Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła
8 października 2013
W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest rekonstrukcja i wizualizacja całego mózgu myszy z rozdzielczością w skali mikronowej. Osiąga się to poprzez uprzednie odwodnienie serii tetrahedron z utrwalonego mózgu myszy. Drugim krokiem jest przejrzystość próbki w eterze benzylowym.
Następnie mózg jest obrazowany za pomocą konfokalnego mikroskopu z arkuszem światła. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie oprogramowania do wyrównania i zszycia uzyskanych stosów obrazów. Ostatecznie można użyć narzędzia do wizualizacji wielorozdzielczej, aby nawigować po zrekonstruowanej objętości obrazu.
Główną zaletą tej techniki w stosunku do innych metod, takich jak mikroskopia konfokalna czy fotomikroskopia, jest możliwość obrazowania całej objętości mózgu myszy w zaledwie kilka dni. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak rozmieszczenie różnych typów neuronów w całym mózgu. Czy ta mapa dostarcza informacji o drobnej anatomii mózgu?
Metodę tę można zastosować również w przypadku embrionów myszy lub muszek owocówek, co dowodzi, że procedura zostanie powtórzona. Student studiów magisterskich z mojego laboratorium. Aby rozpocząć ten protokół, należy przeprowadzić standardową fiksację mózgów myszy poprzez perfuzję przezsercową, a następnie utrwalać próbki przez noc przed przeprowadzeniem odwodnienia i klarowania.
Ponieważ rozpuszczalnik odwadniający, THF, silnie gasi fluorescencję XFP, należy przeprowadzić filtrację w celu usunięcia nadtlenków za pomocą zasadowego aktywowanego tlenku glinu, wykorzystując kolumnę chromatograficzną; należy unikać pękania kolumny, co zmniejszyłoby skuteczność usuwania nadtlenków przed dodaniem stabilizatora do końcowego roztworu. Nawet jeśli THF był już stabilizowany przed filtracją, stabilizator zostanie zatrzymany przez tlenek glinu. Należy pamiętać, że THF bez stabilizatora może wytwarzać duże ilości nadtlenków, co może być wybuchowe i niebezpieczne.
Następnie odwodnij cały mózg myszy w serii THF w czystej wodzie. Potem umieść fiolkę z próbką na obrotowym kole, aby uniknąć ekspozycji na światło. Owiń fiolkę folią aluminiową.
Na koniec przefiltruj rozpuszczalnik rozjaśniający przez tlenek glinuu, używając lejka filtrującego. Następnie przeprowadź rozjaśnianie próbki w 100% DBE, wymieniając roztwór po trzech i sześciu godzinach, gdy mózg stanie się przezroczysty. Zazwyczaj jedną godzinę po drugiej wymianie DBE zamocuj próbkę na nachylonej płytce obrazowej jedną z metod przedstawionych w materiale.
Montaż bezpośredni za pomocą dysku agros lub montaż za pomocą głośnika agro do montażu bezpośredniego; delikatnie zanurz próbkę na jednym z końców, aby użyć dysku agros do zanurzania. Dysk wykonany z 6% żelu agros na końcówkach. Następnie delikatnie przymocuj próbkę do dysku agros za pomocą kleju akrylowego i odczekaj około jednej minuty do utwardzenia w celu zamocowania.
Używając zgłębnika z zlewki agros, nałóż zlewkę wykonaną z 3% żelu agros na końcówki. Następnie delikatnie umieść próbkę na dnie zlewki. Po zamocowaniu preparatu jedną z tych metod, umieść płytkę obrazującą w komorze z preparatem za pomocą pęsety.
Następnie wypełnij komorę roztworem klarującym. Kolejnym krokiem jest przygotowanie do tomografii. Najpierw usuń szczelinę, aby zebrać jak najwięcej fluorescencji, a następnie oświetl próbkę laserem o niskiej mocy.
Aby zapobiec fotoblakaniu, przesuń próbkę w trzech kierunkach (x, y i Z), korzystając z systemowego mikropozycjonowania sterowanego przez oprogramowanie. Dla każdego kierunku określ minimalne i maksymalne współrzędne, przy których próbka jest oświetlona, pozostając w polu widzenia kamery. Następnie wprowadź określone współrzędne jako parametry dla podprogramu przedtomograficznego.
Należy również określić odległość między sąsiednimi stosami obrazów wykorzystywanymi w tomografii oraz krok próbkowania w kierunku Z podczas etapu przedtomografii. Następnie należy uruchomić przedtomografię, która zgromadzi obrazy w każdym stosie zgodnie z parametrami próbkowania Z określonymi w poprzednim kroku. Aby rozpocząć akwizycję, należy najpierw wysunąć próbkę poza obszar arkusza światła, korzystając z systemu mikro-pozycjonowania.
Następnie zwiększ moc lasera i zatrzymaj ruch wszystkich systemów skanujących, aby oświetlić tylko stałą linię w centrum pola widzenia. Następnie zamontuj szczelinę i wyrównaj ją, korzystając z sygnału autofluorescencji roztworu do klarowania. Linia szczeliny powinna być teraz wyraźnie widoczna w centrum pola widzenia.
Teraz należy ponownie aktywować system skanowania. Zmniejsz moc lasera i przesuń próbkę do wnętrza arkusza światła, korzystając z systemu mikropozycjonowania. Należy pamiętać, że moc lasera stosowana przy użyciu szczeliny będzie wyższa niż moc stosowana bez niej.
Ponieważ filtr przestrzenny blokuje istotną część światła, należy dostosować amplitudę i przesunięcie (offset) systemów skanowania d oraz skanowania z za pomocą oprogramowania sterującego, aż obrazy staną się wyraźne i jasne. Następnie należy ustawić odpowiedni krok Z dla eksperymentu i uruchomić oprogramowanie do akwizycji tomograficznej. Objętość zostanie zobrazowana w wielu równoległych, częściowo nachodzących na siebie stosach, a obrazy zostaną zapisane w hierarchicznej strukturze folderów.
Aby oprogramowanie do zszywania obrazów mogło pracować z pełną objętością sześcienną, należy uzupełnić pozyskaną objętość syntetycznymi czarnymi obrazami, czyli obrazami o tym samym typie i wymiarach co obrazy zebrane, ale o zerowej intensywności, przy użyciu zautomatyzowanego oprogramowania. Następnie należy uruchomić oprogramowanie VA A 3D z zainstalowanymi wtyczkami Terra, Stitcher oraz tarly i załadować wtyczkę Terra Stitcher. Należy wybrać katalog zawierający obrazowaną objętość oraz wskazać względną orientację osi względem prawoskrętnie zorientowanego układu współrzędnych odniesienia i rozmiar woksela.
Teraz uruchom pierwszą część procesu składania (stitching). Oprogramowanie obliczy względne przesunięcie między parami stosów i znajdzie optymalne rozmieszczenie dla wszystkich stosów razem; wybierz opcję zapisu złożonej objętości w formacie pojedynczej lub wielorakiej rozdzielczości. Ta druga opcja umożliwia wizualizację wielorozdzielczą za pomocą wtyczki tarly.
W obu przypadkach, jeśli obraz o wyższej rozdzielczości przekracza kilka gigabajtów, należy również wybrać tryb zapisu wielostosowego (multi-stack) i określić rozmiar poszczególnych podstosów. Umożliwi to efektywny dostęp do zapisanych danych. Teraz uruchom drugą część procesu składania obrazów (stitching).
Oprogramowanie połączy wyrównane stosy i zapisze je w trybie pojedynczego lub wielu stosów. Po zakończeniu operacji zamknij wtyczkę Terra Stitcher. Następnie załaduj wtyczkę terra fly.
Wybierz folder zawierający wolumen wielostosowy o wielu rozdzielczościach oraz określ rozmiar otworu (foxhole) i orientacje osi. Wolumen zostanie załadowany w minimalnej rozdzielczości. Aby przybliżyć obraz do wyższej rozdzielczości, użyj kółka myszy.
