Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie funkcjonalnie żywotnych neuronów i CLIA ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie sterylnej powierzchni hodowli komórkowej polilizyną i lamininą. Drugim krokiem jest przygotowanie roztworów i pola operacyjnego do izolacji splotu mięśniowo-jelitowego.

Następnie usuń przewód pokarmowy i wyizoluj żądany odcinek, aby utworzyć podłużny preparat splotu mięśniowo-jelitowego. Ostatnim krokiem jest sekwencyjne trawienie LMMP w kolagenazie i trypszynie, a następnie posiew komórek na wstępnie zakodowanych powierzchniach hodowli komórkowych. Ostatecznie elektrofizjologia, immunocytochemia i PCR pojedynczych komórek mogą być wykorzystane do badania wpływu neuronów jelitowych, gleju lub interakcji między tymi dwoma typami komórek.

Procedurę zademonstruje dr Trisha Har Smith, adiunkt we wszystkich laboratoriach, a asystować jej będzie Joy Gombe, doktorantka we wszystkich laboratoriach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami jest to, że neurony i komórki glejowe pochodzą od dorosłej myszy. Pozwala to na w pełni funkcjonalne neurony i komórki glejowe, które potencjalnie mogą pochodzić od genetycznie zmodyfikowanych zwierząt.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w właściwości elektryczne neuronów. Można go również zastosować do innych metodologii, takich jak chemia immunocytologiczna, PCR pojedynczych komórek i obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia uśpionej myszy w pozycji leżącej grzbietowej na powierzchni operacyjnej.

Następnie oczyść skórę brzucha 70% etanolem. Następnie podnieś go kleszczami i otwórz jamę brzuszną nożyczkami, aby odsłonić wewnętrzne narządy trawienne. Następnie podnieś odcinek jelita krętego, aby odsłonić mesentariusza.

Usuń przewód pokarmowy i przetnij krezkę nożyczkami. Następnie delikatnie usuń i rozplątaj jelito kręte i okrężnicę. Należy uważać, aby nie wyciągnąć krezki z jelita krętego i okrężnicy po rozplątaniu jelita grubego na całej długości.

Usuń jelito kręte, przecinając jelito dystalnie do żołądka i proksymalnie do jelita ślepego. Zabieg ten można również wykonać z tkanką okrężnicy, usuwając okrężnicę od dystalnej do jelita ślepego do bliższego odbytu. Następnie przekrój jelito kręte na trzy lub więcej dużych części.

Delikatnie wcierać roztwór kreb przez część jelitową, aż cały kał zostanie usunięty do oddzielnego pojemnika na odpady. Umieść czystą sekcję w pojemniku Krebsa oznaczonym jako czysty i powtarzaj procedury, aż całe jelito kręte zostanie oczyszczone. Aby usunąć LMMP, pokrój jelito kręte na małe segmenty o długości od dwóch do czterech centymetrów.

Następnie umieść segment jelita krętego na plastikowym lub szklanym pręcie. Jelito kręte powinno przylegać ciasno, ale nie luźno ani nie napięte. Zapobiegaj obracaniu się przewodu pokarmowego wokół pręta, delikatnie przypinając rurkę do pręta kciukiem.

Następnie delikatnie usuń kawałki krezki, które są nadal przyczepione do przewodu pokarmowego za pomocą kleszczy. Następnie oddziel LMMP od leżącego pod nim mięśnia okrężnego. Najpierw delikatnie pocierając krawędź kleszczy wzdłuż całej linii, do której przymocowana była krezka od góry do dołu segmentu.

Następnie delikatnie utwórz przerwę w mięśniu podłużnym. Następnie delikatnie oderwij mięsień podłużny za pomocą bawełnianego wacika połączonego z krebami, zaczynając od górnej części szczeliny, używając najlżejszego poziomego pociągnięcia, wywierając bardzo lekki nacisk, aż mięsień podłużny zacznie oddzielać się od mięśnia okrężnego. Zrób to wzdłuż całego paska wzdłuż punktu mocowania mesentary.

Następnie delikatnie obejdź rurkę przewodu pokarmowego, przesuwając się od góry do dołu i z powrotem. Ponieważ mięsień podłużny jest powoli oddzielany od mięśnia okrężnego dookoła rurki. Po zakończeniu LMMP w naturalny sposób odpadnie z pozostałej rurki przewodu pokarmowego.

Następnie umieść powstały cienki pasek mięśnia podłużnego w zlewce oznaczonej LMMP i powtórz procedury dla wszystkich segmentów w tej procedurze. Umieścić płukanie do segmentów LMMP w roztworze wytrawiającym. Następnie pokrój LMMP na drobne kawałki nożyczkami.

Następnie trawić je przez 60 minut. W kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaczem, delikatnie bąbelkując karbogenem. Po zakończeniu trawienia zebrać komórki przez odwirowanie przez osiem minut w temperaturze 356 g w wirówce, schłodzić do czterech stopni Celsjusza.

