Name: Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj protokół tomografii optycznej całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową przy użyciu konfokalnej mikroskopii arkuszowej światła. Ta metoda umożliwia szybkie obrazowanie całego mózgu w ciągu kilku dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania prowadzące do tych wyników otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umów o dotacje nr 228334 i 241526. Ten projekt badawczy został również wsparty grantem badawczym Human Frontier Science Program (RGP0027/2009) oraz przez włoskie Ministerstwo Edukacji, Szkolnictwa Wyższego i Badań w ramach flagowego projektu Nanomax oraz przez włoskie Ministerstwo Zdrowia w ramach "Zaproszenia do składania wniosków w zakresie komórek macierzystych". Badania te zostały przeprowadzone w ramach działalności badawczej fundacji ICON wspieranej przez "Ente Cassa di Risparmio di Firenze".

1. Przygotowanie i przechowywanie tkanek
<ol>
	<li>Utrwal mózg myszy za pomocą standardowej perfuzji przezsercowej13 za pomocą 20 ml 0,01 M roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie 100 ml paraformaldehydu 4% w 0,01 M PBS. Ostrożnie dostosować pH obu roztworów do 7,6: nieco niższe wartości pH mogą wygasić fluorescencję EGFP.</li>
	<li>Wycięte mózgi należy utrwalić przez noc w paraformaldehydzie 4% w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wypłukać dwa razy (po 30 minut) w 0,01 M PBS i przechowywać w 0,01 M PBS w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Odwodnienie i oczyszczenie
Uwaga: protokół odwodnienia i oczyszczania jest ściśle zgodny z tym opisanym przez Beckera i wsp.10
<ol>
	<li>W celu usunięcia nadtlenków z rozpuszczalnika odwadniającego (tetrahydrofuranu, THF), które silnie tłumią fluorescencję XFP, należy przefiltrować THF zasadowym aktywowanym tlenkiem glinu (stopień aktywności Brockman I, około 250 g/L THF) za pomocą kolumny chromatograficznej. Unikaj pękania kolumny, co zmniejszyłoby usuwanie nadtlenku.</li>
	<li>Dodać stabilizator (butylowany hydroksytoluen, 250 mg/l) do roztworu końcowego, nawet jeśli THF był już ustabilizowany przed filtracją. Stabilizator jest w rzeczywistości zatrzymywany przez tlenek glinu: THF bez stabilizatora może wytwarzać duże ilości nadtlenków i może być wybuchowy i niebezpieczny.</li>
	<li>Odwodnić cały mózg myszy w stopniowanej serii THF w czystej wodzie: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 godzina, a następnie 100% przez noc. Umieścić fiolkę z próbką na obracającym się kole. Aby uniknąć ekspozycji na światło, owinąć fiolki folią aluminiową.</li>
	<li>Przefiltrować rozpuszczalnik czyszczący (eter dibenzylowy, DBE) z tlenkiem glinu (aktywowana zasada, klasa aktywności Brockman I, około 250 g/l DBE) za pomocą lejka filtrującego.</li>
	<li>Oczyść próbkę w 100% DBE. Zmień roztwór po 3 i 6 godzinach.</li>
</ol>
3. Montaż próbki
<ol>
	<li>Kiedy mózg wydaje się przezroczysty na oko (zwykle 1 godzinę po drugiej zmianie DBE), zamontuj go na przechylonej płytce obrazowej za pomocą jednej z następujących metod:</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Montaż bezpośredni - Delikatnie zanurz próbkę na jednej z końcówek (Rysunek 3a).</li>
		<li>Krążek agarozowy - Zanurz krążek wykonany z 6% żelu agarozowego na końcówkach. Delikatnie przymocuj próbkę do krążka agarozy za pomocą kleju akrylowego (Rysunek 3b). Odczekaj około 1 minuty na utwardzenie.</li>
		<li>Zlewka agarozowa - Zanurz zlewkę wykonaną z 3% żelu agarozowego na końcach. Delikatnie umieścić próbkę na dnie zlewki (Rysunek 3c).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga 1: Montaż w zlewce agarozowej powinien być preferowany, gdy ważne jest obrazowanie próbki w całości; jednak żel agarozowy otaczający próbkę powoduje dodatkowe rozpraszanie światła, które może być szkodliwe dla jakości obrazu. Jeśli niewielka część próbki może zostać wykluczona z obrazowania, lepiej jest zamontować próbkę na krążku agarozy lub bezpośrednio na końcówce. Pierwsza metoda najlepiej nadaje się do utrzymania mózgu w pozycji poziomej (z wyłączeniem obrazowania brzusznej lub grzbietowej części mózgu), druga do utrzymania mózgu w pionie (z wyłączeniem obrazowania części opuszki węchowej lub rdzenia kręgowego).
Uwaga 2: żel agarozowy powinien być przygotowany w wodzie, a następnie odwodniony za pomocą THF (50% i 100% po 4 godziny) i oczyszczony w DBE 100% przez 4 godziny lub do momentu, gdy stanie się wyraźnie przezroczysty.
