Name: Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę izolacji neuronów i gleju z splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy. Ta technika umożliwia badanie funkcji komórek nerwowych układu pokarmowego in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Grant Narodowego Instytutu Zdrowia DA024009, DK046367 & T32DA007027.

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów były zgodne i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Virginia Commonwealth University.
1. Przygotowanie sterylnych szkiełek nakrywkowych z poli-D-lizyny i lamininy na płytkach 24-dołkowych
<ol>
	<li>Wszystkie procedury dla kroku 1 są wykonywane w sterylnych warunkach, pod kapturem i przy użyciu sterylnych odczynników. Szkiełka nakrywkowe i podwójnie dejonizowaną wodę (ddH2O) należy wcześniej wysterylizować. Przygotowanie płytek można wykonać do dwóch tygodni przed izolacją neuronów.</li>
	<li>Pod maską użyj sterylnych kleszczyków, aby umieścić autoklawizowane szklane szkiełka nakrywkowe w 12 dołkach 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Przygotuj zapas poli-D-lizyny z wyprzedzeniem. Dodać 50 ml sterylnego ddH2O do 5 mg poli-D-lizyny. Odwirować i przechowywać w 3 ml porcji w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności rozmrozić przed użyciem.</li>
	<li>Aby uzyskać końcowe stężenie 1 ml bulionu z poli-D-lizyny na 25 cm2: odpipetować 80 μl poli-D-lizyny na wierzchu każdego szklanego szkiełka nakrywkowego (2 cm2). Pozostaw roztwór na 10 minut.</li>
	<li>Usunąć poli-D-lizynę za pomocą próżni i spłukać szkiełka nakrywkowe 3x sterylnym ddH2O.</li>
	<li>Pozostaw talerze do wyschnięcia na co najmniej 2 godziny pod maską.</li>
	<li>Płytki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub -20 °C przed przystąpieniem do powlekania lamininą.</li>
	<li>Przygotuj bulion z lamininy z wyprzedzeniem. Rozmrozić lamininę na lodzie i trzymać na lodzie podczas użytkowania. Rozcieńczyć do stężenia 50 μg/ml; zwróć uwagę na koncentrację partii; Każda partia będzie inna. W zależności od stężenia w partii, do każdej fiolki lamininy dodaje się około 20 ml ddH2O. Podwielokrotność porcji (5 ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C. Przed użyciem rozmrozić porcje na lodzie.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe pokryć 5 μg/cm2 lamininy; odpipetować 200 μl lamininy na każde szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Inkubować roztwór lamininy na szkiełkach nakrywkowych przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odessać pozostały roztwór lamininy i raz spłukać szkiełka nakrywkowe ddH2O. Unikać skrobania powierzchni szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
</ol>
2. Zaawansowane przygotowanie rozwiązań do izolacji neuronów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Krebsa (w mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH2PO4, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 11 glukozy i 2,5 CaCl2). Umieść 13,79 g NaCl (FW 58,44), 0,686 g KCl (FW 74,55), 0,312 g NaH2PO4 (FW 120), 0,289 gMgSO4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO3 (FW 84,01), 3,96 g glukozy (FW 180,2) i 0,555 g CaCl2 (FW 111) w 2 L ddH20. Schłodzić do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę płuczącą (pożywka F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykiem/antybiotykiem/antybiotykiem): Do 500 ml butelki pożywki F12 dodaj 50 ml FBS i 5 ml Antybiotyku/Antybiotyku 100x Płynu (Gibco).