Name: Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj technikę przeszczepu tkanki EAD w zarodkach Xenopus laevis do badania rozwoju twarzoczaszki. Ta metoda pozwala analizować interakcje sygnałowe i genetyczne w embriogenezie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Radkowi Sindelce za pomoc, oraz Cas Bresilla za pomoc w hodowli żab i przygotowaniu zarodków. Praca ta została sfinansowana przez NIH za pośrednictwem grantu R01DE021109 dla H.L.S. Laura Jacox została sfinansowana przez Herschel Smith Graduate Fellowship na Uniwersytecie Harvarda oraz indywidualne stypendium F30 F30DE022989-01 za pośrednictwem NIDCR.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>10x MBS: Przygotuj 1 l 10x zmodyfikowanego roztworu soli Bartha (MBS)17. Patrz Tabela 1, Odczynniki, składniki i instrukcje. Do wszystkich roztworów używaj wody destylowanej. Wymieszać w zlewce za pomocą mieszadła, aż do całkowitego rozpuszczenia. Wszystkie roztwory należy sporządzać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>1x MBS: Rozcieńczyć 100 ml 10x roztworu MBS w 900 ml wody destylowanej, aby uzyskać 1 l 1x MBS. Dodać 0,7 ml 1 M roztworu CaCl2</li>.
	<li>0,1 x MBS: Rozcieńczyć 1 x MBS, aby przygotować 1 l 0,5 x roztworu MBS i 2 l 0,1 x MBS roztworu. Do 1 l 0,1 x MBS roztworu dodać 1 ml roztworu gentamycyny o stężeniu 10 mg/ml. 0,1x roztwór MBS z gentamycyną będzie stosowany do długotrwałej hodowli zarodków.</li>
	<li>Ficoll/MBS: Dodać 15 gramów Ficoll 400 do 500 ml 0,5 x roztworu MBS. Mieszaj energicznie. Dodaj mieszadło i mieszaj, aż Ficoll całkowicie się rozpuści (kilka godzin).</li>
	<li>70% etanolu: Rozcieńczyć 100% etanolu do 70% etanolu za pomocą wody destylowanej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie narzędzi do obsługi szkła
<ol>
	<li>Przygotowanie igły: Załaduj rurkę kapilarną do ściągacza igieł.
	<ol>
		<li>Pociągnij igły zgodnie z ustawieniami pokazanymi w Tabeli 2: Ustawienia ściągacza igieł. Ustawienia dotyczą ściągacza do mikropipet P-80/PC firmy Sutter Instrument Co. Model P-80/PC i wężyków kapilarnych, zgodnie z opisem w tabeli określonych odczynników i sprzętu. Jednak te ustawienia są specyficzne dla ściągacza igłowego Sutter i będą musiały zostać dostosowane do innych maszyn. Ustawienia można określić za pomocą testu rampy, zgodnie z danymi producenta maszyny.</li>
		<li>Wyciągnij 4-6 igieł, przygotowując się do zabiegu. Igły należy złamać tak, aby elastyczna, przypominająca włosy część szklanej końcówki została całkowicie usunięta, co zwykle ma 2-3 mm długości. Końcówka musi być stosunkowo sztywna, ale wystarczająco wąska, aby można ją było używać jako narzędzia tnącego. Zobacz zdjęcie idealnej igły na rysunku 1A.</li>
		<li>Przechowuj igły na szalce Petriego z paskiem gliny pośrodku. Wciśnij trzon każdej igły w glinę, aby utrzymać ją na miejscu i utrzymać delikatną ostrą końcówkę z dala od dna i boków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać dodatkowe narzędzia, zaopatrz się w szkiełka nakrywkowe, parę długich kleszczyków o standardowym wzorze, palnik Bunsena i 3-4 szklane pipety Pasteura (rozmiar 5 3/4 cala).</li>
	<li>Narzędzie do pipet: Aby zrobić narzędzie do pipet, zapal palnik Bunsena i umieść końcówkę szklanej pipety Pasteura w niebieskiej części płomienia, obracając ją, tak aby końcówka stopiła się, a otwór całkowicie się uszczelnił, tworząc zamknięty, zaokrąglony koniec. Zaokrąglona, uszczelniona końcówka jest później wykorzystywana do wykonania wgłębień w glinianym naczyniu, w którym znajdują się zarodki podczas operacji. Zobacz rysunek 1B.</li>
	<li>Szklane mosty: Aby wykonać szklane mosty, użyj długich kleszczy o standardowym wzorze, aby ostrożnie odłamać kawałki szkła nakrywkowego o wymiarach 3 mm na 3 mm. Trzymając kawałek szkiełka nakrywkowego pęsetą, umieść szklankę w płomieniu, aż wszystkie cztery krawędzie zmiękną i zakrzywią się w dół, tworząc maleńką szklaną kopułę. Krawędzie nie powinny być już ostre. Zobacz rysunek 1C.</li>
	<li>Mostki poślizgowe szklanej pokrywy należy przechowywać, wkładając je krawędziami do dołu do modeliny, wyściełając dno szalki Petriego. Włóż mosty tak, aby górna część mostu pozostawała nad powierzchnią gliny. Nie naciskaj zbyt mocno, aby most się złamał, i nie osadzaj go całkowicie w glinie, ponieważ może być trudny do usunięcia. Po sterylizacji płomieniem lub 70% etanolem mostki mogą być ponownie wykorzystane z eksperymentu na eksperyment</li>.
