Reakcje ligacji DNA

Ligację można zdefiniować jako akt łączenia, a w biologii termin ten odnosi się do reakcji enzymatycznej, która łączy dwie biomolekuły wiązaniem kowalencyjnym. Niniejsze wideo opisuje zastosowanie ligacji DNA w badaniach z zakresu biologii molekularnej.

W komórce ligazy DNA są enzymami, które identyfikują i uszczelniają przerwy w DNA, katalizując tworzenie wiązań fosfodiestrowych między grupami 3’-hydroksylowymi a 5’-fosforanowymi szkieletu DNA. Ligacja zachodzi w ramach normalnych procesów komórkowych, takich jak replikacja DNA, w celu naprawy pęknięć pojedynczej i podwójnej nici DNA.

W laboratorium ligazy DNA są rutynowo stosowane w klonowaniu molekularnym – procesie, w którym fragmenty DNA trawione endonukleazą, czyli inserty, łączy się z wektorem trawionym endonukleazą, takim jak plazmid, aby fragment mógł zostać wprowadzony do komórek gospodarza, a następnie zreplikowany.

Trawienie endonukleazą polega na wykorzystaniu endonukleaz restrykcyjnych, czyli enzymów restrykcyjnych, które tworzą nacięcia w specyficznych sekwencjach DNA.

Nacięcia te mogą przypominać pęknięcia pojedynczej nici, tworząc nawisy 3’ i 5’, nazywane lepkimi końcami, lub pęknięcia podwójnej nici bez nawisów, nazywane tępymi końcami. Ligacja lepkich końców jest korzystna, ponieważ komplementarne pary zasad w nawisach stabilizują reakcję. Ponieważ ligacje tępych końców nie posiadają komplementarnego parowania zasad, proces ten jest mniej wydajny, a enzymowi trudniej jest połączyć końce. W normalnych warunkach końce lepkie i tępe nie mogą zostać ze sobą zligowane.

Jednakże fragment Klenowa, produkt polimerazy DNA 1 trawionej subtilisyną, może przekształcić końce lepkie w tępe. Fragment Klenowa posiada aktywność egzonukleazy 3’ do 5’, która usuwa nawisy 3’, oraz aktywność polimerazy, która tępi nawisy 5’ poprzez wydłużanie końca 3’ nici komplementarnej.

Gdy celem jest wprowadzenie genu do plazmidu, ponowne zamknięcie DNA wektora, nazywane samoligacją, jest częstym niepożądanym wynikiem reakcji ligacji. Opracowanie DNA wektora fosfatazą alkaliczną po trawieniu usuwa grupy 5’-fosforanowe z obu końców i zapobiega temu niepożądanemu efektowi.

Jak wspomniano wcześniej, DNA wektora i insertu poddaje się trawieniu endonukleazami przed rozpoczęciem ligacji. Po oczyszczeniu trawionego wektora i insertu za pomocą elektroforezy żelowej, stężenia DNA mierzy się spektrofotometrem w celu określenia stężenia oczyszczonego wektora i insertu.

Na podstawie tego stężenia można określić liczbę cząsteczek insertu lub wektora w 1 µl, opierając się na średniej masie cząsteczkowej pary zasad DNA oraz liczbie par zasad w każdym fragmencie. W oparciu o obliczone stężenie molowe wektora i insertu wyznacza się stosunek insertu do wektora wynoszący 3:1, aby określić objętość wektora i insertu użytych w reakcji. Stosunek DNA insertu do wektora 3:1 jest pożądany, ponieważ zwiększa on prawdopodobieństwo ligacji insertu do wektora w porównaniu do samoligacji wektora.

Po określeniu ilości DNA wektora i insertu do użycia w reakcji, przystępujemy do przygotowania reakcji ligacji na lodzie. Kolejność dodawania składników reakcji do probówki do wirówki jest następująca: woda sterylna w ilości wystarczającej do uzyskania końcowej objętości 10 µl (w naszym przypadku użyjemy 4 µl), 1 µl 10X buforu do ligacji, 1 µl 10mM ATP, 1 µl wektora i 3 µl DNA insertu (zgodnie z obliczeniami), a na koniec 1 µl ligazy DNA. Reakcję należy dokładnie wymieszać, odwiryzować i inkubować w odpowiedniej temperaturze.

To, czy przeprowadzana jest ligacja końców lepki czy tępych, wpływa na temperaturę i czas trwania reakcji ligacji. Na przykład ligację końców lepkich z nawisem sześciu par zasad można przeprowadzić w temperaturze zbliżonej do temperatury pokojowej przez około 1 hr, ponieważ komplementarne końce stabilizują łączenie fragmentów. Ligacje z krótkimi nawisami lub ligacje końców tępych powinny być przeprowadzane w temperaturze 14-20˚C przez noc.

Po zapoznaniu się ze sposobem przygotowania reakcji ligacji, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom tej procedury.

Ligacje mogą być wykorzystywane do bezpośredniego wstawiania fragmentów amplifikowanych metodą PCR do zlinearyzowanych plazmidów. Przedstawiono tutaj badacza pobierającego próbkę zamrożonego mózgu myszy, izolującego z niej DNA genomiczne, a następnie poddającego je bisulfitowemu PCR, który jest metodą opartą na PCR służącą do wykrywania zmetylowanego DNA. Produkty PCR są następnie bezpośrednio ligowane do plazmidu w celu utworzenia biblioteki genów, które są zmetylowane w tym konkretnym obszarze mózgu.

Ligacje mogą być stosowane do przyłączania linkerów oligonukleotydowych, zawierających miejsca wiązania dla starterów PCR, w celu oczyszczania fragmentów DNA. Podczas pracy z próbkami nowotworowymi naukowcy mogą wykorzystać to podejście do sekwencjonowania genomicznego DNA nowotworu w nadziei na zidentyfikowanie mutacji wywołujących nowotwór.

W tym filmie ligacja jest przeprowadzana na DNA wyizolowanym z komórek utrwalonych formaldehydem, a następnie traktowanym enzymem restrykcyjnym i fragmentem Klenow w obecności biotyny, która służy później do wyodrębniania ligowanego DNA. DNA to jest następnie amplifikowane za pomocą PCR, a produkty sekwencjonowane w celu zidentyfikowania oddziaływań chromatyny w różnych skalach, jak pokazano na schemacie.

Zapoznali się Państwo z działaniem ligazy DNA, różnymi zasadami przygotowania ligacji w laboratorium, potencjalnymi problemami i sposobami ich rozwiązania oraz różnorodnymi zastosowaniami ligacji w badaniach nad biologią molekularną. Dziękujemy za uwagę.