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę neuronów jelitowych (pożywka neuropodstawowa A z B-27, 2 mM L-glutamina, 1% FBS, 10 ng / ml, neurotroficzny czynnik glejowy (GDNF) i antybiotyk/antybiotyk / antybiotyk 100x płyn). Aby przygotować bulion GDNF, dodaj 1 ml ddH2O do 10 μg GDNF i zamroź z powrotem w 50 μl porcji, przechowuj w temperaturze -80 °C. Aby uzyskać 50 ml fiolkę z kompletnymi pożywkami neuronowymi, połącz 47,5 ml pożywki Neurobasal A, 1 ml B-27 (50x), 500 μl FBS, 500 μl 200 mM L-glutaminy (Gibco), 50 μl bulionu GDNF i 500 μl antybiotyku/antybiotyku 100x płynu. Pożywki są produkowane w małych partiach po 50 ml, aby zapewnić świeżość GDNF i uniknąć zanieczyszczenia dużych ilości tej drogiej mieszaniny pożywek komórkowych.</li>
</ol>
3. Zbieranie preparatu do badania podłużnych mięśni/splotów mięśniowo-jelitowych (LMMP) od myszy
<ol>
	<li>Przed przeprowadzaniem doświadczeń na zwierzętach powinny istnieć odpowiednie krajowe i instytucjonalne zasady etyczne. Dorosłe szwajcarskie myszy Webster o wadze ponad 25 g (zwykle w wieku powyżej 8 tygodni) są trzymane w grupach po 6 sztuk przed eksperymentami. Tkanki od dwóch myszy są używane do izolacji neuronów jelitowych jelita krętego i gleju, a trzy myszy są używane do izolacji komórek okrężnicy.</li>
	<li>Przygotuj obszar operacyjny. Zbierz małe nożyczki chirurgiczne, kleszcze pod kątem, waciki, trzy szklane zlewki o pojemności 200 ml i szklany/plastikowy pręt (pędzel). Upewnij się, że wszystkie materiały są dokładnie umyte i wypłukane przed użyciem, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Ten krok można wykonać dzień przed eksperymentem.</li>
	<li>Umieść roztwór Krebsa na lodzie i bąbelkuj karbogenem (95% tlenu, 5% CO2) przez co najmniej 30 minut, aby ustabilizować pH.</li>
	<li>Włącz różne urządzenia i ciepłe chemikalia, aby ustabilizowały się w żądanych temperaturach; podgrzej łaźnię wodną do 37 °C, schłodzić wirówkę do 4 °C, umieść zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) i 0,5% trypsyny w łaźni wodnej (37 °C). Kompletne pożywki neuronowe i płuczkę należy przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Umieść 150 ml lodowatego Bąbelkowego Krebsa w trzech szklanych zlewkach o pojemności 200 ml oznaczonych jako "brudny", "czysty" i "LMMP". Zlewka bąbelkowa z napisem "LMMP" z karbogenem.</li>
	<li>Po uzyskaniu zgody komisji bioetycznej poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2</li>.
	<li>Umieść mysz w pozycji grzbietowej na powierzchni operacyjnej, oczyść skórę 70% EtOH i unieś skórę brzucha za pomocą kleszczy. Za pomocą nożyczek otwórz jamę brzuszną i odsłoń wewnętrzne narządy trawienne.</li>
	<li>Usuń długość przewodu pokarmowego, podnosząc odcinek jelita krętego i odsłaniając jego krezkę. Przetnij krezkę nożyczkami, aby delikatnie usunąć i rozplątać jelito kręte i okrężnicę, uważając, aby nie wyciągnąć krezki z jelita krętego / okrężnicy.</li>
	<li>Po rozplątaniu jelita grubego na całej długości usuń jelito kręte, przecinając jelito dystalnie do żołądka i proksymalnie do jelita ślepego. Uwaga: tę procedurę można również wykonać z tkanką okrężnicy, usuwając okrężnicę od dystalnej do jelita ślepego do bliższego odbytu.</li>
	<li>Tkanki można dalej podzielić na proksymalną i dystalną okrężnicę oraz jelito czcze i jelito kręte. Reszta tej procedury będzie odnosić się do izolacji jelita krętego; procedura jest taka sama dla izolacji okrężnicy LMMP. Umieść całe jelito kręte w szklanym pojemniku z lodowatym Krebsem oznaczonym jako "brudny".</li>
	<li>Stwórz narzędzie do czyszczenia jelita krętego; stęp dużą igłę o wadze 20 g za pomocą kamienia do pilnika i przymocuj ją do dużej strzykawki (10 ml) zawierającej lodowato zimnego Krebsa.</li>
