Reakcje ligacji DNA

Podwiązanie można zdefiniować jako akt łączenia, aw biologii termin ten odnosi się do reakcji enzymatycznej, która łączy dwie biomolekuły wiązaniem kowalencyjnym. Ten film opisuje zastosowanie ligacji DNA w badaniach biologii molekularnej.

W komórce ligazy DNA są enzymami, które identyfikują i uszczelniają pęknięcia w DNA poprzez katalizowanie tworzenia wiązań fosfodiestrowych między grupami 3'-hydroksylowymi i 5'-fosforanowymi szkieletu DNA. Ligacja zachodzi w ramach normalnych procesów komórkowych, takich jak replikacja DNA, w celu naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowego DNA.

W laboratorium ligazy DNA są rutynowo stosowane w klonowaniu molekularnym - procesie, który łączy fragmenty DNA trawione przez endonukleazę lub inserty z wektorem trawionym przez endonukleazę, takim jak plazmid, dzięki czemu fragment może zostać wprowadzony do komórek gospodarza, a następnie zreplikowany.

Trawienie endonukleazy polega na użyciu endonukleaz restrykcyjnych lub enzymów restrykcyjnych, które tworzą nacięcia na określonych odcinkach DNA.

Te nacięcia mogą przypominać pęknięcia pojedynczej żyły, powodujące zwisy 3' i 5', zwane lepkimi końcami lub pęknięciami podwójnej żyły bez zwisów, zwane tępymi końcami. Podwiązywanie lepkich końcówek jest korzystne, ponieważ uzupełniające się zwisające pary zasad stabilizują reakcję. Ponieważ ligacje tępych końców nie mają żadnej komplementarnej pary zasad, ligacja jest mniej wydajna i trudniej enzymowi połączyć końce. Lepkie i tępe końce nie mogą, w normalnych warunkach, być podwiązane razem.

Jednak fragment Klenowa, produkt polimerazy DNA 1, strawiony subtylizyną może przekształcić lepkie końce w tępe końce. Klenow posiada aktywność egzonukleazy od 3 'do 5', która przeżuwa zwisy 3' i aktywność polimerazy, która stępia zwisy 5' poprzez wydłużenie końca 3' nici komplementarnej.

Gdy celem jest wstawienie genu do plazmidu, ponowne uszczelnienie DNA wektora, zwane samoligacją, jest częstym niepożądanym wynikiem reakcji ligacji. Leczenie fosfatazą alkaliczną DNA wektora po trawieniu usuwa 5'fosforany na obu końcach i zapobiega temu niepożądanemu wynikowi.

Jak wspomnieliśmy wcześniej, DNA wektora i insercji są trawione przez endonukleazy przed rozpoczęciem ligacji. Po oczyszczeniu żelem strawionego wektora i insertu, stężenia DNA mierzy się za pomocą spektrofotometru w celu określenia stężenia oczyszczonego wektora i insertu.

Na podstawie tego stężenia można określić liczbę cząsteczek wstawki lub wektora w 1 μl na podstawie średniej masy cząsteczkowej pary zasad DNA i liczby par zasad w każdym fragmencie. Na podstawie obliczonego stężenia molekularnego wektora i insertu oblicza się stosunek 3 do 1 insertu do wektora, aby określić objętość wektora i insertu użytego w reakcji. Ten stosunek 3 do 1 wstawki DNA do wektora jest pożądany, ponieważ zwiększa prawdopodobieństwo, że wstawka zostanie zligowana w wektor w porównaniu z samym ligacją wektora.

Teraz, gdy określiliśmy ilość wektora i wstawiliśmy DNA do użycia w reakcji, przystępujemy do przygotowania reakcji ligacji na lodzie. Kolejność dodawania, w jakiej składniki reakcyjne należy dodać do probówki do mikrofuge, jest następująca: sterylna woda wystarczająca do uzyskania 10 μl końcowej objętości, w naszym przypadku użyjemy 4 μl, 1 μl 10X buforu ligacyjnego, 1 μl 10 mM ATP, 1 μl wektora i 3 μl wstawki DNA, zgodnie z obliczeniami, a na końcu 1 μl ligazy DNA. Reakcję dokładnie miesza się, odwirowuje i inkubuje w odpowiedniej temperaturze.

To, czy wykonujesz podwiązanie lepkiego, czy tępego końca, wpływa na temperaturę i czas trwania reakcji podwiązania. Na przykład lepkie podwiązanie końców z wysięgiem sześciu par zasad można przeprowadzić w pobliżu temperatury pokojowej przez około 1 godzinę, ponieważ komplementarne końce stabilizują łączenie fragmentów. Podwiązania na krótkich wysięgach lub tępych końcach należy przeprowadzać w temperaturze 14-20°C przez noc.

Teraz, gdy nauczyliśmy się, jak ustawić reakcję podwiązania, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom tej procedury.

Ligacje mogą być stosowane do bezpośredniego wprowadzania fragmentów amplifikowanych PCR do zlinearyzowanych plazmidów. Na zdjęciu widzimy badacza pobierającego próbkę zamrożonego mózgu myszy, izolującego z niej genomowe DNA, a następnie poddanego działaniu wodorosiarczynu PCR, który jest metodą wykrywania metylowanego DNA opartą na PCR. Produkty PCR są następnie bezpośrednio ligowane do plazmidu w celu utworzenia biblioteki genów, które są metylowane w tym konkretnym regionie mózgu.

Ligacje mogą być używane do przyłączania łączników oligonukleotydowych, które zawierają miejsca wiązania starterów PCR, w celu oczyszczenia fragmentów DNA. Podczas pracy z próbkami guzów naukowcy mogą wykorzystać to podejście do sekwencjonowania genomowego DNA guza, z nadzieją na zidentyfikowanie mutacji powodujących nowotwór.

W tym filmie ligacja jest wykonywana na DNA wyizolowanym z komórek utrwalonych formaldehydem, a następnie traktowana enzymem restrykcyjnym i klenowem w obecności biotyny, która jest następnie wykorzystywana do ściągania ligowanego DNA. To DNA jest następnie amplifikowane za pomocą PCR, a produkty sekwencjonowane w celu identyfikacji interakcji chromatyny w różnych skalach, jak pokazano.

Dowiedziałeś się już o ligazie DNA, różnych zasadach związanych z ustawianiem ligacji w laboratorium, potencjalnych problemach i poprawkach oraz różnych zastosowaniach ligacji w badaniach biologii molekularnej. Dzięki za oglądanie.