ol>
	<li>Przygotować 1% podjednostkę b (CTb) toksyny, rozpuszczając 1 mg CTb w 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Sześć dni po wstrzyknięciu BDA do mózgu należy wykonać przygotowanie chirurgiczne, jak opisano powyżej, do wstrzyknięć PRV do mięśni.</li>
	<li>Załaduj system mikrostrzykawkowy NanoFil o pojemności 10 μl roztworem CTb, zamocuj igłę ze stali nierdzewnej 34 G i ostrożnie zamontuj ją na urządzeniu stereotaktycznym.</li>
	<li>Wykonać mikroiniekcje w mięsień (mięśnie) będący przedmiotem zainteresowania, jak opisano wcześniej dla PRV.</li>
	<li>Monitoruj zwierzę aż do opadnięcia mostka i zapewnij mu środek przeciwbólowy, jedzenie, wodę i opiekę, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt w instytucji.</li>
	<li>Trzy dni po wstrzyknięciu CTb należy uśmiercić zwierzę przez przedawkowanie pentobarbitalu i perfuzję przezsercową z 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% formaldehydu w 0,1 M PBS.</li>
	<li>Usuń mózg i utrwal go w 4% formaldehydzie przez 24 godziny.</li>
	<li>Krioprotektoratuj mózg w buforze fosforanowym zawierającym 30% sacharozy przez co najmniej 48 godzin.</li>
</ol>
8. Wykrywanie BDA i CTb w tych samych sekcjach
<ol>
	<li>Wytnij odcinki z prędkością 40 μm na mikrotomie i zapisz pływające odcinki w 0,1 m PBS.</li>
	<li>Sekcje hartowania przez 30 min w 0,3% H2O2 w PBS chronione przed światłem.</li>
	<li>Przygotuj roztwór ABC z zestawu VE zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie reagować przez 1 godzinę w roztworze ABC w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i rozwijać przez 8 minut w buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 0,05% DAB (3,3'-diaminobenzydyny), 0,015%H2O2i 0,05% chlorku niklu. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być.</li>
	<li>Blokuj skrawki przez 30 minut w PBS zawierającym 0,3% Tween 20 z normalną surowicą króliczą z zestawu VECTASTAIN Elite.</li>
	<li>Inkubować zablokowane sekcje przez 2 godziny w kozim anty-CTb (1:10 000) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzy razy w PBS przez 5 minut, a następnie inkubować je przez 1 godzinę w drugorzędowym przeciwciałie przeciw kozom królika z zestawu VE w RT.</li>
	<li>Przygotuj roztwór ABC z zestawu VE zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzykrotnie w PBS przez 5 minut, a następnie reagować przez 30 minut w roztworze ABC w temperaturze pokojowej stężenia.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i rozwijać do 8 minut w buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 0,05% DAB (3,3'-diaminozydyny) i 0,015%H2O2. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien być brązowy.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na prowadnicach SuperFrost Plus i odwadniaj je za pomocą serii stopniowanych alkoholi (70%, 95%, 100% i 100% przez 5 minut każda).</li>
	<li>Oczyść skrawki przez dwie płukanki ksylenowe (każde po 5 minut) i nakryj szkiełka za pomocą środka montażowego Permount.</li>
	<li>Zobrazuj zamontowane sekcje pod mikroskopem.</li>
</ol>

<ol><li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22Transneuronal+circuit+analysis+with+pseudorabies+viruses.Multiple+values+selected%22">Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected</a>. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).</li>
<li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein%3A+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li>
<li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li>
<li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li>
<li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li>
<li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li>
<li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit%3A+comparison+of+three+different+visualization+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li>
<li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li>
<li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Magy+Allatorv+Lapja%22%5BJournal%5D)">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li>
<li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+as+transneuronal+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li>
<li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li>
<li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li>
<li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+modification+of+diaminobenzidine+%28DAB%29+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li>
<li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+%28ABC%29+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+%28PAP%29+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li>
<li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li>
<li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li>
<li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).</li>
<li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li>
<li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li>
<li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li>
<li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Istnieje szereg kwestii, które należy wziąć pod uwagę planując eksperyment z użyciem PRV1524,21. Co najważniejsze, wirus wścieklizny rzekomej jest śmiertelny. Jak wspomniano wcześniej, małpy człekokształtne, w tym ludzie, nie są podatne na infekcje, ale należy zachować odpowiednią ostrożność, aby chronić inne zwierzęta. Dorosłe myszy zazwyczaj przeżywają od pięciu do siedmiu dni po zaszczepieniu atenuowanym szczepem PRV152. Z tego powodu PRV152 nie jest odpowiedni do eksperymentów, które wymagają czasu przeżyc...

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem używanym do analizy centralnych eferentów, które regulują cele peryferyjne za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Podejście to było najszerzej stosowane w mózgu gryzoni poprzez wykorzystanie wirusa rzekomej wścieklizny (PRV) patogenu świń, zwłaszcza atenuowanego szczepu PRV-Bartha opisanego po raz pierwszy w 1961 roku. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji reprezentacji kory ruchowej określonych mięśni lub grup mięśniowych za pomocą rekombinowanego szczepu wirusa rzekomej wścieklizny (PRV152) wykazującego ekspresję genureporterowego 2 wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP). Opisana metoda wykorzystuje zachowanie wirusów neurotropowych, które wytwarzają zakaźne potomstwo, które krzyżuje synapsy, aby zainfekować inne neurony w obrębie obwodu funkcjonalnego3,4,13. PRV152, który jest izogeniczny z PRV-Bartha, przecina synapsy wstecznie przez hierarchiczną sekwencję połączeń synaptycznych z dala od miejsca infekcji3,5. Dzięki precyzyjnej kontroli obwodowego miejsca infekcji możliwe jest ograniczenie przedostawania się wirusa do mózgu przez określony podzbiór neuronów ruchowych. Ponieważ wirus sekwencyjnie infekuje łańcuchy połączonych neuronów, powstały wzorzec sygnału eGFP w całym mózgu rozwiąże sieć neuronów, które są połączone z początkowo zainfekowanymi komórkami.
Dodatkową zaletą używania wirusa do śledzenia neuronów jest amplifikacja białka reporterowego (w tym przypadku eGFP) w zainfekowanych komórkach. To wzmocnienie sygnału zapewnia poziom czułości, który umożliwia wykrywanie nawet rzadkich projekcji. Na przykład u szczurów przy użyciu białka zielonej fluorescencji14 stwierdzono rzadką projekcję z kory ruchowej wibrysy do neuronów ruchowych twarzy kontrolujących wąsy; Poprzednie badania nie zdołały znaleźć tej projekcji przy użyciu klasycznych znaczników bez reporterowej amplifikacji genu11,15. Niestety, wiele wektorów śledzenia wirusa, takich jak ten użyty w cytowanym badaniu, nie krzyżuje się z synapsami, ograniczając w ten sposób ich zastosowanie do śledzenia obwodów wielosynaptycznych.
Prezentując wyraźne korzyści dla identyfikacji sieci komórek uczestniczących w obwodzie motorycznym, rozproszony charakter śledzenia transsynaptycznego za pomocą PRV-152 utrudnia interpretację konkretnych połączeń w obwodzie. W związku z tym przedstawiamy prostą metodę walidacji określonych połączeń w obrębie obwodów zidentyfikowanych za pomocą PRV-152 poprzez podwójne znakowanie przy użyciu biotynylowanych amin dekstranowych (BDA) i podjednostki b toksyny (CTb). Łączne zastosowanie BDA i CTb jest dobrze ugruntowanym podejściem do śledzenia połączeń między określonymi zestawami neuronów6-8,11. Stosowane razem, te dwa znaczniki można zwizualizować w tej samej sekcji za pomocą dwukolorowej procedury DAB (3, 3'-diaminobenzydyna)16. BDA o wysokiej masie cząsteczkowej (BDA10kDa) został wybrany do tego protokołu, ponieważ zapewnia szczegółowe znakowanie procesów neuronalnych6,7,9. Do dodatkowych zalet BDA10kDa należą: jest on preferencyjnie transportowany w kierunku następczym6-8; może być dostarczany przez iniekcję jonoforetyczną lub ciśnieniową6-8; można go uwidocznić za pomocą prostej procedury HRP z biotynylacją awidyny (ABC)17; i można go obrazować za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej6,7,18. Immunochemiczne wykrywanie CTb za pomocą peroksydazy i DAB zostało wybrane do wstecznego znakowania neuronów ruchowych, ponieważ jest skuteczne w ujawnianiu procesów komórkowych, w tym dendrytów dystalnych10,19. Niedawno zastosowaliśmy to podejście do zidentyfikowania ścieżki motorycznej głosu u myszy i ujawnienia rzadkiego połączenia między pierwotną korą ruchową a neuronami ruchowymi krtani, które wcześniej zakładano, że jest nieobecne20.

<table><tbody><tr>Nazwa <td>firmy</td> zajmującej <td>się odczynnikiem/materiałem</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>System mikroiniekcji NanoFil</td><td>World Precision</td><td>Instruments IO-Kit Opcja 34</td><td>G</td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna David</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanolitr Injector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Przesuwny mikrotom</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td></td><td>3M 1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Izofluoran (Forane)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Patyczek do wacików Betadine</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 sztuk</td></tr><tr><td>Średni montaż Permount</td> Prowadnice <td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane aminy dekstranu</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10 000 MW</td></tr><tr><td>Wirus wścieklizny rzekomej</td><td>Laboratorium dr. Lynn Enquist (Uniwersytet Princeton)</td><td>PRV152</td><td>Miano >1 x 107</td></tr><tr><td>Podjednostka toksyny przeciwcholeryjskiej B (koza)</td><td>Lista Laboratoria biologiczne</td><td>703</td><td></td></tr><tr>Lista<td>podjednostek toksyny B</td><td>Laboratoria biologiczne</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>Tabletki 10 mg</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Rozcieńczony do 4%</td></tr> <tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr> <tr><td>Ketamina HCl & Ksylazyna HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml & 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorek niklu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1,0 M; pH 7,4</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7,4</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>dawka</td></tr> <tr><td>50 mg/mlSacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Klasa histologiczna</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (królik); PK-6105 (koza)</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Optixcare</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem używanym do analizy centralnych eferentów, które regulują cele peryferyjne za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Podejście to jest najszerzej stosowane w mózgu poprzez wykorzystanie wirusa wścieklizny rzekomej (PRV)1 u świń. PRV nie zakaża małp człekokształtnych, w tym ludzi, dlatego najczęściej stosuje się go w badaniach na małych ssakach, zwłaszcza gryzoniach. Szczep PRV152 przeciwko wściekliźnie rzekomej ulega ekspresji genu reporterowego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) i przecina funkcjonalne synapsy tylko wstecz przez hierarchiczną sekwencję połączeń synaptycznych z dala od miejsca infekcji2,3. Inne szczepy PRV mają odrębne właściwości mikrobiologiczne i mogą być transportowane w obu kierunkach (PRV-Becker i PRV-Kaplan)4,5 . Niniejszy protokół będzie dotyczył wyłącznie PRV152. Dostarczając wirusa do miejsca obwodowego, takiego jak mięśnie, możliwe jest ograniczenie wnikania wirusa do mózgu przez określony zestaw neuronów. Powstały w ten sposób wzorzec sygnału eGFP w całym mózgu rozdziela następnie neurony, które są połączone z początkowo zainfekowanymi komórkami. Ponieważ rozproszony charakter śledzenia transsynaptycznego z wirusem rzekomej wścieklizny utrudnia interpretację określonych połączeń w obrębie zidentyfikowanej sieci, przedstawiamy czułą i wiarygodną metodę wykorzystującą biotynylowane aminy dekstranowe (BDA) i podjednostkę b toksyny (CTb) do potwierdzania połączeń między komórkami zidentyfikowanymi za pomocą PRV152. Wybór pada na immunochemiczne wykrywanie BDA i CTb za pomocą peroksydazy i DAB (3,3'-diaminobenzydyny), ponieważ są one skuteczne w ujawnianiu procesów komórkowych, w tym dendrytów dystalnych6-11.

Barwienie na eGFP powinno zacząć wykazywać słaby sygnał w pierwotnych neuronach ruchowych około 72 hr po wstrzyknięciu PRV152 do mięśnia. Replikacja i transport transsynaptyczny wirusa zależą od miana oraz czasu4. Około 90 hr po wstrzyknięciu barwienie eGFP wykaże silny sygnał w zainfekowanych komórkach drugiego rzędu (2nd order). Dłuższe czasy przeżycia pozwolą na ujawnienie komórek trzeciego (3rd) i wyższych rzędów, jednak czas przeżycia jest ograniczony przez letalność PRV, która nastę...

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem do analizy centralnych eferentów regulujących cele obwodowe za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Tutaj przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transsynaptycznego wirusa wścieklizny rzekomej do identyfikacji i lokalizacji funkcjonalnego obwodu mózgu, a następnie klasyczne techniki śledzenia dróg w celu walidacji określonych połączeń w obwodzie między zidentyfikowanymi grupami neuronów.

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie centralnej sieci przedruchowej rozproszonych komórek, które oddziałują na konkretny cel obwodowy, a następnie potwierdzenie specyficznych połączeń między tymi komórkami w mózgu. Osiąga się to poprzez wstępne zainfekowanie obwodowo, za pośrednictwem mięśnia, obwodów przedruchowych transsynaptycznym wektorem wirusowym w sposób retrogradacyjny. Drugim krokiem procedury jest wizualizacja zainfekowanych komórek za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej.Trzecim krokiem jest potwierdzenie specyficznych połączeń w mózgu poprzez wstrzyknięcie monosynaptycznych znaczników skierowanych do wcześniej zidentyfikowanych węzłów w obwodzie przedruchowym. W rezultacie można wykazać, w jaki sposób komórki w rozproszonej sieci przedruchowej są ze sobą połączone, stosując kombinację transsynaptycznego śledzenia wirusowego oraz tradycyjnych monosynaptycznych technik neuroanatomicznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne monosynaptyczne śledzenie neuronów, jest możliwość identyfikacji węzłów rozproszonej sieci neuronowej oraz określenia specyficznych połączeń między komórkami w tej sieci u znieczuczonej myszy.Przygotuj pole operacyjne poprzez przycięcie sierści i dezynfekcję skóry, wykonując co najmniej trzy naprzemienne przemycia Betadyną i 70% alkoholem. Następnie wykonaj nacięcie skóry w okolicy gardła i odsłoń interesujący mięsień. Na przykład, aby uzyskać dostęp do mięśnia pierścienno-tarczowego krtani, konieczne jest uprzednie usunięcie nadkładającej części mięśnia mostkowo-gnykowego; wszelkie przecięte mięśnie należy zabezpieczyć tkankowym klejem wet bond.Następnie należy napełnić system mikros Strzykawki nano-fill o pojemności 10 µL świeżo rozmrożonym roztworem PR RV. Powoli usunąć pęcherzyki powietrza z przestrzeni martwej i sprawdzić, czy roztwór wypływa z końcówki mikrosstrzykawki. Płyn należy zutylizować jako odpad biologiczny, a następnie ostrożnie zamontować strzykawkę w urządzeniu stereotaktycznym.Używając urządzenia do mikropozycjonowania, ostrożnie wprowadź końcówkę igły do wybranego mięśnia. Następnie powoli wypełniaj mięsień, aż pojawi się lekkie obrzmienie. Przenieś teraz strzykawkę do kolejnego wybranego mięśnia, w tym przypadku mięśnia pierścienno-tarczowego bocznego, i powtórz czynność.Procedura wstrzykiwania polega jedynie na nakłuciu każdego mięśnia. Prędkość wstrzykiwania będzie różnić się w zależności od wielkości mięśnia i objętości substancji do podania. Na przykład, aby wypełnić mięsień pierścienno-tarczowy, w tym samym miejscu należy wykonać pięć wstrzyknięć po 200 nanolitrów z prędkością 4 nanolitrów na sekundę w odstępach jednominutowych.Po wycofaniu mikroszystrzyki, uszczelnij przerwanie powięzi, używając kleju tkankowego vet bond. Po zakończeniu wszystkich iniekcji, zamknij ranę za pomocą kleju tkankowego vet bond. Monitoruj zwierzę, aż przyjmie pozycję sternalną.Następnie zapewnić leki przeciwbólowe, pokarm, wodę oraz opiekę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi zwierząt. Procedura analizy ekspresji EGFP oraz neuronów zainfekowanych PRV została szczegółowo opisana w protokole tekstowym.Obróbka tkanek jest bardzo podobna do tej opisanej w dalszej części tego filmu. Rozpocznij od znieczulenia dorosłej myszy, chroniąc jej oczy i stabilizując pozycję głowy. Następnie przygotuj pole operacyjne zgodnie z wcześniejszym opisem, stosując naprzemienne przemywanie Betadyną i 70% alkoholem.Następnie wykonaj nacięcie skóry głowy i odsun jej płaty znad mózgu. Obszar zainteresowania. Wykonaj niewielką kraniotomię za pomocą wiertarki we właściwych współrzędnych stereotaktycznych.Na przykład współrzędne krtaniowego obszaru kory ruchowej, zidentyfikowane za pomocą śledzenia PRV u dorosłej myszy, wynoszą 1,2 mm bocznie i 0,2 mm rostralnie względem bgma. Następnie należy przygotować 7,5% roztwór biotynilowanych dekstran amin w wodzie sterylnej. Potem należy napełnić system mikropipet nano jet two ilością roztworu BDA wystarczającą do zaplanowanych wstrzyknięć.Powoli usuń pęcherzyki powietrza z przestrzeni martwej i upewnij się, że roztwór wypływa z końcówki mikropipety. Używając urządzenia do mikropozycjonowania, ostrożnie opuść końcówkę mikropipety do wybranego obszaru mózgu i powoli wstrzyknij roztwór BDA. Dostosuj tempo wstrzykiwania w zależności od wielkości obszaru przeznaczonego do znakowania.Na przykład, w czterech różnych miejscach należy wykonać po 12 iniekcji objętości 4.6 nanolitrów. W odstępach 0.2 milimetrów. W celu pokrycia kory ruchowej połączonej z krtanią u dorosłej myszy.Końcową objętość wstrzyknięcia należy dostosować do wielkości obszaru zainteresowania. Należy pamiętać, że znacznik może dyfundować z rdzenia wstrzyknięcia przez tkankę mózgową oraz wzdłuż wypustek znakowanych neuronów. Otwór trepanacyjny należy oczyścić i zwilżyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie zamknąć ranę skóry głowy za pomocą weterynaryjnego kleju tkankowego vet bond.Monitoruj zwierzę do momentu, aż przyjmie pozycję grzbietową. Następnie zapewnij leczenie przeciwbólowe, pokarm, wodę oraz opiekę zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami.Sześć dni później do mięśnia zwierzęcia można wstrzyknąć podjednostkę B toksyny cholerycznej. Następnie po trzech dniach zwierzę należy poddać eutanazji w celu przeprowadzenia analizy. Przygotować przekroje o grubości 40 mikronów przy użyciu kriostatu i zachować pływające przekroje w 0,1 molarnym PBS; przeprowadzić gaszenie przekrojów przy użyciu 0,3% nadtlenku wodoru w PBS przez 30 minut, wstrząsając i chroniąc przed światłem.Pranie przekrojów należy przeprowadzić trzykrotnie w PBS przez pięć minut podczas każdego płukania. Następnie inkubować je przez godzinę w świeżo przygotowanym roztworze A b, C w temperaturze pokojowej. Na koniec przekroje należy przemyć trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut podczas każdego płukania.Następnie przeprowadź odczynianie przez osiem minut w obecności mieszania w buforze fosforanowym o pH 7.4 zawierającym DAB, nadtlenek wodoru i chlorek niklu. Produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien przybrać kolor czarny.Następnie przeprowadź blokowanie przekrojów podczas wstrząsania przez 30 minut w PBS zawierającym 0,3% tween 20 z normalnym surowicą królika z zestawu vector stain elite. Następnie inkubuj zablokowane przekroje z przeciwciałami kozimi przeciwko CTB podczas wstrząsania przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Potem przemyj przekroje jeszcze trzy razy w PBS przez pięć minut podczas każdego płukania.Nanieś przeciwciało wtórne antykrólicze z zestawu VE i inkubuj skrawki podczas wytrząsania przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyj skrawki trzykrotnie w PBS przez pięć minut podczas każdego płukania, a następnie poddaj je reakcji przez 30 minut w świeżo przygotowanym roztworze A, b, C w temperaturze pokojowej. Przemyj skrawki trzykrotnie w buforze fosforanowym przez 10 minut i inkubuj skrawki przez osiem minut.W roztworze wywoływującym produkt reakcji DAB wewnątrz komórek powinien przybrać brązowy kolor. Następnie należy zamocować skrawki na szkiełkach Super Frost Plus, odwodnić tkankę w serii roztworów alkoholu o rosnącym stężeniu, a następnie przeprowadzić dwa etapy przejaśniania w ksylenie. Na koniec okryć preparaty szkiełkami przy użyciu medium Paramount i przystąpić do obrazowania.Barwienie na EGFP powinno zacząć wykazywać słaby sygnał w głównych neuronach ruchowych 72 godziny po wstrzyknięciu P RV 1 52, a po 90 godzinach barwienie staje się wyraźne. To jądro niejednoznaczne, w którym znajdują się krtaniowe neurony ruchowe, jest widoczne 94 godziny po wstrzyknięciu P RV 1 52 do dwóch z siedmiu mięśni krtani, ponieważ wirus przedostał się do mózgu poprzez neurony unerwiające zainfekowane mięśnie.Inne grupy motoneuronów ruchowych, takie jak jądro językowo-gardłowe, nie wykazują ekspresji EGFP po 90 godzinach. EGFP jest widoczne w komórkach drugiego rzędu. Neurony te w pniu mózgu zostały zabarwione po pierwotnej infekcji w jądrze dwuznacznym.Iniekcja była jednostronna, a wynikowy wzór oznakowania w pniu mózgu wykazuje zakażenie jądra po stronie ipsilateralnej. Zakażone zostały również interneurony siateczkowate jądra dwuzębnego i jądra błędnego, które wykazują silne barwienie na EGFP. Interneurony te łączą różne struktury, w tym grupy motoneuronów gałkowoczepnych oraz przeciwległe jądro dwuzębne.Jednak ich cele eferentne pozostają nieoznaczone, ponieważ wirus rozprzestrzenia się wyłącznie w kierunku retrogradnym. Czas przeżycia przy zastosowaniu PRV jest ograniczony, ale można zaobserwować barwienie EGFP w komórkach trzeciego i wyższego rzędu; neurony przedmotoryczne w korze ruchowej wykazywały ekspresję EGFP po stronie przeciwległej do miejsca iniekcji obwodowej. Prawdopodobnie zainfekowana została jedynie populacja komórek tworzących korową reprezentację ruchową mięśni krtani.Aksony znakowane BDA na poziomie jądra niejednoznacznego, zaznaczone grotami strzałek, nawiązują kontakt z dodatnimi dla CTB neuronami ruchowymi, które zostały znakowane retrogradnie poprzez wstrzyknięcia do mięśni krtani widoczne na brązowo; aksony tworzą żyłki oraz domniemane zakończenia typu baton (terminal batons) w pobliżu dendrytów neuronów ruchowych krtani oraz w pobliżu ich somy. Wymagane są dalsze eksperymenty z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej lub elektrofizjologii, aby ustalić, czy żyłki te reprezentują synapsy. Obustronne wstrzyknięcie BDA do kory ruchowej połączonej z krtanią jest widoczne na czarno; ponieważ BDA nie jest specyficzne kierunkowo, mogą zostać znakowane zarówno połączenia doprowadzające, jak i odprowadzające.Na przykład w wzgórzu widoczne jest zarówno pole projekcyjne znakowania anterogradnego, jak i ciała komórek znakowane retrogradnie. Komórki wzgórza są wskazane grotami strzałek, a torebka wewnętrzna została znakowana w celu orientacji. Należy pamiętać, że praca z wirusem pseudowścieklizny oraz DAB może być niezwykle niebezpieczna i wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak sterylizacja.Wszystkie materiały, które miały kontakt z PRV lub DAB, należy zdezynfekować 10% roztworem wybielacza. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zapewnić odpowiednią utylizację stałych i ciekłych odpadów biologicznych zgodnie z przepisami obowiązującymi w danej instytucji.

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem pseudoskurczu trzonowców, z następczym podwójnym znakamiem Toksyną Cholerae i biotynylowanymi aminu dekstranami

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Tutaj prezentujemy wyrafinowany protokół, który skutecznie ujawnia znakowanie biotynylowanej aminy dekstranu (BDA) metodą barwienia fluorescencyjnego poprzez wzajemną ścieżkę neuronową. Nadaje się do analizy drobnej struktury znakowania BDA i odróżniania jej od innych elementów nerwowych pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.

Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Poznaj metodę śledzenia transsynaptycznego wirusem pseudowścieklizny do mapowania obwodów nerwowych i potwierdzania połączeń neuronowych w mózgu myszy.

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu (Wideo) | JoVE Journal

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

Przeglądaj więcej filmów