	<li>Oczyść kał z jelita krętego, dzieląc jelito kręte na trzy lub więcej dużych kawałków. Wyjmij część jelita krętego ze zlewki i umieść igłę na końcu kawałka jelita krętego.</li>
	<li>Delikatnie przeprowadź Krebsa przez część jelitową, aż cały kał zostanie usunięty do oddzielnego pojemnika na odpady. Umieść oczyszczoną część w pojemniku Krebsa oznaczonym jako "czysty". Powtarzaj, aż całe jelito kręte zostanie oczyszczone.</li>
	<li>Aby usunąć LMMP, pokrój jelito kręte na małe segmenty, około 2 - 4 cm. Umieść segment jelita krętego na plastikowym lub szklanym pręcie; jelito kręte powinno ściśle przylegać, ale nie powinno być luźne ani napięte (~2 mm). Usuwanie LMMP należy rozpocząć od delikatnego usunięcia kawałków krezki nadal przyczepionych do przewodu pokarmowego (GI) za pomocą kleszczy. Zapobiegaj obracaniu się przewodu pokarmowego wokół pręta, delikatnie przypinając rurkę do pręta za pomocą kciuka.</li>
	<li>Oddziel LMMP od leżącego poniżej mięśnia okrężnego; najpierw delikatnie pocieraj krawędź kleszczy wzdłuż całej linii, do której przymocowana była krezka, od góry do dołu segmentu, delikatnie tworząc przerwę w mięśniu podłużnym. Następnie delikatnie zetrzyj mięsień podłużny za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego Krebsem.</li>
	<li>Zacznij od górnej części przerwy w mięśniu podłużnym i odgarniaj najlżejszym ruchem poziomym, wywierając bardzo lekki nacisk, aż mięsień podłużny zacznie oddzielać się od mięśnia okrężnego; zrób to wzdłuż całego paska wzdłuż punktu przyczepu krezki.</li>
	<li>Następnie delikatnie zacznij pracować wokół rurki przewodu pokarmowego, poruszając się od góry do dołu i z powrotem, gdy mięsień podłużny jest powoli oddzielany od mięśnia okrężnego wokół rurki. Po zakończeniu LMMP w naturalny sposób odpadnie z pozostałej części rurki przewodu pokarmowego.</li>
	<li>Powstały cienki pasek mięśnia podłużnego umieścić w zlewce oznaczonej "LMMP". Powtórz te czynności dla wszystkich segmentów.</li>
	<li>Po zebraniu wszystkich pasków LMMP z jednej myszy, powtórz procedurę dla wszystkich innych używanych myszy. Dokładnie wypłukać "brudne" i "czyste" zlewki przed ponownym użyciem.</li>
	<li>Wypłucz LMMP 3x, aby usunąć zanieczyszczenie biologiczne. Napełnij trzy probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml lodowatym Krebsem. Umieścić paski LMMP w pierwszej probówce i wirować przez 30 sekund w temperaturze 356 x g w wirówce schłodzonej do temperatury 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i przesunąć paski LMMP do następnej czystej probówki wypełnionej Krebsem. Powtórz tę procedurę dla każdej pozostałej rurki.</li>
</ol>
4. Skrót LMMP
<ol>
	<li>Przygotować roztwór trawiący, umieszczając 13 mg kolagenazy typu 2 i 3 mg masy ciała w 10 ml roztworu Krebsa z pęcherzykami karbogenu.</li>
	<li>Umieść segmenty opłukanego LMMP w roztworze wytrawiającym i użyj nożyczek, aby pokroić LMMP na drobne kawałki.</li>
	<li>Trawić LMMP przez 60 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z shakerem, delikatnie bąbelkując karbogenem.</li>
	<li>Po zakończeniu trawienia zebrać komórki przez wirowanie przez 8 minut przy 356 x g w wirówce schłodzonej do 4 ° C.</li>
	<li>Od tego momentu wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli komórkowych! Wszystkie odczynniki i pojemniki należy wysterylizować przed użyciem.</li>
	<li>Podczas wirowania przygotuj 0,05% roztwór trypsyny, umieszczając 1 ml podgrzanej 0,25% trypsyny i 4 ml podgrzanego HBSS w sterylnej probówce do hodowli komórkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć i wyrzucić supernatant. Nie używaj odkurzacza; To prawdopodobnie zassie osad komórkowy z powodu niskich prędkości wirowania. Ostrożnie usunąć osad komórkowy i umieścić go w czystej probówce z 5 ml 0,05% roztworu trypsyny.</li>