</ol>
3. Przygotowanie do operacji zarodka
<ol>
	<li>Małą plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm wyłóż plasteliną. Pomiędzy użyciami naczynie i glinianą powierzchnię dokładnie myje się wodą destylowaną, a następnie 70% etanolem. 
	UWAGA: Użyj czerwonej, białej lub żółtej plasteliny Van Aken Plastalina, którą można kupić w lokalnym sklepie z zabawkami lub sztuką. glinka nie jest zalecana, ponieważ uwalnia osad.</li>
	<li>Napełnij naczynie 3% roztworem Ficoll 0,5x MBS. Wyższe stężenie soli zapobiega dysocjacji tkanek, a polisacharyd Ficoll pomaga zagęścić roztwór, co pomaga w utrzymaniu twarzy w odpowiedniej pozycji.</li>
	<li>Użyj flamastrowanego narzędzia do pipetowania Pasteura (patrz rysunek 1), aby wykonać płytkie, 2-3 mm wgłębienia w glinie, mniej więcej na głębokości ciała zarodka w stadium 20. Wykonaj 20-30 wgłębień w odległości 1-2 mm od siebie z każdej strony naczynia, tak aby było w sumie 40-60 wgłębień. Oznacz jedną stronę LOF/GOF, a drugą dziką czcionkę, rzeźbiąc inicjały w glinie za pomocą kleszczy.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zarodków przed operacją
<ol>
	<li>Uzyskanie i hodowla zarodków Xenopus laevis przy użyciu metod standardowych17. Szczegółowy opis hodowli żab można znaleźć w Sive et al.17
	<ol>
		<li>Czterdzieści osiem godzin przed eksperymentem należy pobrać jaja od samic żab i przeprowadzić zapłodnienie in vitro.</li>
		<li>Wstrzyknąć 0,5-1 ng mRNA GFP z osłoniętą błoną oraz dowolne pożądane mRNA lub oligonukleotydy antysensowne modyfikowane morfoliną ("morfolinos") na etapie jednej komórki lub do 2 komórek na etapie 2 komórek. Faza jednokomórkowa trwa około 70-90 minut. Wstrzyknąć całkowitą objętość 1-3 nl. Zamiast kodowania RNA białka fluorescencyjnego (takiego jak RNA GFP lub RFP), można wstrzyknąć morfolino znakowane FITC lub znakowany fluorescencyjnie dekstran. Fluorescencja jest ważna dla określenia, czy przeszczepiona tkanka goi się i pozostaje w głowie.</li>
		<li>Zamknięte mRNA można przygotować ze zlinearyzowanego plazmidu za pomocą zestawu mMessage mMachine SP6 lub T7. Morpholinos można zaprojektować i zamówić za pośrednictwem Gene Tools LLC. Ilość morfolinu wymagana do uzyskania pożądanego efektu musi być określona dla każdego genu18.</li>
		<li>Przechowywać wstrzyknięte zarodki w temperaturze 15 °C przez 48 godzin, aż osiągną stadium 19-20. (Dla wszystkich kolejnych etapów, zarodki są etapizowane zgodnie z tabelą normalnych Xenopus laevis autorstwa Nieuwkoopa i Fabera19.) 
		UWAGA: W dniu zabiegu zarówno zarodki biorcy, jak i dawcy muszą znajdować się w odległości jednego etapu od siebie, aby przeszczepy działały optymalnie. Jednak zarodki, którym wstrzyknięto morfoliny ("morfanty") czasami rozwijają się wolniej niż zarodki morfantów typu dzikiego lub kontrolnego, co sprawia, że konieczna jest koordynacja eksperymentów, tak aby zarówno zarodki morficzne, jak i zarodki typu dzikiego znajdowały się na tym samym etapie. Morfanty mogą wymagać utrzymywania w wyższej temperaturze przez 12-24 godziny przed zabiegiem. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że zarodki zostaną znalezione w pasujących stadiach, zarodki mogą być utrzymywane w różnych temperaturach. Na dwadzieścia cztery godziny przed eksperymentem należy podzielić zarodki na kilka szalek i umieścić morfanty w temperaturze 18-20 °C, a zarodki typu dzikiego w temperaturze 15-18 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu eksperymentu transplantacyjnego należy wyjąć zarodki z inkubatora w temperaturze 15 °C i przygotować je do etapu zgodnie z Nieuwkoopem i Faberem19. Jeśli są młodsze niż późna neurula (stadium 19), pozostaw je w temperaturze pokojowej na 1-2 godziny, aż osiągną stadium 19.</li>
	<li>Przebadaj wstrzyknięte zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Do eksperymentu wybierz zarodki, które wykazują jednolitą, jasną fluorescencję.</li>
	<li>Usuń bałagan i ewentualne zanieczyszczenia w pobliżu obszaru operacyjnego. Przetrzyj powierzchnię roboczą, mikroskop stereoskopowy i wszystkie narzędzia 70% etanolem.</li>
	<li>Gdy zarodki znajdą się w stadium 19, usuń błonę witeliny za pomocą kleszczy Dumonta #5/45 pod mikroskopem stereoskopowym.
	<ol>
		<li>Usuń błonę witeliny z 20-30 zarodków dawcy i gospodarza.</li>