<ol start="3">
	<li>Po zamontowaniu próbki zgodnie z jedną z poprzednich metod, umieść płytkę obrazową w komorze próbki za pomocą pęsety. Napełnij komorę roztworem czyszczącym.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do tomografii
<ol>
	<li>Usuń szczelinę, aby zebrać jak najwięcej fluorescencji.</li>
	<li>Oświetl próbkę niską mocą lasera, aby zapobiec fotowybielaniu.</li>
	<li>Przesuń próbkę w trzech kierunkach za pomocą sterowanego programowo systemu mikropozycjonowania. Dla każdego kierunku należy określić minimalne i maksymalne współrzędne, dla których próbka jest oświetlona i znajduje się w polu widzenia kamery (rysunek 4a).</li>
	<li>Wstawić powyższe współrzędne jako parametry podprogramu "Tomografia wstępna". Należy również określić odległość między sąsiednimi kominami, które mają być używane w tomografii, oraz krok pobierania próbek przed tomografią w kierunku z.</li>
	<li>Uruchom tomografię wstępną, która zbiera obrazy w każdym stosie z próbkowaniem z określonym w (4.4).</li>
</ol>
Uwaga: Zebrane obrazy są wykorzystywane przez oprogramowanie do przygotowania przybliżonej mapy kształtu i pozycji próbki (Rysunek 4b), co pozwala ograniczyć akwizycję tomografii tylko do objętości faktycznie zajmowanej przez próbkę, skracając czas obrazowania, a tym samym fotowybielanie.
5. Akwizycja tomografii
<ol>
	<li>Przenieść próbkę na zewnątrz arkusza świetlnego za pomocą systemu mikropozycjonowania.</li>
	<li>Zwiększ moc lasera i zatrzymaj ruch wszystkich systemów skanujących, aby oświetlić tylko ustaloną linię w środku pola widzenia.</li>
	<li>Zamontuj szczelinę i wyrównaj ją za pomocą sygnału autofluorescencji z roztworu czyszczącego. Powinieneś wyraźnie widzieć linię szczeliny w środku pola widzenia.</li>
	<li>Ponownie aktywuj system skanowania, zmniejsz moc lasera i przenieś próbkę do wnętrza arkusza świetlnego za pomocą systemu mikropozycjonowania. Należy pamiętać, że moc lasera użytego ze szczeliną będzie wyższa niż ta użyta bez niej, ponieważ filtr przestrzenny blokuje niebagatelną część światła.</li>
	<li>Dostosuj amplitudę i przesunięcie systemów skanowania i deskanowania za pomocą oprogramowania sterującego, aż obrazy będą wyraźne i jasne.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji tomografii, po ustawieniu odpowiedniego kroku z dla eksperymentu. Wolumin zostanie zobrazowany w wielu równoległych, częściowo nakładających się stosach (Rysunek 5a), a obrazy zostaną zapisane w hierarchicznej strukturze folderów.</li>
</ol>
6. Łączenie i wizualizacja
<ol>
	<li>Uzupełnij uzyskaną objętość syntetycznymi czarnymi obrazami (tj. obrazami tego samego typu i wymiarami co pobrane, ale o zerowej intensywności) za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania (Rysunek 4c). Ten krok jest obowiązkowy, aby oprogramowanie do szycia poradziło sobie z pełną objętością sześcienną.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie Vaa3D (do pobrania za darmo ze strony <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a>) z zainstalowanymi wtyczkami TeraStitcher i TeraManager.</li>
	<li>Załaduj wtyczkę TeraStitcher. Wybierz katalog zawierający obrazowany wolumin, wskaż względne orientacje osi (w odniesieniu do układu współrzędnych prawoskrętnych odniesienia) i rozmiar woksela.</li>
	<li>Uruchom pierwszą część szwu. Oprogramowanie obliczy względne przemieszczenie między parami stosów i znajdzie ogólne optymalne rozmieszczenie dla wszystkich stosów razem (rysunek 5b).</li>
	<li>Zaznacz, aby zapisać zszyty wolumin w formacie pojedynczej rozdzielczości lub w formacie wielu rozdzielczości. Ten ostatni umożliwia wizualizację w wielu rozdzielczościach za pomocą wtyczki TeraManager. W obu przypadkach, jeśli obraz o wyższej rozdzielczości jest większy niż kilka gigabajtów, wybierz również tryb zapisywania wielu stosów i określ rozmiar poszczególnych stosów podrzędnych. Umożliwi to sprawny dostęp do przechowywanych danych.</li>
	<li>Uruchom drugą część szwu. Oprogramowanie scali wyrównane stosy i zapisze je w trybie jedno- lub wielostosowym (rysunki 5c i 5d). Na koniec zamknij wtyczkę TeraStitcher.</li>
	<li>Załaduj wtyczkę TeraManager. Wybierz folder z woluminem wielostosowym o wielu rozdzielczościach i wskaż rozmiar woksela oraz orientacje osi. Wolumin zostanie załadowany w minimalnej rozdzielczości.</li>
	<li>Aby powiększyć do wyższej rozdzielczości, wybierz punkt orientacyjny za pomocą trybu kliknięcia prawym przyciskiem myszy Vaa3D, a następnie powiększ za pomocą przewijania myszy. Alternatywnie możesz bezpośrednio wybrać ROI, aby powiększyć za pomocą kliknięcia prawym przyciskiem myszy lub określić współrzędne interesującego Cię woluminu.</li>
	<li>Aby powiększyć z powrotem do niższej rozdzielczości, po prostu użyj przewijania myszy.</li>
</ol>

<ol><li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+and+the+small%3A+challenges+of+imaging+the+brain%27s+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+light+sheet+microscopy%3A+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916(2012).</li>
<li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316(2012).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1(2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

CLSM w połączeniu z oczyszczaniem chemicznym stanowi potężne narzędzie do badania neuroanatomii całych mózgów myszy znakowanych sondami fluorescencyjnymi, białkami lub syntetycznymi barwnikami. Ponieważ światło emitowane poza płaszczyzną ogniskowej jest blokowane przez fizyczny filtr przestrzenny, obrazowanie o wysokim kontraście jest możliwe również w grubych próbkach, przy zachowaniu wysokiej liczby klatek na sekundę typowej dla architektury arkuszy świetlnych.
Główną kwestią, z którą należy się zmierzyć przy stosowaniu opisanych metod, jest maksymalizacja kontrastu. W rzeczywistości dostępny sygnał jest redukowany zarówno przez czynniki chemiczne, jak i optyczne. Z chemicznego punktu widzenia procedury oczyszczania oparte na rozpuszczalniku organicznym mogą wygaszać emisję z białek fluorescencyjnych i innych barwników fluorescencyjnych7. Filtracja rozpuszczalnika w celu usunięcia nadtlenków, zgodnie z opisem Beckera i wsp.10, pozwala na utrzymanie dobrego poziomu fluorescencji również w tkankach oczyszczonych rozpuszczalnikiem. Opublikowane metody oczyszczania na baziewody14 nie zmniejszają wydajności fluorescencji, ale skutkują gorszą przezroczystością w przypadku całych mysich mózgów, przynajmniej w przypadku liniowych technik optycznych.
Z drugiej strony, w chwili obecnej nie ma celów komercyjnych z dużą odległością roboczą skorygowaną o zastosowane rozwiązania czyszczące o wysokim współczynniku załamania światła (n ≈ 1,56). W związku z tym niedopasowanie współczynnika załamania światła między ośrodkiem, w którym zanurzona jest próbka, a projektem obiektywu, powoduje silne aberracje sferyczne. Oprócz zmniejszenia rozdzielczości mikroskopu, takie aberracje powodują spadek intensywności obrazu i kontrastu, ponieważ światło jest rozpraszane na szerszym obszarze. Możliwe obejście tego problemu obejmuje użycie optyki adaptatywnej15 i/lub statycznych korektorów asferycznych.
Każda poprawa kontrastu i intensywności obrazu ma również wpływ na szybkość obrazowania, ponieważ można wybrać krótszy czas integracji obrazu. W tej chwili CLSM może sobie pozwolić na prędkość obrazowania około 106 μm3/s, przy czasie naświetlania kamery 100 msek 9. Przy tej prędkości zobrazowanie całego mózgu myszy zajmuje od 1 do 3 dni, w zależności od wielkości próby. Chociaż nie obserwuje się znaczącego pogorszenia jakości obrazu podczas tak długiej sesji obrazowania, głównie z powodu nieodłącznie niskiego fotowybielania oświetlenia arkusza świetlnego6, długi czas potrzebny na zobrazowanie mózgu pojedynczej myszy może w praktyce zmniejszyć możliwość zastosowania CLSM. 10-krotny wzrost wydajności systemu, w połączeniu z wykorzystaniem szybkiej kamery do wykrywania, skróciłby czas obrazowania do kilku godzin, umożliwiając rutynowe korzystanie z opisanego protokołu.
Pomimo wszystkich wyżej wymienionych ograniczeń, obrazowanie CLSM w połączeniu z chemicznym oczyszczaniem tkanek pozwala zrekonstruować całe mózgi myszy z rozdzielczością w skali mikronowej w czasie krótszym niż tydzień. Inne metody optyczne do obrazowania całego mózgu zapewniają wyższą rozdzielczość niż CLSM, ale kosztem dłuższego czasu przygotowania i/lub obrazowania2-4 lub rzadkiego próbkowania z5.
Metody opisane w tym artykule mogą być stosowane w połączeniu z różnymi strategiami znakowania fluorescencyjnego: transgeniczne zwierzęta eksprymujące białka fluorescencyjne w wybranych podzbiorach neuronów, transfekcja wirusowa, iniekcja barwnika intrapażąższowego itp. W praktyce wszystkie strategie barwienia poprzedzające uśmiercenie zwierząt są zgodne z CLSM. W rzeczywistości do tej pory nie wykazano pośmiertnego znakowania fluorescencyjnego całych mózgów myszy; W każdym razie, jeśli taki rodzaj barwienia byłby możliwy w najbliższej przyszłości, liczba próbek, które można zrekonstruować za pomocą CLSM, stanie się znacznie większa, potencjalnie obejmując ludzką tkankę mózgową.
Podsumowując, konfokalna mikroskopia arkuszowa stosowana w połączeniu z oczyszczaniem tkanek i zarządzaniem danymi w wielu rozdzielczościach może pozwolić naukowcom na rekonstrukcję i analizę próbek makroskopowych z rozdzielczością w skali mikronowej, przy wysiłkach technologicznych, które są w zasięgu większości laboratoriów. Potencjalne zastosowania CLSM nie ograniczają się oczywiście do neurobiologii, ale obejmują wszystkie dziedziny badań, w których mikroskopia arkuszowa została już wykorzystana, jak embriogeneza16,17 i anatomia małych zwierząt18.