Alternatywnie można dwukrotnie kliknąć w konkretny punkt obrazu, wybrać opcję powiększenia obszaru wokół istniejącego punktu orientacyjnego lub bezpośrednio określić współrzędne interesującej objętości. Aby powrócić do niższej rozdzielczości, wystarczy użyć kółka myszy. Opisany protokół może być wykorzystany do rekonstrukcji z rozdzielczością rzędu mikrometrów całych mózgów myszy lub ich wyciętych fragmentów bez konieczności fizycznego sekcjonowania.
Jako reprezentatywny wynik przedstawiono tutaj cały móżdżek myszy L seven GFP w 10. dniu po urodzeniu. Wszystkie neurony Purkinjego są znakowane EGFP. Po powiększeniu widoczna jest typowa struktura blaszczasta kory móżdżku, a dalsze powiększenie pozwala na wyraźne rozróżnienie ciała każdej komórki Purkinjego.
Opisany protokół może zatem zostać wykorzystany do badania przestrzennej organizacji neuronów w różnych badaniach nad rozwojem układu nerwowego. Jako drugi reprezentatywny wynik prezentujemy tutaj obrazy z przekroju mózgu dorosłej myszy GFPM. U tego zwierzęcia transgenicznego białko EGFP jest ekspresjonowane w losowej, rzadkiej podgrupie neuronów.
Przedstawiona jest tutaj prawa połowa mózgu. Wraz z dalszym przybliżeniem widoczne stają się poszczególne wypustki neuronów. Wynik ten demonstruje, że opisany protokół umożliwia obrazowanie z rozdzielczością w skali mikronowej w całych mózgach dorosłych myszy, co otwiera możliwość badania anatomii całego mózgu w rozdzielczości komórkowej.
W modelach mysich chorób neurodegeneracyjnych, po opanowaniu tej techniki, można ją przeprowadzić w ciągu trzech do czterech dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o właściwym filtrowaniu roztworu odwadniającego i czyszczącego, aby zachować fluorescencję GFP. Przedstawione tutaj narzędzie do wizualizacji wielorozdzielczej może być również wykorzystane do badania bardzo dużych zbiorów danych uzyskanych za pomocą innych technik, takich jak mikrooptystyczna tomografia sekcyjna.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak datować, barwić i utrwalać utrwalony mózg myszy. Należy przeprowadzić ich obrazowanie za pomocą konfokalnej mikroskopii arkuszowej oraz zwizualizować zrekonstruowaną objętość w VR 3D przy użyciu wtyczki Tely.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół rekonstrukcji precyzyjnej anatomii mózgu myszy z etykietą fluorescencyjną z wysoką rozdzielczością. Procedura obejmuje przygotowanie próbek, przejrzystość tkanek, obrazowanie oraz postprocesing danych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki obrazowania
- Anatomia mózgu
Wstęp
- Zrozumienie struktury mózgu ma kluczowe znaczenie dla badań z zakresu neuronauki.
- Labelkowanie fluorescencyjne umożliwia szczególną wizualizację anatomii mózgu.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości mogą ujawnić rozmieszczenie typów neuronów.
- Metodę tę można zastosować również do innych preparatów, takich jak zarodki myszy.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do obrazowania mózgów myszy w wysokiej rozdzielczości.
- Ułatwienie badania rozkładu neuronów w obrębie mózgu.
- Dostarczenie metody szybszej niż tradycyjne techniki obrazowania.
Zastosowane metody
- Odwadnianie utrwalonych mózgów myszy przy użyciu THF.
- Przejaśnianie próbek w eterze benzylowym w celu uzyskania przezroczystości.
- Obrazowanie za pomocą konfokalnego mikroskopu arkuszowego (light sheet).
- Szycie i wyrównywanie danych przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia obrazowanie całych mózgów myszy w ciągu kilku dni.
- Możliwa jest rekonstrukcja i wizualizacja obrazów o wysokiej rozdzielczości.
- Metoda ta pozwala na wgląd w szczegółową anatomię mózgu.
- Umożliwia ona badanie typów neuronów oraz ich rozmieszczenia.
Wnioski
- Ta technika obrazowania znacząco usprawnia badanie anatomii mózgu.
- Jest ona stosowalna w przypadku różnych preparatów biologicznych, nie tylko mózgów myszy.
- Protokół ten może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie całego mózgu o wysokiej rozdzielczości umożliwia walidację celów terapeutycznych orazB minimalizację ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w neurobiologii, dostarczając kontekstu przestrzennego w skali mikronowej dla fenotypów neuronalnych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad angażowaniem celu oraz mechanizmami działania na poziomie obwodów neuronalnych. Metoda ta przyspiesza charakterystykę modeli przedklinicznych oraz dopasowanie biomarkerów translacyjnych w rozwoju terapii chorób ośrodkowego układu nerwowego (CNS).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie całego mózgu w zakresie populacji neuronów znakowanych fluorescencyjnie.
- Wartość operacyjna: Pozwala na biologiczną redukcję ryzyka dzięki wizualizacji oddziaływania na cel oraz efektów poza-celowych w obrębie nienaruszonej architektury mózgu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu poprzez generowanie ilościowych danych przestrzennych dotyczących rozmieszczenia neuronów i modulacji szlaków.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych, oczyszczonych systemów biologicznych do zestandaryzowanych i powtarzalnych procesów przesiewania opartych na obrazowaniu.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie gotowości do przeprowadzania analiz dzięki obrazowaniu nienaruszonych próbek z wysokim kontrastem i rozdzielczością w skali mikronowej.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy dzięki narzędziom programistycznym open-source służącym do składania obrazów (stitching) oraz nawigacji wielorozdzielczej w zbiorach danych o skali terabajtowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy mapowanie neuronalne na etapie odkryć z walidacją przedkliniczną za pomocą modeli móżdżku i całego mózgu istotnych dla danej choroby.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez wizualizację fenotypów neurodegeneracyjnych w nienaruszonych mózgach dorosłych myszy z rozdzielczością komórkową.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia badanie przestrzennej organizacji neuronów w modelach rozwoju neurologicznego i chorób bez konieczności fizycznego sekcjonowania.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywczych – od testowania hipotez dotyczących celu, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając ilościowych danych neuroanatomicznych z rozdzielczością przestrzenną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez obrazowanie całego mózgu podzbiorów neuronów znakowanych EGFP w modelach transgenicznych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz i powtarzalność dzięki konfokalnemu obrazowaniu arkuszem światła (light sheet) przejrzystych preparatów przy minimalnym wybielaniu fluorescencyjnym.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki o wielu rozdzielczościach, umożliwiając porównanie rozkładu i morfologii neuronów w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez obrazowanie modeli istotnych dla chorób, takich jak myszy L7-GFP i thy1-GFP-M.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania obrazowania dzięki ustandaryzowanym potokom przejrzyszczania, montowania i programowego składania obrazów (stitching).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki obrazowaniu całej objętości mózgu z rozdzielczością w skali mikronowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki filtracji rozpuszczalników, protokołom klarowania oraz zautomatyzowanym procesom zszywania obrazów.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go poprzez ograniczanie późnych ryzyk biologicznych w programach dotyczących OUN dzięki wczesnej redukcji ryzyka fenotypowego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, umożliwiona przez mapowanie całego mózgu pod kątem typów neuronów i wzorców projekcji.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w zakresie przejaśniania tkanek, mikroskopii fluorescencyjnej oraz zarządzania trójwymiarowymi danymi obrazowymi.
- Zależność od systemów konfokalnej mikroskopii arkusza światła (light sheet microscopy) oraz komputerów o wysokiej wydajności w celu przetwarzania zbiorów danych o skali terabajtowej.
- Konieczność ustandaryzowania procedur odwodnienia, przejaśniania i montowania między zespołami w celu zachowania fluorescencji GFP.
- Wymaga rozważenia adaptacji w zależności od różnych znaczników fluorescencyjnych i rozpuszczalników do przejaśniania w różnych systemach modelowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak tworzenie się nadtlenków w THF, co wymaga filtracji w celu zapobiegania gaszeniu fluorescencji oraz uniknięcia zagrożeń bezpieczeństwa.