	<li>Trawić komórki w 0,05% roztworze trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wstrząsaniem przez 7 min. Nie należy przekraczać 7 minut całkowitego leczenia trypsyną, w przeciwnym razie neurony zginą.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 ml zimnego płynu do płukania po 7 minutach leczenia trypsyną.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 8 minut przy 356 x g. Wyjmij i wyrzuć nośniki.</li>
	<li>Podczas wirowania zrównoważyć fragment wysterylizowanej siatki Nitex na sterylnej probówce do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć i wyrzucić supernatant. Delikatnie ponownie zawiesić mieszaninę komórkową, rozcierając ją w 3 ml kompletnych pożywek neuronowych. Unikaj generowania pęcherzyków powietrza podczas tego etapu i wszystkich przyszłych etapów, w których mieszanina komórek jest rozcierana. Wszystkie tarcia powinny być wykonywane bardzo delikatnie. Przefiltruj roztwór komórkowy przez siatkę Nitex do czystej probówki do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Opcjonalnie: Zakręć probówkę do hodowli komórkowej i umieść w chłodzonym mikserze Hula (lub dowolnym mikserze, który zapewnia obrót) z delikatnym toczeniem i przechylaniem na 30 minut. Ten krok jest opcjonalny, ale zalecany.</li>
	<li>Opcjonalnie: Po mikserze Hula dodaj 2 ml zimnego płynu do płukania, aby umyć komórki.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (8 min, 356 x g). Usunąć i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce neuronowej o objętości 1,200 μl. Delikatnie rozcieraj komórki za pomocą plastikowej końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Nie wytwarzaj pęcherzyków powietrza. Pipetuj powoli i delikatnie, aż większość kawałków zostanie rozdrobniona, a komórki zawieszone w płynie.</li>
	<li>Dodać 750 μl kompletnej pożywki do każdej z 12 studzienek zawierających wstępnie powlekane szklane szkiełko nakrywkowe i dodać 100 μl roztworu rozcieranych komórek.</li>
	<li>Inkubować neurony w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj połowę nośnika komórkowego co 2 dni.</li>
	<li>Neurony są gotowe do zapisów elektrofizjologicznych po 1 - 2 dniach w hodowli.</li>
</ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%3A+A+second+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp.+Pract.+%28Minneap%29%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li>
<li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+lytic%2C+latent%2C+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies%2C+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li>
<li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li>
<li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li>
<li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li>
<li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li>
<li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251(2012).</li>
<li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li>
<li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li>
<li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities%3A+Introducing+the+neuro-gliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li>
<li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+genetics%2C+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li>
<li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Auton.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li>
<li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne główne konkurencyjne interesy.