W porównaniu z naszym zrozumieniem molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw funkcjonowania mózgu, nasza wiedza na temat anatomii subtelnej wygląda na wciąż w powijakach1. W rzeczywistości wciąż brakuje nam kompleksowych map położenia somatów neuronalnych lub projekcji dalekiego zasięgu w całym mózgu. W rzeczywistości wiele wysiłków technologicznych poświęca się rekonstrukcji mózgu myszy z mikroskopijną rozdzielczością. Metody optyczne oparte na seryjnym cięciu próbek zatopionych w żywicy, takie jak mikroskopia skaningowa Knife-Edge (KESM)2, mikrooptyczna tomografia przekrojowa (MOST)3 i fluorescencyjna-MOST (fMOST)4, mogą zapewnić obrazowanie całych mózgów myszy w rozdzielczości trójwymiarowej w rozdzielczości submikronowej. Jednak całkowity czas potrzebny na przygotowanie i zobrazowanie pojedynczej próbki jest rzędu kilku tygodni, co ogranicza praktyczne zastosowanie takich metod. Inna technika oparta na szeregowym cięciu (ale bez zatapiania żywicy), seryjna tomografia dwufotonowa (STP)5, umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowej. Jednak technika ta została zademonstrowana na całych mózgach myszy tylko przy bardzo rzadkim pobieraniu próbek, zbierając 1 sekcję co 50 μm 5, a według naszej wiedzy STP nie wyprodukowano jeszcze pełnej rekonstrukcji mózgu myszy.
Najnowocześniejszą metodą optyczną do rekonstrukcji całych próbek w trzech wymiarach z dużą prędkością jest mikroskopia świetlna6. W tym schemacie optycznym próbka jest oświetlana cienkim arkuszem światła, a emisja fluorescencji jest zbierana wzdłuż osi prostopadłej do płaszczyzny oświetlenia. W ten sposób wzbudzane są tylko fluorofory ostrzone i możliwe jest uzyskanie przekroju optycznego w konfiguracji szerokiego pola, gwarantując wysoką liczbę klatek na sekundę. W połączeniu z protokołami oczyszczania opartymi na podstawieniu wody o współczynniku załamania światła pasującym do cieczy7, mikroskopia arkuszowa światła została zastosowana do próbek makroskopowych, takich jak całe mózgi myszy8. Jednak rozpraszanie światła wywołane przez próbkę, które wpływa nawet na oczyszczone próbki, degraduje arkusz świetlny, prowadząc do wzbudzenia nieostrych fluoroforów, co powoduje ogólne rozmycie uzyskanych obrazów.
Aby selektywnie zbierać tylko ostre fotony, niedawno połączyliśmy oświetlenie arkusza świetlnego ze schematem detekcji konfokalnej9. W konfokalnej mikroskopii arkuszowej (CLSM) nieostre i rozproszone fotony są odrzucane przez liniowy filtr przestrzenny (szczelinę) przed wykryciem (ryc. 1). Aby uzyskać działanie konfokalne w architekturze arkusza świetlnego, oświetlenie jest wytwarzane za pomocą linii skanującej, a system deskanowania w ścieżce detekcji tworzy statyczny obraz linii skanowania wzbudzenia w miejscu szczeliny. Trzeci system skanowania rekonstruuje dwuwymiarowy obraz na matrycy kamery. CLSM zapewnia 100% poprawę kontrastu w oczyszczonych mózgach myszy w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią świetlną, przy zachowaniu częstotliwości odświeżania 10 Hz. Dzięki CLSM możliwe jest zrekonstruowanie całych mózgów myszy z rozdzielczością 2 μm w XY i 9 μm w Z oraz z wystarczającym kontrastem, aby dostrzec pojedyncze neurony znakowane fluorescencyjnie.
W tym artykule opisujemy eksperymentalny proces rekonstrukcji mózgu myszy za pomocą CLSM. Mózgi myszy utrwalone aldehydami są odwadniane w stopniowanej serii tetrahydrofuranu bez nadtlenków, a następnie oczyszczane w wolnym od nadtlenku eterze dibenzylowym (ryc. 2), zgodnie z protokołem opracowanym przez Beckera i wsp.10 Oczyszczona próbka jest następnie ostrożnie umieszczana na płytki z końcówką i umieszczana w komorze obrazowania specjalnie zaprojektowanego konfokalnego mikroskopu z arkuszem światła. Próbkę można zamontować bezpośrednio, zanurzając ją na końcówce płytki (rysunek 3a); alternatywnie można go przykleić na krążku oczyszczonego żelu agarozowego (ryc. 3b) lub umieścić we wnęce zlewki wykonanej z oczyszczonego żelu agarozowego (ryc. 3c). Następnie wykonywana jest tomografia optyczna całego mózgu, ponieważ pobiera się wiele równoległych sąsiednich stosów, aby pokryć całą objętość mózgu (ryc. 4). Pobieranie próbek przed tomografią, które tworzy przybliżoną mapę położenia i kształtu próbki, gwarantuje, że obrazowanie jest wykonywane tylko w objętości zajmowanej przez próbkę. Stosy tomografii są następnie łączone ze sobą za pomocą specjalnego oprogramowania i zapisywane w hierarchicznym schemacie o wielu rozdzielczościach11. Mózgi myszy można w końcu zbadać za pomocą prototypowego oprogramowania do wizualizacji w wielu rozdzielczościach, podobnego do Google Maps. Oba te instrumenty programowe są zintegrowane jako wtyczki z platformą open source Vaa3D12.
W końcu pokazujemy reprezentatywne obrazy mózgów myszy, aby zademonstrować możliwości opisanego eksperymentalnego procesu badania anatomii drobnych myszy.

<table><tbody><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417_100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran bez nadtlenków</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowany tlenkiem glinu, zasadowy, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Eter dibenzylowy</td><td>Sigma-Aldrich 108014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butylowany hydroksytoluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W218405</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Typ III-A, Wysoki EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Klej akrylowy</td><td>Bostik</td><td>D2498</td><td></td></tr><tr><td>Vaa3D oprogramowanie</td><td>open source</td><td></td><td>do pobrania bezpłatnie z <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td></tr></tbody></table>

tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Zrozumienie architektury mózgu ssaków w rozdzielczości pojedynczej komórki jest jednym z kluczowych zagadnień neuronauki. Jednak mapowanie somy neuronalnej i projekcji w całym mózgu nadal stanowi wyzwanie dla technologii obrazowania i zarządzania danymi. Rzeczywiście, objętości makroskopowe muszą być rekonstruowane z wysoką rozdzielczością i kontrastem w rozsądnym czasie, tworząc zestawy danych w zakresie TeraByte. Niedawno zademonstrowaliśmy metodę optyczną (konfokalna mikroskopia arkuszowa światła, CLSM) zdolną do uzyskania rekonstrukcji w skali mikronowej całych mózgów myszy znakowanych wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP). Łącząc oświetlenie arkuszem światła i detekcję konfokalną, CLSM umożliwia głębokie obrazowanie wewnątrz makroskopowo oczyszczonych próbek z wysokim kontrastem i szybkością. W tym miejscu opisujemy kompletny proces eksperymentalny w celu uzyskania kompleksowych i czytelnych dla człowieka obrazów całych mózgów myszy znakowanych białkami fluorescencyjnymi. Opisano procedury czyszczenia i montażu, wraz z krokami do wykonania tomografii optycznej na całej objętości poprzez pozyskanie wielu równoległych sąsiednich stosów. Pokazaliśmy wykorzystanie niestandardowych narzędzi programowych typu open source, które umożliwiają łączenie wielu stosów i nawigację po danych w wielu rozdzielczościach. Na koniec zilustrowaliśmy kilka przykładów map mózgu: móżdżek transgenicznej myszy L7-GFP, w której wszystkie komórki Purkinjego są selektywnie znakowane, oraz cały mózg myszy thy1-GFP-M, charakteryzujący się losowym rzadkim znakowaniem neuronalnym.

Opisany protokół można wykorzystać do rekonstrukcji z rozdzielczością mikronową całych mózgów myszy lub ich wyciętych fragmentów, bez konieczności fizycznego sekcjonowania. Jako reprezentatywny wynik na Rysunku 6 przedstawiono cały móżdżek myszy L7-GFP (10. dzień po urodzeniu). U tego zwierzęcia wszystkie neurony Purkinjego są znakowane EGFP. Po powiększeniu widoczna jest typowa struktura lamelarna kory móżdżku (Rysunek 7). Dalsze powiększenie pozwala na wyraźne rozróżnienie ciała każdej komórki Purkinjego (Rysunek 8). Opisany protokół może zatem służyć do analizy przestrzennej organizacji neuronów w różnych badaniach nad rozwojem układu nerwowego.
Jako drugi reprezentatywny wynik przedstawiamy obrazy z nieprzeciętego mózgu dorosłej myszy thy1-GFP-M. U tego zwierzęcia transgenicznego EGFP jest ekspresyjne w losowym, rozproszonym podzbiorze neuronów. Prawa połowa mózgu została pokazana na Rysunku 9. Wraz z dalszym zwiększaniem powiększenia (Rysunki 10 oraz 11), wypustki neuronalne stają się rozróżnialne. Wynik ten demonstruje, że opisany protokół umożliwia obrazowanie z rozdzielczością mikronową w całych mózgach dorosłych myszy, co otwiera możliwość badania anatomii całego mózgu z rozdzielczością komórkową w mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.
<img alt="Schemat układu optycznego; widok z góry i z boku drogi światła dla wzbudzenia laserem 488 nm." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat optyczny konfokalnej mikroskopii arkusza światła (CLSM). (a) Widok z góry urządzenia, pokazujący drogę wzbudzenia. Emisja lasera z diodowo pompowanego lasera stałego (DPSS) 488 nm, po rozszerzeniu i kolimacji przez pierwszy teleskop, wpada do akustooptycznego filtra strojonego (AOTF), który reguluje intensywność wiązki. Następnie drugi teleskop dodatkowo rozszerza wiązkę. Lustro galwanometryczne skanuje wiązkę w pionie (wzdłuż osi y), która jest ogniskowana przez soczewkę wewnątrz komory z preparatem. (b) Widok z boku urządzenia, pokazujący drogę detekcji. Światło zbierane przez obiektyw detekcyjny jest odskanowywane w pionie przez lustro galwanometryczne i ogniskowane przez soczewkę, co tworzy stały obraz poruszającej się linii wzbudzenia. W pozycji stałego obrazu umieszczony jest liniowy filtr przestrzenny (szczelina). Za szczeliną lustro galwanometryczne umieszczone w systemie soczewek 4f rekonstruuje dwuwymiarowy obraz na matrycy urządzenia ładunkowo-sprzężonego z mnożeniem elektronów (EM-CCD). Filtr pasmowy fluorescencji usuwa całe rozproszone światło wzbudzenia przed detekcją. Reprezentatywne promienie światła wzbudzenia, detekcji oraz detekcji przefiltrowanej przez filtr pasmowy przedstawiono odpowiednio jako promienie niebieskie, jasnoniebieskie i zielone. Wskazano ogniskowe wszystkich soczewek faktycznie zastosowanych w mikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Schemat środków do przejaśniania tkanek naczyniowych; porównanie rozpuszczalników PBS, THF i DBE w układzie eksperymentalnym." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przejaśnianie preparatów. Utrwalone formaldehydem mózgi myszy, przechowywane w PBS 0.1 M w temperaturze 4 °C (a), są odwadniane w szeregu stężeń tetrahydrofuranu (THF, b), a następnie przejaśniane w 100% dibenzylu eterze (DBE, c). Etap odwadniania powoduje również pewien skurcz tkanki.
<img alt="Schemat procesu fiksacji mózgu z etapami: a) pozycjonowanie, b) stabilizacja, c) zamknięcie w środowisku." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Montaż preparatu do obrazowania CLSM. Oczyszczony mózg można umieścić bezpośrednio na nachylonej płytce montażowej (a), przykleić do oczyszczonego dysku agarowego (b) lub umieścić w oczyszczonym zlewce agarowym (c).
<img alt="Schemat procesu rekonstrukcji 3D; obejmuje osie wektorowe i segmentację wokseli do analizy." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Akwizycja tomograficzna. Procedura przedtomograficzna pobiera próbki z prostopadłościanu zawierającego mózg (a), aby określić liczbę i długość równoległych, sąsiadujących stosów niezbędnych do obrazowania całego preparatu (b). Po tomografii generowane są czarne obrazy w celu uzupełnienia wirtualnie pozyskanej objętości do kształtu prostopadłościanu (c).
<img alt="Schematy przestrzennego rozmieszczenia struktur 3D w obrębie prostopadłościanów, podkreślające zmienność skalowania." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Szycie wolumetryczne. Zebrane stosy obrazów częściowo na siebie nachodzą (a), co umożliwia ich precyzyjne wyrównanie za pomocą wtyczki TeraStitcher (b). Następnie wtyczka łączy wyrównane stosy w reprezentację wielorozdzielczą, albo w formie pojedynczego stosu (c), albo wielu stosów (d).
<img alt="Obraz mikroskopowy anatomii pierścienicy; badanie biologiczne struktury i funkcji mięśni." fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Cały móżdżek myszy P10 L7-GFP, w której wszystkie neurony Purkinjego są znakowane EGFP. Pasek skali, 1 mm.
<img alt="Obraz tkanki mózgowej z mikroskopu fluorescencyjnego, ilustrujący organizację komórkową." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Powiększenie fragmentu móżdżku przedstawionego na Rycini 6, ukazujące typową strukturę lamelarną kory móżdżku. Pasek skali, 500 μm.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek korzenia przedstawiający analizę struktury komórkowej i wzorca wzrostu." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Dalsze powiększenie fragmentu móżdżku przedstawionego na Rycini 6. Wyraźnie widoczne są somaty komórek Purkinjego. Pasek skali, 200 μm.
<img alt="Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego tkanki mózgowej przedstawiający rozkład białek, potencjał analizy spektralnej." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Prawa połowa mózgu dorosłej myszy thy1-GFP-M, charakteryzująca się rzadkim, nieswoistym znakowaniem neuronów EGFP. Pasek skali, 1 mm.
<img alt="Fluorescencja sieci neuronalnej, obraz mikroskopowy, wizualizacja szlaku nerwowego w tkance mózgowej." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Powiększenie fragmentu połowy mózgu przedstawionej na Rycini 9, ukazujące część hipokampa i kory. Pasek skali, 200 μm.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna sieci neuronalnej; obrazowanie neuronów, wizualizacja połączeń synaptycznych." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11. Dalsze powiększenie fragmentu połowy mózgu przedstawionej na Rycinie 9. Można wyraźnie rozróżnić kilka neurytów w korze. Pasek skali, 50 μm.

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rekonstrukcja i wizualizacja całego mózgu myszy z rozdzielczością w skali mikronowej. Osiąga się to poprzez uprzednie odwodnienie serii tetrahedron z utrwalonego mózgu myszy. Drugim krokiem jest przejrzystość próbki w eterze benzylowym.Następnie mózg jest obrazowany za pomocą konfokalnego mikroskopu z arkuszem światła. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie oprogramowania do wyrównania i zszycia uzyskanych stosów obrazów. Ostatecznie można użyć narzędzia do wizualizacji wielorozdzielczej, aby nawigować po zrekonstruowanej objętości obrazu.Główną zaletą tej techniki w stosunku do innych metod, takich jak mikroskopia konfokalna czy fotomikroskopia, jest możliwość obrazowania całej objętości mózgu myszy w zaledwie kilka dni. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak rozmieszczenie różnych typów neuronów w całym mózgu. Czy ta mapa dostarcza informacji o drobnej anatomii mózgu?Metodę tę można zastosować również w przypadku embrionów myszy lub muszek owocówek, co dowodzi, że procedura zostanie powtórzona. Student studiów magisterskich z mojego laboratorium. Aby rozpocząć ten protokół, należy przeprowadzić standardową fiksację mózgów myszy poprzez perfuzję przezsercową, a następnie utrwalać próbki przez noc przed przeprowadzeniem odwodnienia i klarowania.Ponieważ rozpuszczalnik odwadniający, THF, silnie gasi fluorescencję XFP, należy przeprowadzić filtrację w celu usunięcia nadtlenków za pomocą zasadowego aktywowanego tlenku glinu, wykorzystując kolumnę chromatograficzną; należy unikać pękania kolumny, co zmniejszyłoby skuteczność usuwania nadtlenków przed dodaniem stabilizatora do końcowego roztworu. Nawet jeśli THF był już stabilizowany przed filtracją, stabilizator zostanie zatrzymany przez tlenek glinu. Należy pamiętać, że THF bez stabilizatora może wytwarzać duże ilości nadtlenków, co może być wybuchowe i niebezpieczne.Następnie odwodnij cały mózg myszy w serii THF w czystej wodzie. Potem umieść fiolkę z próbką na obrotowym kole, aby uniknąć ekspozycji na światło. Owiń fiolkę folią aluminiową.Na koniec przefiltruj rozpuszczalnik rozjaśniający przez tlenek glinuu, używając lejka filtrującego. Następnie przeprowadź rozjaśnianie próbki w 100% DBE, wymieniając roztwór po trzech i sześciu godzinach, gdy mózg stanie się przezroczysty. Zazwyczaj jedną godzinę po drugiej wymianie DBE zamocuj próbkę na nachylonej płytce obrazowej jedną z metod przedstawionych w materiale.Montaż bezpośredni za pomocą dysku agros lub montaż za pomocą głośnika agro do montażu bezpośredniego; delikatnie zanurz próbkę na jednym z końców, aby użyć dysku agros do zanurzania. Dysk wykonany z 6% żelu agros na końcówkach. Następnie delikatnie przymocuj próbkę do dysku agros za pomocą kleju akrylowego i odczekaj około jednej minuty do utwardzenia w celu zamocowania.Używając zgłębnika z zlewki agros, nałóż zlewkę wykonaną z 3% żelu agros na końcówki. Następnie delikatnie umieść próbkę na dnie zlewki. Po zamocowaniu preparatu jedną z tych metod, umieść płytkę obrazującą w komorze z preparatem za pomocą pęsety.Następnie wypełnij komorę roztworem klarującym. Kolejnym krokiem jest przygotowanie do tomografii. Najpierw usuń szczelinę, aby zebrać jak najwięcej fluorescencji, a następnie oświetl próbkę laserem o niskiej mocy.Aby zapobiec fotoblakaniu, przesuń próbkę w trzech kierunkach (x, y i Z), korzystając z systemowego mikropozycjonowania sterowanego przez oprogramowanie. Dla każdego kierunku określ minimalne i maksymalne współrzędne, przy których próbka jest oświetlona, pozostając w polu widzenia kamery. Następnie wprowadź określone współrzędne jako parametry dla podprogramu przedtomograficznego.Należy również określić odległość między sąsiednimi stosami obrazów wykorzystywanymi w tomografii oraz krok próbkowania w kierunku Z podczas etapu przedtomografii. Następnie należy uruchomić przedtomografię, która zgromadzi obrazy w każdym stosie zgodnie z parametrami próbkowania Z określonymi w poprzednim kroku. Aby rozpocząć akwizycję, należy najpierw wysunąć próbkę poza obszar arkusza światła, korzystając z systemu mikro-pozycjonowania.Następnie zwiększ moc lasera i zatrzymaj ruch wszystkich systemów skanujących, aby oświetlić tylko stałą linię w centrum pola widzenia. Następnie zamontuj szczelinę i wyrównaj ją, korzystając z sygnału autofluorescencji roztworu do klarowania. Linia szczeliny powinna być teraz wyraźnie widoczna w centrum pola widzenia.Teraz należy ponownie aktywować system skanowania. Zmniejsz moc lasera i przesuń próbkę do wnętrza arkusza światła, korzystając z systemu mikropozycjonowania. Należy pamiętać, że moc lasera stosowana przy użyciu szczeliny będzie wyższa niż moc stosowana bez niej.Ponieważ filtr przestrzenny blokuje istotną część światła, należy dostosować amplitudę i przesunięcie (offset) systemów skanowania d oraz skanowania z za pomocą oprogramowania sterującego, aż obrazy staną się wyraźne i jasne. Następnie należy ustawić odpowiedni krok Z dla eksperymentu i uruchomić oprogramowanie do akwizycji tomograficznej. Objętość zostanie zobrazowana w wielu równoległych, częściowo nachodzących na siebie stosach, a obrazy zostaną zapisane w hierarchicznej strukturze folderów.Aby oprogramowanie do zszywania obrazów mogło pracować z pełną objętością sześcienną, należy uzupełnić pozyskaną objętość syntetycznymi czarnymi obrazami, czyli obrazami o tym samym typie i wymiarach co obrazy zebrane, ale o zerowej intensywności, przy użyciu zautomatyzowanego oprogramowania. Następnie należy uruchomić oprogramowanie VA A 3D z zainstalowanymi wtyczkami Terra, Stitcher oraz tarly i załadować wtyczkę Terra Stitcher. Należy wybrać katalog zawierający obrazowaną objętość oraz wskazać względną orientację osi względem prawoskrętnie zorientowanego układu współrzędnych odniesienia i rozmiar woksela.Teraz uruchom pierwszą część procesu składania (stitching). Oprogramowanie obliczy względne przesunięcie między parami stosów i znajdzie optymalne rozmieszczenie dla wszystkich stosów razem; wybierz opcję zapisu złożonej objętości w formacie pojedynczej lub wielorakiej rozdzielczości. Ta druga opcja umożliwia wizualizację wielorozdzielczą za pomocą wtyczki tarly.W obu przypadkach, jeśli obraz o wyższej rozdzielczości przekracza kilka gigabajtów, należy również wybrać tryb zapisu wielostosowego (multi-stack) i określić rozmiar poszczególnych podstosów. Umożliwi to efektywny dostęp do zapisanych danych. Teraz uruchom drugą część procesu składania obrazów (stitching).Oprogramowanie połączy wyrównane stosy i zapisze je w trybie pojedynczego lub wielu stosów. Po zakończeniu operacji zamknij wtyczkę Terra Stitcher. Następnie załaduj wtyczkę terra fly.Wybierz folder zawierający wolumen wielostosowy o wielu rozdzielczościach oraz określ rozmiar otworu (foxhole) i orientacje osi. Wolumen zostanie załadowany w minimalnej rozdzielczości. Aby przybliżyć obraz do wyższej rozdzielczości, użyj kółka myszy.Alternatywnie można dwukrotnie kliknąć w konkretny punkt obrazu, wybrać opcję powiększenia obszaru wokół istniejącego punktu orientacyjnego lub bezpośrednio określić współrzędne interesującej objętości. Aby powrócić do niższej rozdzielczości, wystarczy użyć kółka myszy. Opisany protokół może być wykorzystany do rekonstrukcji z rozdzielczością rzędu mikrometrów całych mózgów myszy lub ich wyciętych fragmentów bez konieczności fizycznego sekcjonowania.Jako reprezentatywny wynik przedstawiono tutaj cały móżdżek myszy L seven GFP w 10. dniu po urodzeniu. Wszystkie neurony Purkinjego są znakowane EGFP. Po powiększeniu widoczna jest typowa struktura blaszczasta kory móżdżku, a dalsze powiększenie pozwala na wyraźne rozróżnienie ciała każdej komórki Purkinjego.Opisany protokół może zatem zostać wykorzystany do badania przestrzennej organizacji neuronów w różnych badaniach nad rozwojem układu nerwowego. Jako drugi reprezentatywny wynik prezentujemy tutaj obrazy z przekroju mózgu dorosłej myszy GFPM. U tego zwierzęcia transgenicznego białko EGFP jest ekspresjonowane w losowej, rzadkiej podgrupie neuronów.Przedstawiona jest tutaj prawa połowa mózgu. Wraz z dalszym przybliżeniem widoczne stają się poszczególne wypustki neuronów. Wynik ten demonstruje, że opisany protokół umożliwia obrazowanie z rozdzielczością w skali mikronowej w całych mózgach dorosłych myszy, co otwiera możliwość badania anatomii całego mózgu w rozdzielczości komórkowej.W modelach mysich chorób neurodegeneracyjnych, po opanowaniu tej techniki, można ją przeprowadzić w ciągu trzech do czterech dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o właściwym filtrowaniu roztworu odwadniającego i czyszczącego, aby zachować fluorescencję GFP. Przedstawione tutaj narzędzie do wizualizacji wielorozdzielczej może być również wykorzystane do badania bardzo dużych zbiorów danych uzyskanych za pomocą innych technik, takich jak mikrooptystyczna tomografia sekcyjna.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak datować, barwić i utrwalać utrwalony mózg myszy. Należy przeprowadzić ich obrazowanie za pomocą konfokalnej mikroskopii arkuszowej oraz zwizualizować zrekonstruowaną objętość w VR 3D przy użyciu wtyczki Tely.

micron-scale-resolution-optical-tomography-entire-mouse-brains-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikronowskowa rozdzielczość tomografii optycznej całych mózgów myszy za pomocą konfokalnej mikroskopi wiązki świetlnej

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Źródło: Etienne, F.  i wsp. Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania przyciągania procesów mikroglejowych w kierunku wstrzykniętego związku w wycinkach mózgu. Zawiera przegląd przygotowywania wycinków mózgu myszy, wstrzykiwania związku testowego chemoatraktantu i obrazowania znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju w celu wizualizacji ich...

Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj protokół tomografii optycznej całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową przy użyciu konfokalnej mikroskopii arkuszowej światła. Ta metoda umożliwia szybkie obrazowanie całego mózgu w ciągu kilku dni.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Przeglądaj więcej filmów