		<li>W przypadku pierwszych kilku eksperymentów z przeszczepem twarzy należy ćwiczyć z kilkoma zarodkami dla każdego schorzenia. Metoda jest wymagająca i wymaga starannej praktyki, zanim będzie można ją zastosować na większą skalę, szybko i skutecznie. Można wykonać do 20 przeszczepów/eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś zarodki gospodarza do naczynia operacyjnego za pomocą plastikowej pipety z podziałką z końcówką odciętą tak, aby otwór był znacznie szerszy niż w przypadku zarodka (co najmniej kilka milimetrów). Uważaj, aby nie dotykać zarodków bąbelkami lub powierzchnią wody, ponieważ zarodki eksplodują pod napięciem powierzchniowym.</li>
	<li>Użyj kleszczy #5/45, aby wprowadzić zarodki do glinianych zagłębień, tak aby tył zarodka znajdował się w glinie. Delikatnie zamknij glinę wokół podstawy zarodka za pomocą kleszczy, pozostawiając górną ćwiartkę zarodka, głowę, wystającą z zagłębienia.</li>
	<li>Gdy wszystkie zarodki gospodarza zostaną zabezpieczone w swoich zagłębieniach, przejdź na drugą stronę płytki i zacznij wkładać zarodki dawcy do ich zagłębień. Powtórz proces zabezpieczania zarodków w ich studzienkach.</li>
</ol>
5. Przeprowadzanie operacji przeszczepu twarzy
<ol>
	<li>Nóż do cięcia: Jako nóż tnący do usuwania tkanki EAD dawcy należy użyć odpowiednio złamanej szklanej igły kapilarnej (patrz krok 2.3 i rysunek 1). 
	UWAGA: Kapilarę można trzymać bezpośrednio między palcami (sprawdza się to u osób o małych dłoniach) lub można zamontować igłę w uchwycie na szpilki przeciw owadom. Zamiast igły do rurki kapilarnej można użyć elektroostrzonych igieł wolframowych17 załadowanych do uchwytu na szpilki. Proszę zapoznać się z sugerowanymi uchwytami na szpilki i igły wolframowe w Tabeli Określonych Odczynników i Sprzętu.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym wbij igłę w głowę zarodka po lewej stronie gruczołu cementowego. Igła powinna być wprowadzona głęboko, tak aby przeszła z zewnątrz zarodka, przez głowę i do jelita przedniego. Aby przeszczepić cały EAD, nacięcia powinny rozciągać się od zewnątrz zarodka do jelita przedniego. W przypadku przeszczepów tylko ektodermy, cięcia powinny być płytsze i rozciągać się tylko przez ektodermę.
	<ol>
		<li>Przesuń igłę od lewej do prawej strony głowy, na całej szerokości dławika cementowego. Przesuwanie jest ważne, ponieważ ruch daje czyste cięcie. Patrz rysunek 2A, aby zapoznać się z podsumowaniem techniki, a rysunek 2B zawiera demonstrację cięć. Dławik cementowy i oczy są ważnymi punktami orientacyjnymi dla cięć. Kolejność cięć nie ma wpływu na wynik i może się różnić w zależności od preferencji użytkownika lub umiejętności ręcznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść igłę na początku poprzedniego cięcia, na lewej granicy dławika cementowego i przesuń igłę w górę, aż dotrze do dolnej części lewego oka. Spowoduje to utworzenie pionowego cięcia od lewej granicy dławika cementowego do dolnej części lewego oka.</li>
	<li>Umieść igłę na prawej granicy dławika cementowego i przesuwaj igłę w górę, aż dotrze do dolnej części prawego oka. Spowoduje to pionowe cięcie od prawej granicy dławika cementowego do dolnej części prawego oka.</li>
	<li>Aby całkowicie wyciąć tkankę, przesuń igłę od dołu lewego oka do dolnej części prawego oka, tworząc poziome cięcie, które uwolni tkankę. Cięcia mogą rozciągać się od zewnętrznej strony zarodka do jelita przedniego, w tym zarówno ektodermy, jak i endodermy w eksplantacie EAD. Alternatywnie, płytkie nacięcia mogą być stosowane do przeszczepów EAD tylko z ektodermą. Po usunięciu tkanki EAD powinien znajdować się prostokątny otwór z zewnątrz zarodka do jelita przedniego, rozciągający się od gruczołu cementowego do tuż pod oczami (od góry do dołu). Otwór powinien rozciągać się od wewnętrznej granicy lewego oka do wewnętrznej granicy prawego oka (z boku na bok). Zobacz rysunek 2Bb.</li>
	<li>Delikatnie wepchnąć wyciętą tkankę na końcówkę igły i przenieść ją przez bufor do części naczynia zawierającej zarodki gospodarza. Nie wystawiaj tkanki na działanie powietrza powierzchniowego, ponieważ ulegnie ona uszkodzeniu.</li>
	<li>Z zarodka gospodarza należy wyciąć tę samą tkankę, co w przypadku dawcy. Wyrzuć eksplant EAD gospodarza lub zachowaj go do włożenia do twarzy dawcy, w przypadku przeszczepów obustronnych.</li>
	<li>Włóż eksplant dawcy do powstałego otworu gospodarza za pomocą kleszczy #5/45.</li>
	<li>Po prawidłowym ułożeniu i całkowitym wprowadzeniu tkanki dawcy ostrożnie umieść szklany most (patrz Ryc. 1 i Ryc. 2Bc) na twarzy zarodka, aby utrzymać przeszczep na miejscu. Końce mostu powinny wsunąć się w glinę, przytrzymując ją na miejscu. Most powinien delikatnie wywierać nacisk na przeszczepioną tkankę, tak aby przeszczep leżał równo z głową gospodarza, bez wystawania z głowy lub leżenia głęboko w głowie. Głowa może być lekko spłaszczona przez szkiełko nakrywkowe, ale należy uważać, aby nie uszkodzić zarodka zbyt dużym naciskiem. Przeszczepy należy wykonać w ciągu 5 minut. 
	UWAGA: Doświadczony badacz może wykonać około dwudziestu przeszczepów na eksperyment, w ciągu 2-3 godzin. W tym okresie zarodki będą rozwijać się od stadium 20-22. Zakończenie przeszczepu twarzy na etapie 21 lub 22 nie wpływa na wyniki. Późniejsze przeszczepy (w stadiach 22-26) można wykonać, ale są one trudniejsze, ponieważ obszar linii środkowej EAD bez grzebienia jest zwężony, gdy grzebień nerwowy czaszki przesuwa się do twarzy. Spójność między przeszczepami ma kluczowe znaczenie.</li>
</ol>
6. Rekonwalescencja po przeszczepie twarzy
<ol>
	<li>Gojenie trwa zwykle 2-3 godziny. Pozostaw zarodki w temperaturze pokojowej w spokoju w ich glinianych zagłębieniach ze szklanymi mostkami utrzymującymi tkankę dawcy na miejscu.</li>
	<li>Po zagojeniu się przeszczepów ostrożnie usuń szklane mosty, usuń glinę z podstawy zarodków za pomocą kleszczy i użyj plastikowej pipety do transferu z podziałką, aby delikatnie odkurzyć zarodki z ich zagłębień.</li>
	<li>Umieść zarodki na odpowiednio oznakowanej szalce Petriego, wypełnionej do połowy czystym 0,1x MBS z gentamycyną.</li>
	<li>Hoduj zarodki w temperaturze 15 °C lub 18 °C przez kilka dni, aż osiągną fazę karmienia kijanki na etapie 40, kiedy można ocenić fenotypy twarzy.
	<ol>
		<li>Roztwór 0,1x MBS z gentamycyną powinien być zmieniany codziennie, a wszelkie martwe zarodki powinny być natychmiast usuwane, aby zapobiec zakażeniu i śmierci innych zarodków.</li>
		<li>Usta otwierają się na etapie 40. Na etapie 40-41 należy sprawdzić, czy przeszczepiona tkanka pozostaje zagojona na miejscu, oglądając jej fluorescencję. Zdarza się, że przeszczepy wypadają, dlatego należy upewnić się, że wszystkie nacięte zarodki mają na swoim miejscu tkankę dawcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGorlin%2C+RJ+%22Syndromes+of+the+head+and+neck%22">Syndromes of the head and neck</a>. , Oxford University Press. UK. (1990).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gen.+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus%3A+cement+gland%2C+primary+mouth+and+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li>
<li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+Biology%22">Developmental Biology</a>. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li>
<li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeogenetic+neural+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Homeogenetic neural induction in Xenopus.</a> Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).</li>
<li>Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triple+origin+of+skull+in+higher+vertebrates%3A+a+study+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras.</a> Dev. 117, 409-429 (1993).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+%3A+I%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+relationships+between+placodes%2C+facial+ectoderm%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds%3A+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li>
<li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li>
<li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis%3A+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li>
<li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%22">Early Development of Xenopus laevis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpholino+injection+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing. New York. (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki i ograniczenia: Zabieg przeszczepu twarzy EAD jest czasochłonny i pracochłonny. Wymaga praktyki, pewnych rąk i zręczności, aby się doskonalić. Protokół przeszczepu twarzy opiera się na zdolności badacza do skutecznego usuwania i przeszczepiania tkanki. Jeśli wprowadzenie przeszczepu do twarzy gospodarza zajmie zbyt dużo czasu, twarz gospodarza zacznie się kurczyć i goić. Kleszcze mogą być używane do delikatnego rozszerzania okolicy twarzy. Jeśli jednak doszło do znacznego skurczu rany, przeszczep n...

Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw wad wrodzonych twarzoczaszki1-2, należy zidentyfikować ważne tkanki i ich wkład sygnalizacyjny podczas rozwoju twarzoczaszki. U żaby Xenopus laevis część twarzy, w tym usta i nozdrza, tworzy się z "skrajnej domeny przedniej" (EAD), gdzie ektoderma i endoderma są bezpośrednio zestawione3-4. EAD działa również jako centrum sygnalizacyjne, wpływając na otaczające tkanki, w tym grzebień nerwowy czaszki, który tworzy szczęki i inne obszary twarzy5. Aby zidentyfikować geny, które przyczyniają się do funkcjonowania EAD, opracowano technikę "przeszczepu twarzy", w której tkanka jest przeszczepiana od dawcy do zarodka gospodarza, po usunięciu odpowiedniego regionu gospodarza. Po przeszczepie ocenia się wynikający z tego rozwój twarzy. W ten sposób skutki utraty funkcji (LOF) lub wzmocnienia funkcji (GOF) dla określonego genu w EAD są analizowane lokalnie, gdzie reszta głowy i ciała składa się z tkanki typu dzikiego. Przeszczep wzajemny można przeprowadzić, w którym tkanka typu dzikiego jest przeszczepiana do zarodków z globalnym LOF lub GOF w określonych genach. Transplantacja była często stosowana w badaniach nad preparatem Xenopus i pisklętami6. Na przykład przeszczep Xenopus dotyczył homogenetycznej indukcji neuronalnej, soczewki i kompetencji neuronalnej oraz migracji grzebienia nerwowego7-10. Chimeryczny przeszczep piskląt przepiórczych przeanalizował rozwój przedniej płytki nerwowej, przedniego grzbietu nerwowego, grzebienia nerwowego i kości czaszki11-14. Jest to pierwsza technika przeszczepu do badania rozwoju twarzoczaszki u Xenopus. Technika ta wykazała nową rolę inhibitorów Wnt Frzb1 i Crescent w regulacji tworzenia błony podstawnej w przypuszczalnym jamie ustnej5. Xenopus laevis jest idealnym modelem do badania rozwoju twarzoczaszki, ponieważ zarodki są duże, rozwijają się zewnętrznie, a twarz jest dobrze widoczna, co umożliwia mikromanipulację i obrazowanie rozwoju. Mechanizmy leżące u podstaw rozwoju twarzy wydają się zachowane, co wskazuje, że odkrycia dokonane u żaby dają wgląd w rozwój człowieka4,15-16.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>Szkło wapienne&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozmiar 5 3/4 cala</td><td>bawełniana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta z podziałką</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td>Jednorazowe&nbsp;</td></tr><tr><td>#5/45 kleszcze</td><td>Fine Science Tools firmy Dupont medical</td><td>11251-35</td><td>Kątowe 45&deg;</td></tr><tr><td>Kleszcze standardowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-20</td><td>Proste; końcówka ząbkowana; stal nierdzewna</td></tr><tr><td>Rurka kapilarna (do igieł)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Włókno</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 mm&nbsp; mikro szkło osłonowe;</td></tr>Ściągacz igieł <tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Ściągacz igieł <td>Sutter Instrument Co</td><td>: wycofany z produkcji Filament: FB300B</td><td>Najbardziej podobnym, obecnie dostępnym ściągaczem igieł jest P-97. W przypadku filamentów należy używać kwadratowych żarników Sutter 3,00 mm o szerokości 3,0 mm.</td></tr><tr><td>Model P-80</td><td>Płonący / brązowy ściągacz</td><td></td><td></td>do mikropipet</tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Oświetlenie firmy Fostec</td><td>Fostec</td><td></td><td>Użyj kasetonu świetlnego z 2 ramionami światłowodowymi.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt na szpilki</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Średnica otworu szczęk: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt na szpilki Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Średnica rozwarcia szczęk: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Igły wolframowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>0,125 mm Średnica pręta</td></tr><tr><td>Van Aken Plastalina</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr><tr><td>Modelina - biała, czerwona lub żółty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMashine SP6 lub T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table> żółty