Wykorzystane zwierzęta
Ten protokół został zoptymalizowany dla szwajcarskich myszy Webster. Jednak tę metodę można łatwo dostosować do innych małych ssaków, takich jak szczury i inne szczepy myszy. Z powodzeniem przeprowadziliśmy wstępne izolacje myszy C57 i nokautowanie receptora opioidowego μ. Jednak możliwe jest również, że inne szczepy myszy mogą być problematyczne ze względu na zmiany morfologiczne w przewodzie pokarmowym. Ponadto znane są różnice między szczepami myszy (C57Bl/6 vs. Balb/c) ...

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to rozległa sieć nerwów i glejów, która biegnie przez całą długość przewodu pokarmowego (GI). ENS funkcjonalnie kontroluje wszystkie aspekty trawienia, w tym perystaltykę jelit, wchłanianie/wydzielanie płynów, odczuwanie bodźców itp. Zawiera ponad 500 milionów neuronów, więcej niż znajduje się w rdzeniu kręgowym, i zawiera każdą klasę neuroprzekaźników znajdujących się w mózgu. Co więcej, ENS jest wyjątkowy, ponieważ może funkcjonować odruchowo bez udziału ośrodkowego układu nerwowego 2. Zrozumienie ENS jest kluczowe, nie tylko dla zrozumienia jego normalnej roli fizjologicznej, ale także dla zrozumienia jego udziału w różnych neuropatiach, które mogą być wrodzone (choroba Hirschsprunga), nabyte (Chagas), wtórne do stanów chorobowych (gastropareza cukrzycowa), wywołane lekami (zespół opioidowego jelita) lub spowodowane urazem (pooperacyjna niedrożność jelit) 1. Ponadto neurony jelitowe mogą być rezerwuarem infekcji wirusowych (ospy wietrznej i półpaśca)3. Ze względu na podobieństwa do mózgu i wysoki poziom serotoniny w jelitach, leki mające na celu leczenie wad ośrodkowego układu nerwowego często mają niepożądane skutki uboczne dla ENS 2. Warto również zauważyć, że wiele neuropatii, takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona, wykazuje podobne zmiany komórkowe w neuronach jelitowych na długo przed ich pojawieniem się w neuronach centralnych, co sprawia, że ENS jest dostępnym modelem do badania patogenezy tych chorób 4. Dlatego dokładne zrozumienie ENS jest niezbędne do zrozumienia stanów chorobowych i zapobiegania/przewidywania farmakologicznych skutków ubocznych.
Neurony ENS były tradycyjnie badane u świnki morskiej przy użyciu preparatów wholemount 5-7 lub hodowanych neuronów 8. Pomimo łatwości, z jaką można badać neurony u tego dużego zwierzęcia, model ten ma wiele ograniczeń, w tym brak genetycznie modyfikowanych szczepów, brak odczynników specyficznych dla tego gatunku oraz wysokie koszty związane z porządkowaniem i trzymaniem tych osób. Opracowanie modelu mysiego jelitowego układu nerwowego ma unikalną zaletę w postaci różnych systemów nokautujących, szerokiego wachlarza innych uznanych metodologii, które można stosować w połączeniu z techniką hodowli komórkowych, oraz możliwości zapewnienia walidacji dla modelu świnki morskiej.
ENS składa się z trzech splotów, które biegną wzdłuż przewodu pokarmowego: zewnętrznego splotu mięśniowo-jelitowego (między mięśniem podłużnym a okrężnym), który jest głównie odpowiedzialny za perystaltyczne działania jelit, a także splotu podśluzówkowego i śluzówkowego (znajdujących się odpowiednio pod i wewnątrz błony śluzowej), które w dużej mierze kontrolują wchłanianie/wydzielanie płynów i wykrywanie bodźców1 . Metoda ta rozpoczyna się od wyizolowania preparatu mięśnia podłużnego/splotu mięśniowo-jelitowego (LMMP) poprzez złuszczenie zewnętrznej warstwy mięśniowej przewodu pokarmowego. To radykalnie zmniejsza problemy z zanieczyszczeniem, które pojawiają się, gdy warstwa śluzówkowa jest zaangażowana w izolację. W rezultacie, proces ten jest idealny do badania neuronalnej kontroli ruchliwości, a nie działań wydzielniczych ENS.
Przedstawiona tutaj metoda prowadzi do powstania mieszanej kultury neuronów jelitowych i gleju. Na podstawie wcześniejszych obserwacji elektrofizjologicznych i immunocytochemicznych występują co najmniej dwa różne typy neuronów 9. Obecność gleju jest bardzo korzystna, ponieważ są one nie tylko ważnym typem komórek do samodzielnego badania, ale także przyczyniają się do przetrwania neuronów jelitowych 10 i utrzymują natywną ekspresję receptorów na powierzchni komórki neuronalnej 11. Ponadto niedobory gleju jelitowego mogą prowadzić do nieprawidłowych stanów chorobowych motoryki przewodu pokarmowego, określanych mianem "neuroglejopatii" 12. W związku z tym przedstawiona tutaj hodowla ENS daje kilka typów komórek, które są dojrzałe do badań.
Zaletami tej metodologii są łatwość izolacji, niedrogie wymagania dotyczące narzędzi oraz krótki czas na opanowanie techniki przez doświadczony personel laboratoryjny. Ograniczenia tej metodologii obejmują niską ogólną wydajność komórek wynikającą z dużej objętości tkanek oraz wykluczenie neuronów ENS ze splotów błony śluzowej i podśluzówkowej. Procedura ta będzie bardzo korzystna dla naukowców specjalizujących się w elektrofizjologii, immunohistochemii, PCR jednokomórkowym i innych metodologiach.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki</td></tr><tr><td>Fisherbrand Szkło nakrywkowe do szkieł nakrywkowych (średnica 12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Może przygotować w laboratorium&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml sterylna probówka wirówkowa</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>50 ml sterylnej probówki wirówkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 Media</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk 100x płyn</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A media</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik glejowy (GDNF)</td><td>Neuromika</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne z ostrymi końcówkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Może używać kleszczy</td></tr> do <tr><td>tkanek dowolnej</td> marki <td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>250 ml Szklana zlewka z podziałką</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>2 L Szklana kolba Erlenmyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Plastikowy pręt (pędzel dziecięcy)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka Leur-lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 cala. Igła podskórna</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej Amerykańska</td><td></td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2 ml Mikrowirówki Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 &micro; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Zestaw pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Kamień do ostrzenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Szafka bezpieczeństwa biologicznego (kaptur do hodowli komórkowych)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Może używać dowolnego Marka</td></tr><tr><td>10 L Kąpiel wodna z wytrząsaniem</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Mikrowirówka 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Może używać jednej większej wirówki z adapterami rozmiaru</td></tr><tr><td>Wirówka Allegra serii 6</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>HuluMixer Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z płaszczem wodnym AutoFlow</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr></tbody></table>

preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Jelitowy układ nerwowy to rozległa sieć neuronów i gleju biegnąca wzdłuż przewodu pokarmowego, która funkcjonalnie kontroluje motorykę przewodu pokarmowego. Opisano procedurę izolacji i hodowli mieszanej populacji neuronów i komórek glejowych ze splotu mięśniowo-jelitowego. Pierwotne kultury mogą być utrzymywane przez ponad 7 dni, z rozwijającymi się połączeniami między neuronami a glejem. Podłużny pasek mięśniowy z przyczepionym splotem mięśniowo-jelitowym jest usuwany z leżącego poniżej mięśnia okrężnego jelita krętego myszy lub okrężnicy i poddawany trawieniu enzymatycznym. W sterylnych warunkach izolowana populacja neuronów i komórek glejowych jest zachowywana w osadzie po odwirowaniu i posiewana na szkiełkach nakrywkowych. W ciągu 24-48 godzin następuje rozrost neurytów, a neurony można zidentyfikować za pomocą markerów panneuronalnych. Po dwóch dniach w hodowli izolowane neurony uwalniają potencjały czynnościowe, jak zaobserwowano w badaniach z klamrą łatową. Ponadto glej jelitowy można również zidentyfikować za pomocą barwienia GFAP. Sieć neuronów i gleju w bliskim sąsiedztwie tworzy się w ciągu 5 - 7 dni. Neurony jelitowe można badać indywidualnie i bezpośrednio za pomocą metod takich jak immunohistochemia, elektrofizjologia, obrazowanie wapnia i PCR jednokomórkowy. Co więcej, procedura ta może być wykonywana u zwierząt modyfikowanych genetycznie. Ta metodologia jest prosta do wykonania i niedroga. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ujawnia składniki jelitowego układu nerwowego w łatwy do manipulowania sposób, dzięki czemu możemy lepiej odkryć funkcjonalność ENS w stanach normalnych i chorobowych.

Bezpośrednio po izolacji komórek pochodzących z LMMP neurony i inne typy komórek nie będą łatwo dostrzegalne. Można zaobserwować żywe, okrągłe komórki o nieokreślonym fenotypie, a także detrytus tkankowy z niecałkowicie strawionych fragmentów tkanek i tkanki łącznej. Te zanieczyszczenia nie stanowią problemu i zostaną w większości usunięte podczas pierwszej wymiany pożywki za dwa dni. Nie należy próbować czyścić szkiełek przed tym terminem, ponieważ usunięte zostaną również zdrowe, żywotne komórki.
<p class="jove_con...

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie funkcjonalnie żywych neuronów oraz CLIA z splotu jamistego dorosłej myszy. Osiąga się to najpierw poprzez pokrycie sterylnej powierzchni do hodowli komórkowej polilizyną i lamininą. Drugim krokiem jest przygotowanie roztworów oraz pola operacyjnego do izolacji splotu jamistego.Następnie należy usunąć przewód pokarmowy i wyizolować odpowiedni odcinek w celu przygotowania preparatu splotu donesionego mięśni podłużnych (LMMP). Ostatnim krokiem jest sekwencyjne trawienie LMMP kolagenazą i trypsyną, a następnie wysianie komórek na uprzednio zakodowane powierzchnie do hodowli komórkowej. W dalszej kolejności do badania efektów działania neuronów jelitowych, gleju lub interakcji między tymi dwoma typami komórek można wykorzystać elektrofizjologię, immunocytochemię oraz PCR pojedynczych komórek.Procedurę zademonstruje dr Trisha Har Smith, pracownik podoktorski w laboratorium, a wspierać ją będzie Joy Gombe, doktorantka w laboratorium. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że neurony i glej pochodzą z dorosłej myszy. Pozwala to na uzyskanie w pełni funkcjonalnych neuronów i gleju, które potencjalnie mogą

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In-vitro przygotowanie izolowanych neuronów i glia jelitowych z pleksusu międzyprądkowego dorosłego myszy

Opisano alternatywną metodę izolacji embrionalnych motoneuronów mysich z rdzenia kręgowego. Metoda ta wykorzystuje fakt, że lektyna może wiązać się z niskopodobnym receptorem czynnika wzrostu nerwów p75NTR. To oparte na lektynach wstępne wysiewanie (preplating) pozwala na puryfikację podobną do tej uzyskiwanej za pomocą specyficznego przeciwciała przeciwko p75NTR.

Izolacja i hodowla embrionalnych motoneuronów myszy z wykorzystaniem lektyn

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek glejowych jelit od błony podśluzowej i blaszki właściwej jelita myszy. Przedstawiono w nim etapy ekstrakcji tkanki podśluzówkowej i blaszki właściwej, izolowania z nich komórek glejowych jelitowych i hodowli komórek na powlekanej płytce studzienkowej w celu ustanowienia hodowli komórek glejowych jelitowych.

Izolowanie komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej myszy

Neurony czuciowe mięśni są zaangażowane w sygnalizację proprioceptorową, a także informują o stanie metabolicznym i zdarzeniach związanych z urazami. Opisujemy preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badań nad mięśniami aferentnymi aktywowanymi rozciąganiem.

Preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badania właściwości wypalania aferentów mięśniowych

Ten film demonstruje protokół przeprowadzania jednowłóknistych zapisów elektrofizjologicznych na preparacie in vitro mysiego nerwu jelita grubego.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Tutaj opisujemy izolację komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej jelita za pomocą sekwencyjnych inkubacji EDTA do chelatowania kationów dwuwartościowych, a następnie inkubacji w nieenzymatycznym roztworze do odzyskiwania komórek. Posiewanie powstałej zawiesiny komórkowej na poli-D-lizynie i lamininie daje w wyniku wysoce wzbogaconą hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej dorosłej myszy

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Poznaj metodę izolacji neuronów i gleju z splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy. Ta technika umożliwia badanie funkcji komórek nerwowych układu pokarmowego in vitro.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów