Wprowadzenie do transfekcji

Transfekcja to proces wprowadzania materiału genetycznego, takiego jak DNA i dwuniciowe RNA, do komórek ssaków. Wprowadzenie DNA umożliwia ekspresję, czyli produkcję białek przy użyciu własnego aparatu komórkowego. Z kolei wprowadzenie dwuniciowego RNA służy do wyciszenia produkcji konkretnego białka poprzez zatrzymanie translacji. To potężne narzędzie pozwoliło badaczom lepiej analizować funkcję i ekspresję genów, funkcję białek oraz mutacje genetyczne.

Żaden pojedynczy odczynnik ani metoda transfekcji nie sprawdza się we wszystkich typach komórek. Na szczęście w ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele metod i odczynników ułatwiających transfekcję szerokiej gamy komórek. Metody te można podzielić na dwie główne grupy: transfekcje chemiczne i fizyczne.

W tym filmie skupimy się na różnych chemicznych systemach dostarczania, ponieważ w ostatnich latach stały się one coraz powszechniejsze. Metody te obejmują między innymi podejścia oparte na lipidach, transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia oraz wykorzystanie polimerów kationowych.

Podstawowa zasada wszystkich chemicznych metod transfekcji jest podobna. Wszystkie one wykorzystują dodatnio naładowane cząsteczki nośnikowe, które tworzą kompleksy z kwasami nukleinowymi, aby zapakować je do dostarczenia do komórek. Cząsteczki nośnikowe te przełamują barierę ujemnego ładunku błony komórkowej, co pozwala im przejść przez błonę i dostarczyć zawartość.

W transfekcji lipidowej lipidy kationowe tworzą liposom, który następnie łączy się z kwasami nukleinowymi, tworząc „kompleks transfekcyjny”. Z kolei fosforan wapnia po prostu kondensuje DNA i nadaje mu wypadkowy ładunek dodatni. Ponadto polimery kationowe, takie jak polietylenoimina, kondensują DNA w dodatnio naładowane cząstki.

Kolejnym krokiem w transfekcji zapośredniczonej chemicznie jest przyłączenie dodatnio naładowanych kompleksów do ujemnie naładowanej błony komórkowej poprzez proste przyciąganie elektrostatyczne.

Następnie kompleks wnika do komórki poprzez endocytozę – proces, w którym cząsteczki dostają się do wnętrza komórki za pomocą pęcherzyków błonowych zwanych endosomami.

Po dostaniu się do wnętrza komórki kwasy nukleinowe muszą wydostać się z endosomu w procesie, który nie jest jeszcze znany. Po opuszczeniu endosomu kwasy nukleinowe trafiają do cytoplazmy komórki, a ostatecznie do jądra, gdzie mechanizmy komórkowe są w stanie wytworzyć z nich mRNA, a następnie białko. Cytoplazma jest miejscem działania małych interferujących RNA, czyli siRNA, które redukują produkcję białka, interferując z częścią mechanizmu produkcyjnego białek w komórce.

Transfekowane DNA może występować w formie stabilnej lub przejściowej. Transfekcje stabilne zachodzą, gdy transfekowane DNA zostaje wprowadzone do genomu, a zatem utrzymuje się podczas podziałów komórkowych. Transfekcje przejściowe występują wtedy, gdy DNA nie zostaje włączone do genomu, a ekspresja kodowanego białka zanika w ciągu około 24-96 godzin.

Wydajność transfekcji DNA jest zazwyczaj mierzona za pomocą systemów reporterowych powiązanych z wprowadzonym genem. Są to systemy, które można łatwo wykryć albo poprzez bezpośrednią obserwację samego białka reporterowego, jak w przypadku zielonego białka fluorescencyjnego, albo poprzez pomiar jego aktywności enzymatycznej za pomocą testu kolorymetrycznego, jak w przypadku enzymu reporterowego lucyferazy. Stabilną transfekcję DNA najlepiej mierzyć za pomocą analizy genomicznej, np. RT-PCR.

Aby ocenić skuteczność wyciszania przez siRNA, poziomy białka docelowego w każdej próbce można określić metodą Immunoblot. Skuteczna transfekcja siRNA powinna obniżyć ekspresję białka docelowego w komórkach, podczas gdy poziomy genu gospodarza, GAPDH, pozostają stabilne.

Aby zmaksymalizować wydajność transfekcji, komórki w momencie transfekcji powinny znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego i wykazywać konfluencję od 40 do 80%. Aby to osiągnąć, komórki w hodowli należy zebrać dzień wcześniej... przeliczyć... i wysiać na płytkę wielodołkową w stężeniu, które zapewni odpowiedni poziom konfluencji w momencie transfekcji.

Następnie miesza się odczynniki chemiczne i kwasy nukleinowe, pozostawiając czas na utworzenie kompleksów kwasu nukleinowego z odczynnikiem. Dla każdego chemicznego systemu dostarczania należy zoptymalizować specyficzne stężenia poszczególnych komponentów.

Następnie kompleksy kwasu nukleinowego z odczynnikiem dodaje się do wysianych komórek i inkubuje, często przez noc, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na przyłączenie się kompleksów do komórek i przeprowadzenie transfekcji. Po 24 godzinach należy usunąć medium i zastąpić je świeżą pożywką hodowlaną.

Istnieje wiele wariantów i zastosowań transfekcji. Kotransfekcja może pozwolić badaczowi na analizę wpływu mutacji missense na funkcję białek komórkowych. W tym przypadku do komórek HeLa przetransfekowano RNAi w celu wyciszenia endogennego białka BRCA1, co powoduje zmniejszenie liczby komórek GFP-dodatnich. Jednocześnie do komórek przetransfekowano zmutowane białko BRCA1, które było przez nie produkowane. Jeśli zmutowane białko było w pełni funkcjonalne, powodowało odzyskanie liczby komórek GFP-dodatnich, natomiast jeśli mutacja negatywnie wpływała na funkcję, liczba komórek GFP-dodatnich pozostawała niska.

Jako alternatywę dla chemicznych metod transfekcji, badacz przedstawiony tutaj wykorzystuje armatkę genową do wystrzeliwania w kierunku hodowli komórkowych cząsteczek złota pokrytych DNA. Komórki, w których cytoplazmie znajdą się te małe, pokryte DNA pociski, mają dużą szansę na ulegnięcie transfekcji.

Kolejną alternatywną metodą transfekcji jest elektroporacja. Elektroporacja polega na wykorzystaniu prądu elektrycznego do uszkodzenia błony komórkowej, co pozwala DNA lub RNA wniknąć do wnętrza komórki na krótki czas, zanim komórki zdążą się zregenerować. Tutaj elektrody pęsetowe zostają umieszczone wokół mózgu myszy, a następnie przez mózg przepuszczane są krótkie impulsy elektryczne, aby zainicjować transfekcję ex-vivo wstrzykniętych cząsteczek RNAi znajdujących się w niebieskim roztworze. Następnie obserwuje się wpływ wyciszenia genów na strukturę rozwijającej się kory mózgowej.

Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat transfekcji. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!