przeszczepy twarzy w zarodkach xenopus laevis

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Wady wrodzone twarzoczaszki występują w 1 na 700 żywych urodzeń, ale etiologia jest rzadko znana ze względu na ograniczoną wiedzę na temat rozwoju twarzoczaszki. Aby określić, gdzie szlaki sygnałowe i tkanki działają podczas modelowania rozwijającej się twarzy, opracowano technikę "przeszczepu twarzy" w zarodkach żaby Xenopus laevis. Obszar przypuszczalnej tkanki twarzy ("Extreme Anterior Domain" (EAD)) jest usuwany z zarodka dawcy na etapie pąka ogonowego i przeszczepiany do zarodka gospodarza w tym samym stadium, z którego usunięto równoważny obszar. Można to wykorzystać do wygenerowania chimerycznej twarzy, w której tkanka gospodarza lub dawcy ma utratę lub zysk funkcji w genie i/lub zawiera etykietę linii. Po wygojeniu wynik rozwoju jest monitorowany i wskazuje role szlaku sygnałowego w obrębie dawcy lub otaczających tkanek gospodarza. Xenopus jest cennym modelem do rozwoju twarzy, ponieważ obszar twarzy jest duży i łatwo dostępny do mikromanipulacji. Wiele zarodków można oznaczyć w krótkim czasie, ponieważ rozwój następuje szybko. Odkrycia dotyczące żaby są istotne dla rozwoju człowieka, ponieważ procesy twarzoczaszki wydają się konserwatywne między Xenopus a ssakami.