W międzyczasie przygotuj 0,05% roztwór trypsyny w kapturze do hodowli komórkowych, dodając jeden mililitr podgrzanej 0,25% trypsyny i cztery mililitry podgrzanej HBSS do sterylnej 50-mililitrowej probówki do hodowli komórkowej. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant, ostrożnie usuń osad komórkowy i umieść go w czystej probówce z pięcioma mililitrami 0,05% roztworu tryny. Następnie strawić komórki w 0,05% roztworze tryny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez siedem minut, zneutralizować próbę 10 mililitrami zimnego środka do płukania.

Po siedmiu minutach tripsin należy odwirować komórki przez osiem minut w temperaturze 356 g. W międzyczasie zrównoważ sekcję wysterylizowanej siatki TX na sterylnej 15-mililitrowej probówce do hodowli komórek. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant delikatnie zawiesić mieszaninę komórek, uruchamiając ją w trzech mililitrach.

Kompletne pożywki neuronowe. Wszystkie zmiany należy wykonywać bardzo delikatnie, aby uniknąć generowania pęcherzyków powietrza, należy przefiltrować roztwór komórkowy przez siatkę NYX do 15-mililitrowej probówki do czystej hodowli komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie przez osiem minut w temperaturze 356 g.

Następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w 1200 mikrolitrach kompletnego podłoża neuronowego. Następnie delikatnie przetrzyj komórki za pomocą jednomililitrowej plastikowej końcówki pipety.

Uważaj, aby nie wytwarzać pęcherzyków powietrza, pipetuj powoli i delikatnie, aż większość kawałków zostanie rozdrobniona, a komórki zawieszone w cieczy. Teraz dodaj 750 mikrolitrów kompletnej pożywki do każdej z 12 studzienek zawierających wstępnie zakodowane szklane szkiełko nakrywkowe. Następnie dodaj 100 mikrolitrów znamionowego roztworu komórkowego.

Inkubuj neurony w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% zmianą dwutlenku węgla. Połowa nośnika komórkowego co dwa dni. Neurony są gotowe do zapisów elektrofizjologicznych po jednym do dwóch dni w hodowli.

Przedstawiono tutaj charakterystykę immunohistochemiczną neuronów jelitowych. Lea odizolowana od myszy. Podłużna mikroskopia konfokalna mięśni ujawniła specyficzne dla neuronów barwienie rurkami beta trzy w całym przygotowaniu mięśni podłużnych Mount ileal od myszy.

Są to komórki wyizolowane z preparatów LMMP, które zawierają neurony, które wybarwiały się dodatnio pod kątem wiązania kal, a pokazane tutaj komórki glejowe Retin zostały uwidocznione za pomocą markera specyficznego dla gleju GFAP. Jednak nie zaobserwowano barwienia, gdy pominięto przeciwciało pierwszorzędowe. Oto neurony i komórki glejowe odizolowane od mięśnia podłużnego myszy rosnące w bliskiej odległości od siebie.

Obrazy z mikroskopii konfokalnej wskazują, że zielone neurony i czerwony ggl łatwo rosną obok siebie i wydają się oddziaływać na siebie in vitro. Rysunek ten przedstawia elektrofizjologię hodowanych neuronów jelitowych i CLIA w obecnym trybie zaciskowym. Wszystkie neurony wykazywały potencjały czynnościowe po wstrzyknięciu prądu.

CLIA nie mają potencjałów czynnościowych, ale wykazują duże potencjały elektrotoniczne w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu. Neurony wyhodowane z jelita krętego myszy są elektrofizjologicznie niejednorodną populacją. W obecnym trybie cęgowym wstrzyknięcie prądu o natężeniu 0,09 nanoampera do neuronów powoduje powstanie potencjałów czynnościowych.

Neurony HP ujemne natychmiast po stymulacji wracają do spoczynkowego potencjału błonowego. Podczas gdy neurony HP-dodatnie wykazują A, HP po stymulacji, w której spoczynkowy potencjał błonowy spada poniżej linii podstawowej, po czym powoli powraca do wartości początkowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby szkło i narzędzia chirurgiczne były jak najbardziej czyste. Delikatnie iteruj i bąbelkuj komórki i zmieniaj połowę pożywki do hodowli komórkowych co dwa dni po tej procedurze. Metody takie jak elektrofizjologia i chemia immunocytologiczna mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób kanały jonowe w jelitach reagują na leczenie farmakologiczne oraz dowiedzieć się o ekspresji białek w neuronach i lia oraz jak interakcja tych dwóch typów komórek jest zmieniana przez różne terapie po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania podstawowych funkcji neuropatii i neuropatii jelitowego układu nerwowego u zwierząt zmodyfikowanych genetycznie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować neurony i glej ze splotu TER jelitowego układu nerwowego dorosłej myszy.