Wprowadzenie do transfekcji
Transfekcja jest procesem wprowadzania materiału genetycznego, takiego jak DNA i dwuniciowy RNA, do komórek ssaków. Wprowadzenie DNA do komórki umożli…
Transfekcja to proces wprowadzania materiału genetycznego, takiego jak DNA i dwuniciowe RNA, do komórek ssaków. Wprowadzenie DNA umożliwia ekspresję, czyli produkcję białek przy użyciu własnego aparatu komórkowego. Z kolei wprowadzenie dwuniciowego RNA służy do wyciszenia produkcji konkretnego białka poprzez zatrzymanie translacji. To potężne narzędzie pozwoliło badaczom lepiej analizować funkcję i ekspresję genów, funkcję białek oraz mutacje genetyczne.
Żaden pojedynczy odczynnik ani metoda transfekcji nie sprawdza się we wszystkich typach komórek. Na szczęście w ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele metod i odczynników ułatwiających transfekcję szerokiej gamy komórek. Metody te można podzielić na dwie główne grupy: transfekcje chemiczne i fizyczne.
W tym filmie skupimy się na różnych chemicznych systemach dostarczania, ponieważ w ostatnich latach stały się one coraz powszechniejsze. Metody te obejmują między innymi podejścia oparte na lipidach, transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia oraz wykorzystanie polimerów kationowych.
Podstawowa zasada wszystkich chemicznych metod transfekcji jest podobna. Wszystkie one wykorzystują dodatnio naładowane cząsteczki nośnikowe, które tworzą kompleksy z kwasami nukleinowymi, aby zapakować je do dostarczenia do komórek. Cząsteczki nośnikowe te przełamują barierę ujemnego ładunku błony komórkowej, co pozwala im przejść przez błonę i dostarczyć zawartość.
W transfekcji lipidowej lipidy kationowe tworzą liposom, który następnie łączy się z kwasami nukleinowymi, tworząc „kompleks transfekcyjny”. Z kolei fosforan wapnia po prostu kondensuje DNA i nadaje mu wypadkowy ładunek dodatni. Ponadto polimery kationowe, takie jak polietylenoimina, kondensują DNA w dodatnio naładowane cząstki.
Kolejnym krokiem w transfekcji zapośredniczonej chemicznie jest przyłączenie dodatnio naładowanych kompleksów do ujemnie naładowanej błony komórkowej poprzez proste przyciąganie elektrostatyczne.
Następnie kompleks wnika do komórki poprzez endocytozę – proces, w którym cząsteczki dostają się do wnętrza komórki za pomocą pęcherzyków błonowych zwanych endosomami.
Po dostaniu się do wnętrza komórki kwasy nukleinowe muszą wydostać się z endosomu w procesie, który nie jest jeszcze znany. Po opuszczeniu endosomu kwasy nukleinowe trafiają do cytoplazmy komórki, a ostatecznie do jądra, gdzie mechanizmy komórkowe są w stanie wytworzyć z nich mRNA, a następnie białko. Cytoplazma jest miejscem działania małych interferujących RNA, czyli siRNA, które redukują produkcję białka, interferując z częścią mechanizmu produkcyjnego białek w komórce.
Transfekowane DNA może występować w formie stabilnej lub przejściowej. Transfekcje stabilne zachodzą, gdy transfekowane DNA zostaje wprowadzone do genomu, a zatem utrzymuje się podczas podziałów komórkowych. Transfekcje przejściowe występują wtedy, gdy DNA nie zostaje włączone do genomu, a ekspresja kodowanego białka zanika w ciągu około 24-96 godzin.
Wydajność transfekcji DNA jest zazwyczaj mierzona za pomocą systemów reporterowych powiązanych z wprowadzonym genem. Są to systemy, które można łatwo wykryć albo poprzez bezpośrednią obserwację samego białka reporterowego, jak w przypadku zielonego białka fluorescencyjnego, albo poprzez pomiar jego aktywności enzymatycznej za pomocą testu kolorymetrycznego, jak w przypadku enzymu reporterowego lucyferazy. Stabilną transfekcję DNA najlepiej mierzyć za pomocą analizy genomicznej, np. RT-PCR.
Aby ocenić skuteczność wyciszania przez siRNA, poziomy białka docelowego w każdej próbce można określić metodą Immunoblot. Skuteczna transfekcja siRNA powinna obniżyć ekspresję białka docelowego w komórkach, podczas gdy poziomy genu gospodarza, GAPDH, pozostają stabilne.
Aby zmaksymalizować wydajność transfekcji, komórki w momencie transfekcji powinny znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego i wykazywać konfluencję od 40 do 80%. Aby to osiągnąć, komórki w hodowli należy zebrać dzień wcześniej... przeliczyć... i wysiać na płytkę wielodołkową w stężeniu, które zapewni odpowiedni poziom konfluencji w momencie transfekcji.
Następnie miesza się odczynniki chemiczne i kwasy nukleinowe, pozostawiając czas na utworzenie kompleksów kwasu nukleinowego z odczynnikiem. Dla każdego chemicznego systemu dostarczania należy zoptymalizować specyficzne stężenia poszczególnych komponentów.
Następnie kompleksy kwasu nukleinowego z odczynnikiem dodaje się do wysianych komórek i inkubuje, często przez noc, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na przyłączenie się kompleksów do komórek i przeprowadzenie transfekcji. Po 24 godzinach należy usunąć medium i zastąpić je świeżą pożywką hodowlaną.
Istnieje wiele wariantów i zastosowań transfekcji. Kotransfekcja może pozwolić badaczowi na analizę wpływu mutacji missense na funkcję białek komórkowych. W tym przypadku do komórek HeLa przetransfekowano RNAi w celu wyciszenia endogennego białka BRCA1, co powoduje zmniejszenie liczby komórek GFP-dodatnich. Jednocześnie do komórek przetransfekowano zmutowane białko BRCA1, które było przez nie produkowane. Jeśli zmutowane białko było w pełni funkcjonalne, powodowało odzyskanie liczby komórek GFP-dodatnich, natomiast jeśli mutacja negatywnie wpływała na funkcję, liczba komórek GFP-dodatnich pozostawała niska.
Jako alternatywę dla chemicznych metod transfekcji, badacz przedstawiony tutaj wykorzystuje armatkę genową do wystrzeliwania w kierunku hodowli komórkowych cząsteczek złota pokrytych DNA. Komórki, w których cytoplazmie znajdą się te małe, pokryte DNA pociski, mają dużą szansę na ulegnięcie transfekcji.
Kolejną alternatywną metodą transfekcji jest elektroporacja. Elektroporacja polega na wykorzystaniu prądu elektrycznego do uszkodzenia błony komórkowej, co pozwala DNA lub RNA wniknąć do wnętrza komórki na krótki czas, zanim komórki zdążą się zregenerować. Tutaj elektrody pęsetowe zostają umieszczone wokół mózgu myszy, a następnie przez mózg przepuszczane są krótkie impulsy elektryczne, aby zainicjować transfekcję ex-vivo wstrzykniętych cząsteczek RNAi znajdujących się w niebieskim roztworze. Następnie obserwuje się wpływ wyciszenia genów na strukturę rozwijającej się kory mózgowej.
Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat transfekcji. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Transfekcja to proces wprowadzania materiału genetycznego, takiego jak DNA i dwuniciowe RNA, do komórek ssaków. Wprowadzenie DNA umożliwia ekspresję, czyli produkcję białek przy użyciu własnego aparatu komórkowego. Z kolei wprowadzenie dwuniciowego RNA służy do wyciszenia produkcji konkretnego białka poprzez zatrzymanie translacji. To potężne narzędzie pozwoliło badaczom lepiej analizować funkcję i ekspresję genów, funkcję białek oraz mutacje genetyczne.
Żaden pojedynczy odczynnik ani metoda transfekcji nie sprawdza się we wszystkich typach komórek. Na szczęście w ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele metod i odczynników ułatwiających transfekcję szerokiej gamy komórek. Metody te można podzielić na dwie główne grupy: transfekcje chemiczne i fizyczne.
W tym filmie skupimy się na różnych chemicznych systemach dostarczania, ponieważ w ostatnich latach stały się one coraz powszechniejsze. Metody te obejmują między innymi podejścia oparte na lipidach, transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia oraz wykorzystanie polimerów kationowych.
Podstawowa zasada wszystkich chemicznych metod transfekcji jest podobna. Wszystkie one wykorzystują dodatnio naładowane cząsteczki nośnikowe, które tworzą kompleksy z kwasami nukleinowymi, aby zapakować je do dostarczenia do komórek. Cząsteczki nośnikowe te przełamują barierę ujemnego ładunku błony komórkowej, co pozwala im przejść przez błonę i dostarczyć zawartość.
W transfekcji lipidowej lipidy kationowe tworzą liposom, który następnie łączy się z kwasami nukleinowymi, tworząc „kompleks transfekcyjny”. Z kolei fosforan wapnia po prostu kondensuje DNA i nadaje mu wypadkowy ładunek dodatni. Ponadto polimery kationowe, takie jak polietylenoimina, kondensują DNA w dodatnio naładowane cząstki.
Kolejnym krokiem w transfekcji zapośredniczonej chemicznie jest przyłączenie dodatnio naładowanych kompleksów do ujemnie naładowanej błony komórkowej poprzez proste przyciąganie elektrostatyczne.
Następnie kompleks wnika do komórki poprzez endocytozę – proces, w którym cząsteczki dostają się do wnętrza komórki za pomocą pęcherzyków błonowych zwanych endosomami.
Po dostaniu się do wnętrza komórki kwasy nukleinowe muszą wydostać się z endosomu w procesie, który nie jest jeszcze znany. Po opuszczeniu endosomu kwasy nukleinowe trafiają do cytoplazmy komórki, a ostatecznie do jądra, gdzie mechanizmy komórkowe są w stanie wytworzyć z nich mRNA, a następnie białko. Cytoplazma jest miejscem działania małych interferujących RNA, czyli siRNA, które redukują produkcję białka, interferując z częścią mechanizmu produkcyjnego białek w komórce.
Transfekowane DNA może występować w formie stabilnej lub przejściowej. Transfekcje stabilne zachodzą, gdy transfekowane DNA zostaje wprowadzone do genomu, a zatem utrzymuje się podczas podziałów komórkowych. Transfekcje przejściowe występują wtedy, gdy DNA nie zostaje włączone do genomu, a ekspresja kodowanego białka zanika w ciągu około 24-96 godzin.
Wydajność transfekcji DNA jest zazwyczaj mierzona za pomocą systemów reporterowych powiązanych z wprowadzonym genem. Są to systemy, które można łatwo wykryć albo poprzez bezpośrednią obserwację samego białka reporterowego, jak w przypadku zielonego białka fluorescencyjnego, albo poprzez pomiar jego aktywności enzymatycznej za pomocą testu kolorymetrycznego, jak w przypadku enzymu reporterowego lucyferazy. Stabilną transfekcję DNA najlepiej mierzyć za pomocą analizy genomicznej, np. RT-PCR.
Aby ocenić skuteczność wyciszania przez siRNA, poziomy białka docelowego w każdej próbce można określić metodą Immunoblot. Skuteczna transfekcja siRNA powinna obniżyć ekspresję białka docelowego w komórkach, podczas gdy poziomy genu gospodarza, GAPDH, pozostają stabilne.
Aby zmaksymalizować wydajność transfekcji, komórki w momencie transfekcji powinny znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego i wykazywać konfluencję od 40 do 80%. Aby to osiągnąć, komórki w hodowli należy zebrać dzień wcześniej... przeliczyć... i wysiać na płytkę wielodołkową w stężeniu, które zapewni odpowiedni poziom konfluencji w momencie transfekcji.
Następnie miesza się odczynniki chemiczne i kwasy nukleinowe, pozostawiając czas na utworzenie kompleksów kwasu nukleinowego z odczynnikiem. Dla każdego chemicznego systemu dostarczania należy zoptymalizować specyficzne stężenia poszczególnych komponentów.
Następnie kompleksy kwasu nukleinowego z odczynnikiem dodaje się do wysianych komórek i inkubuje, często przez noc, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na przyłączenie się kompleksów do komórek i przeprowadzenie transfekcji. Po 24 godzinach należy usunąć medium i zastąpić je świeżą pożywką hodowlaną.
Istnieje wiele wariantów i zastosowań transfekcji. Kotransfekcja może pozwolić badaczowi na analizę wpływu mutacji missense na funkcję białek komórkowych. W tym przypadku do komórek HeLa przetransfekowano RNAi w celu wyciszenia endogennego białka BRCA1, co powoduje zmniejszenie liczby komórek GFP-dodatnich. Jednocześnie do komórek przetransfekowano zmutowane białko BRCA1, które było przez nie produkowane. Jeśli zmutowane białko było w pełni funkcjonalne, powodowało odzyskanie liczby komórek GFP-dodatnich, natomiast jeśli mutacja negatywnie wpływała na funkcję, liczba komórek GFP-dodatnich pozostawała niska.
Jako alternatywę dla chemicznych metod transfekcji, badacz przedstawiony tutaj wykorzystuje armatkę genową do wystrzeliwania w kierunku hodowli komórkowych cząsteczek złota pokrytych DNA. Komórki, w których cytoplazmie znajdą się te małe, pokryte DNA pociski, mają dużą szansę na ulegnięcie transfekcji.
Kolejną alternatywną metodą transfekcji jest elektroporacja. Elektroporacja polega na wykorzystaniu prądu elektrycznego do uszkodzenia błony komórkowej, co pozwala DNA lub RNA wniknąć do wnętrza komórki na krótki czas, zanim komórki zdążą się zregenerować. Tutaj elektrody pęsetowe zostają umieszczone wokół mózgu myszy, a następnie przez mózg przepuszczane są krótkie impulsy elektryczne, aby zainicjować transfekcję ex-vivo wstrzykniętych cząsteczek RNAi znajdujących się w niebieskim roztworze. Następnie obserwuje się wpływ wyciszenia genów na strukturę rozwijającej się kory mózgowej.
Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat transfekcji. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.