Przeszczepiona tkanka powinna zostać w pełni wprowadzona do głowy biorcy po transplantacji, jak pokazano na Rysunku 3A, a na pysku embrionu powinien zostać odpowiednio umieszczony szklany mostek, jak pokazano na Rysunku 2Bc. Aby przeszczep zakończył się sukcesem, przeszczepiona tkanka dawcy musi mieć odpowiedni rozmiar dopasowany do otworu w organizmie biorcy. Tkanka EAD nie powinna w żaden sposób wystawać z głowy, co przedstawiono na Rysunkach 3B i 3C. ...

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Ogólnym celem tej procedury jest transplantacja tkanki twarzy z ekstremalnej domeny przedniej (EAD) pomiędzy zarodkami xenopus Levi. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie tkanki EAD z zarodków dawców i biorców o różnych podłożach genetycznych. Następnie eksplanty EAD z zarodków dawców są wszczepiane w obszar twarzy zarodków biorców.W ostatnim kroku przeszczepione embriony utrzymuje się przez 60 do 70 godzin po zapłodnieniu w celu obserwacji. Ostatecznie można wykorzystać mikroskopię w polu jasnym oraz mikroskopię fluorescencyjną do obserwacji zmian w rozwoju kraniofacjalnym przeszczepionych zwierząt. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju kraniofacjalnego, aby poprawić nasze zrozumienie wad kraniofacjalnych, takich jak nowe sygnały wymagane do rozwoju otworu gębowego wywodzące się z ekstremalnej domeny przedniej. Przed operacją należy załadować rurki kapilarne do wyciągarki do igieł, a następnie wyciągnąć od czterech do sześciu igieł, łamiąc każdą z nich w taki sposób, aby całkowicie usunąć elastyczną, przypominającą włos część szklanego końca o długości od dwóch do trzech milimetrów.Koniec musi być stosunkowo sztywny, ale wystarczająco

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Kapturki zwierzęce nadekspresujące produkty genów są transplantowane do boku rozwijających się embrionów Xenopus laevis w celu ustalenia, czy tkanka jest zdeterminowana.

Wyznaczanie rodzaju tkanki przy użyciu testu przeszczepu czapy zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis

Niniejszy protokół wideo prezentuje metodę generowania transgenicznych Xenopus laevis poprzez wprowadzanie transgenów do jąder plemników, a następnie transplantację jąder do niezapłodnionych komórek jajowych.

Produkcja transgenicznych Xenopus laevis poprzez integrację za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych i transplantację jąder

Chrząstki kraniofacjalne rozwijają się w bliskim kontakcie z innymi tkankami i są trudne do manipulacji u żywych zwierząt. Wykorzystujemy elektroporację do dostarczania narzędzi molekularnych podczas wzrostu szkieletu kraniofacjalnego, z pominięciem wczesnych efektów embrionalnych. Podejście to pozwoli nam na efektywne testowanie cząsteczek kandydackich in vivo.

Elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Opracowano metodę ilościowego określania wielkości i kształtu zarodków Xenopus laevis. W tym protokole tradycyjne pomiary wielkości są połączone z morfometrią geometryczną, aby umożliwić bardziej wyrafinowane analizy rozwoju i wad ustno-twarzowych.

Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Geny niezbędne do przetrwania stanowią techniczne przeszkody w tworzeniu linii mutantów. Skakanie pozwala uniknąć śmiertelności, łącząc edycję genomu z przeszczepem pierwotnych komórek rozrodczych w celu stworzenia zwierząt typu dzikiego z mutacjami linii zarodkowej. Leapfrogging pozwala również na efektywne generowanie homozygotycznych mutantów zerowych w pokoleniu F1. Tutaj pokazany jest etap przeszczepu.

Przeszczep pierwotnych komórek rozrodczych w celu przeskoku opartego na CRISPR/Cas9 w Xenopus

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.

Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Poznaj technikę przeszczepu tkanki EAD w zarodkach Xenopus laevis do badania rozwoju twarzoczaszki. Ta metoda pozwala analizować interakcje sygnałowe i genetyczne w embriogenezie.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów