Name: Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek transportu wirusa alfaopryszczki w pierwotnych kulturach neuronowych przy użyciu białek fuzyjnych fluorescencyjnych. Technika ta umożliwia wizualizację dynamicznych zdarzeń zakażenia w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.W.E. i R.K. są wspierane przez amerykańskie National Institutes of Health granty R37 NS033506-16 i R01 NS060699-03. M.P.T. był wspierany przez American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC). Porady i wiedza dr Matthew Lymana i dr Orena Kobilera odegrały kluczową rolę w projektowaniu konfiguracji mikroskopu i metod obrazowania żywych komórek. Podziękowania kierujemy również do Neala Barlowa i Briana T. Kaina z firmy Nikon Instruments za ich pomoc techniczną w zakupie, instalacji i eksploatacji mikroskopu.

Sekcja 1 - Warunki kontroli środowiska dla mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek
<ol>
	<li>30 minut przed jakimkolwiek eksperymentem obrazowym podłącz i rozpocznij podgrzewanie górnego inkubatora ze stopniem mikroskopu.
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop, przechodzące i epifluorescencyjne źródła światła oraz zautomatyzowane sterowanie sprzętowe. Otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem, NIS Elements, aby połączyć się z mikroskopem i rozpocząć chłodzenie kamery EM-CCD.</li>
		<li>Przymocuj podgrzewacz do soczewek do odpowiedniego obiektywu (60-krotne lub 100-krotne zanurzenie w olejku). nuta: Wybierz soczewkę obiektywu w zależności od typu eksperymentu. 100-krotny różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) jest najlepszy do śledzenia następczych transportujących zespoły wirionów, podczas gdy obiektyw 60-krotny jest odpowiedni do wizualizacji rozprzestrzeniania się następczego. Obiektywy zanurzeniowe o mniejszym powiększeniu bez oleju nie wymagają podgrzewacza do soczewek, ponieważ nie mają bezpośredniego kontaktu z próbką.</li>
		<li>Przymocuj inkubator górny stopnia do zmotoryzowanego stolika mikroskopu. Upewnij się, że odpowiednia wkładka, która utrzyma próbkę, jest na swoim miejscu. Podłącz przewód nawilżanego powietrza ze sterownika inkubatora do portu wejściowego w inkubatorze stage górny.</li>
		<li>Włącz elementy sterujące inkubatorem i podgrzewaczem obiektywu i dostosuj ustawienia temperatury do wcześniej zweryfikowanych warunków specyficznych dla obrazowanego obiektywu i próbki (patrz dyskusja).</li>
		<li>Otwórz zawór sterujący na zbiorniku atmosferycznym 5% CO2/95%, aby dostarczyć powietrze uzupełnione CO2 do inkubatora stage górny. Natężenie przepływu powinno wynosić od 60 do 80 ml gazu na minutę. Szybsze tempo spowoduje rozległe odwodnienie próbki pomimo komory nawilżającej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj olej do soczewek do soczewek obiektywowych i natychmiast umieść kulturę, która zostanie zobrazowana, w inkubatorze stage top.</li>
	<li>Pozwól na wyrównanie temperatury w kulturze przez co najmniej 10 minut. Preferowana jest jedna godzina, szczególnie w przypadku obrazowania nocnego opisanego w punkcie 3.</li>
</ol>
Sekcja 2 - Protokół obrazowania zdarzeń transportu następczego wirionu w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Sześć do ośmiu godzin przed obrazowaniem należy zainfekować 35-milimetrowe naczynie z dnem szkiełka nakrywkowego dojrzałych, zdysocjowanych neuronów SCG jednostkami tworzącymi 1 x 106 blaszek tworzących interesującego wirusa (patrz Tabela 1 dla przykładu wirusów) przy użyciu metody opisanej w Taylor et al. 2012a 11. W przypadku testowania więcej niż jednego wirusa, należy przesunąć inokulację o 30-60 minut, aby umożliwić obrazowanie sekwencyjnych próbek w podobnym czasie po zakażeniu.</li>
	<li>Włóż naczynie do inkubatora stage top na co najmniej 10 minut przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu. Podczas gdy temperatura się równoważy, płaszczyzna ogniskowej przesuwa się, co negatywnie wpływa na wszelkie eksperymenty obrazowe.</li>
	<li>Korzystając ze światła przechodzącego i okularu mikroskopu, znajdź ciało komórki neuronalnej, które ma wyraźnie izolowane przedłużenie aksonalne. Alternatywnie, użyj odpowiedniego oświetlenia fluorescencyjnego, aby znaleźć komórkę wyrażającą wykrywalne ilości białek fluorescencyjnych. Ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję próbki na oświetlenie fluorescencyjne, na tym etapie i kolejnych krokach, ze względu na uszkodzenie komórek wywołane światłem i bielenie białek fluorescencyjnych.</li>
	<li>Osłabij oświetlenie fluorescencyjne, aby zmniejszyć intensywność światła wzbudzającego, na które narażone są komórki. Włącz tłumiące światło filtry o neutralnej gęstości (ND) w ścieżce światła oświetlenia fluorescencyjnego. W przypadku filmów trwających dłużej niż 1 minutę należy użyć co najmniej ND4, aby zapobiec fotowybielaniu białek fluorescencyjnych i rozległym uszkodzeniom fotologicznym aksonów. Struktury o wysokiej fluorescencji można zazwyczaj wizualizować za pomocą założonego filtra ND8.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania mikroskopu (Rysunek 2 i film uzupełniający 1A) przełącz ścieżkę światła na kamerę EM-CCD.</li>
	<li>Określ optymalne czasy i warunki obrazowania dla każdego kanału fluorescencyjnego.
	<ol>
		<li>Uruchom okno obrazu na żywo za pomocą przycisku "Odtwórz".</li>
		<li>Określ optymalne ustawienia ekspozycji aparatu dla każdego białka fluorescencyjnego. Nie przekraczaj 300 ms na kanał, ponieważ wystąpią aberracje ruchowe szybko poruszających się struktur wirionowych. Wykorzystaj wzmocnienie EM kamery do ustawienia 300 (sugerowane przez producenta maksymalne wzmocnienie), aby zminimalizować czas ekspozycji i poprawić wykrywanie przyciemnionych sygnałów. Prawidłowe czasy naświetlania powinny dać obraz o niskiej intensywności tła i wysokich sygnałach specyficznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustawieniu ekspozycji i znalezieniu dobrze zdefiniowanego obszaru aksonu, oprogramowanie musi być skonfigurowane do wykonywania automatycznej akwizycji obrazu. Zatrzymaj okno obrazowania na żywo, aby zapobiec wybielaniu próbki.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu NIS Elements wybierz aplikację 6D - Define/Run Experiment z menu rozwijanego "Aplikacje".</li>
		<li>W oknie Akwizycja ND kliknij zakładkę Czas, która określi częstotliwość akwizycji obrazu. Ustaw interwał na "Bez opóźnienia", a czas trwania na 5 minut. Następnie oprogramowanie będzie rejestrować klatki obrazu z najwyższą możliwą częstotliwością przez czas trwania 5 minut.</li>
		<li>Wybierz zakładkę "Lambda", która umożliwia wybór wstępnie ustawionych konfiguracji sprzętowych używanych do wielokrotnej akwizycji obrazu fluorescencyjnego. Kliknij pierwsze pole, a następnie w kolejnym menu rozwijanym, aby wybrać odpowiednią konfigurację sprzętową. Powtórz tę czynność dla wszystkich białek fluorescencyjnych, które mają być zobrazowane.</li>
		<li>Upewnij się, że zakładki "Pozycje XY", "Seria Z" i "Duży obraz" są odznaczone.</li>
		<li>Nad zakładkami zaznacz pole "Zapisz do pliku", aby automatycznie zapisywać obrazy na dysku twardym podczas akwizycji. Skonfiguruj lokalizację i nazwę pliku wyjściowego eksperymentu. Podczas wykonywania eksperymentów sekwencyjnych oprogramowanie doda kolejny numer na końcu wyznaczonej nazwy pliku.</li>
		<li>Po wybraniu wszystkich zakładek. Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk "Uruchom teraz".</li>
		<li>Zoptymalizuj szybkość akwizycji obrazu za pomocą ustawień ekspozycji i rozmiaru obrazu. Użycie małego obszaru obrazu, z którego można uzyskać obraz, często przyspiesza szybkość pozyskiwania klatek. Zdefiniuj obszar zainteresowania za pomocą narzędzia ROI w NIS-Elements, wybierając obszar od 25% do 50% całkowitego obszaru obrazu. Alternatywnie, krótsze czasy naświetlania zwiększą szybkość akwizycji klatek, ale obniżą jakość sygnału (patrz dyskusja).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Sekcja 3 - Nocne obrazowanie poklatkowe zdarzeń rozprzestrzeniania się następcy
<ol>
	<li>Cztery godziny przed obrazowaniem należy zainfekować podzieloną na przedziały hodowlę neuronów zbudowaną na 35-milimetrowym naczyniu μ. Zaszczepić ciała komórek nerwowych jednostkami tworzącymi płytki 1 x 106 wirusa będącego przedmiotem zainteresowania (patrz tabela 1, na przykład wirusy) przy użyciu metody opisanej w Taylor et al. 2012b 12.</li>
	<li>Delikatnie umieść naczynie hodowlane w inkubatorze znajdującym się na górze sceny. Upewnij się, że pozycja obiektywu jest ustawiona z boku naczynia. Powoli ustawiaj ostrość obiektywu, upewniając się, że obiektyw nie wciska się w próbkę. Po zidentyfikowaniu pola ostrości powoli przesuń obiektyw na środek czaszy, w pobliżu wewnętrznej bariery wyznaczającej wewnętrzną stronę komory aksonu. Podczas ruchu upewnij się, że głębokość ostrości jest zachowana i unikaj wciskania się w próbkę. Ugięcie powierzchni tworzywa sztucznego przez obiektyw spowoduje uszkodzenie aksonów i tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Dodać około 2 ml ciepłej (~37 ° C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do naczynia hodowlanego poza pierścieniem teflonowym. Otacza on kulturę neuronalną pierścieniem PBS, aby zminimalizować odwodnienie próbki i zapewnić izolację termiczną.</li>
	<li>Odczekać, aby temperatura wyrównała się przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem automatycznej akwizycji obrazu (3.8). W tym czasie można skonfigurować kroki od 3.5 do 3.7.</li>
	<li>Ogranicz intensywność oświetlenia do najniższego możliwego poziomu, włączając wszystkie filtry o neutralnej gęstości. Umożliwi to częste pozyskiwanie obrazów przez długi czas bez nadmiernych uszkodzeń fotograficznych. Zmniejszenie oświetlenia spowoduje słaby sygnał, co będzie wymagało dłuższych ekspozycji (patrz dyskusja).</li>
	<li>Wykorzystać historyczne ustawienia narażenia lub przed przygotowaniem doświadczenia wygenerować równoległe naczynie z zakażonych komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję docelowych białek fluorescencyjnych w celu ustalenia ustawień ekspozycji opisanych w sekcji 2.5.</li>
	<li>Po ustawieniu ekspozycji dla niezbędnych kanałów przychodzi czas na skonfigurowanie oprogramowania do automatycznej akwizycji obrazu. Zatrzymaj okno obrazowania na żywo, aby ograniczyć wybielanie próbki.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu Elements (Rysunek 2 i film uzupełniający 2) wybierz aplikację 6D - Define/Run Experiment z menu rozwijanego "Aplikacje", aby wyświetlić okno ND Acquisition.</li>
		<li>W oknie ND Acquisition kliknij zakładkę Time. Ustaw Interwał na "5 min". Ustaw czas trwania na 20 godzin. Pole pętli zostanie automatycznie obliczone na liczbę powtórzeń, które wykona program.</li>
		<li>Wybierz zakładkę "Lambda". Kliknij pierwsze pole, a następnie w kolejnym menu rozwijanym wybierz odpowiednią konfigurację lambda dla Kontrastu fazowego. Powtórz dla kolejnych pozycji, wybierając odpowiednie konfiguracje dla każdego białka fluorescencyjnego, które ma być zobrazowane.</li>
		<li>Wybierz zakładkę "Duży obraz", która określa parametry wielu obrazów, które mają zostać połączone w jedno większe pole widzenia. Obszar o dobrej wielkości składa się z obrazów 5 x 2 z 7% nakładaniem się na siebie. Pozwoli to na zobrazowanie maksymalnej liczby komórek na pozycję bez wpływu na częstotliwość pozyskiwania obrazu. Usuń także zaznaczenie pola wyboru "Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu stołu montażowego". Ta opcja zwiększa szybkość akwizycji, nie zamykając migawki między obrazami.</li>
		<li>Wybierz zakładkę "Pozycje XY", aby zidentyfikować wiele pozycji, które będą sekwencyjnie obrazowane równolegle w trakcie trwania filmu w nocy. Zaznacz pozycje definiujące punkt środkowy dla każdego dużego obszaru obrazu. Wybierz od 6 do 8 pozycji obrazu w próbce. Dobry obszar obrazu będzie zawierał małe skupiska komórek w bliskim sąsiedztwie wyraźnie zdefiniowanych aksonów. Komórki nie powinny być ułożone jedna na drugiej, a wiązanie aksonów powinno być zminimalizowane. Punktem skupienia jest jądro komórki. Ustaw obiektyw w taki sposób, aby dla większości komórek widoczna była wyraźnie zdefiniowana otoczka jądrowa.</li>
		<li>Upewnij się, że karta "Seria Z" nie jest zaznaczona.</li>
		<li>Skonfiguruj funkcję automatycznego zapisywania zgodnie z powyższym opisem w sekcji 2.6.5.</li>
		<li>Przetestuj ustawienia ekspozycji i pozycji, klikając "1 pętla czasowa". Oceń wynikowe obrazy pod kątem oświetlenia światłem przechodzącym, ostrości i kadrowania. Jeśli ostrość uległa przesunięciu, zresetuj ostrość dla każdej pozycji na karcie X-Y. Odczekaj 10 minut i powtarzaj ten krok, aż ostrość się ustabilizuje.</li>
		<li>Po zweryfikowaniu i przetestowaniu wszystkich ustawień rozpocznij automatyczny eksperyment, klikając przycisk "Uruchom teraz".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Sekcja 4 - Przetwarzanie i eksport obrazów
Eksport danych
<ol>
	<li>Zestawy danych uzyskane podczas obrazowania na żywo komórek zdarzeń transportu lub rozprzestrzeniania się powinny zostać wyeksportowane z oprogramowania NIS Elements do powszechnie używanych typów plików w celu późniejszego wykorzystania w prezentacjach i publikacjach (film uzupełniający 3). Aby wyeksportować filmy, otwórz odpowiedni plik RAW .nd2 w NIS Elements i wybierz widok "podzielonego komponentu", aby wyświetlić żądane kanały fluorescencyjne. Odtwarzanie pliku z odpowiednią prędkością; 5 klatek na sekundę to dobry punkt wyjścia do wizualizacji szybkiego transportu.</li>
	<li>Dołącz sygnaturę czasową reprezentującą zegar czasu rzeczywistego podczas odtwarzania filmu. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Dodaj informacje o ND. W lewym górnym rogu pojawi się licznik cyfrowy.
	<ol>
		<li>Edytuj sygnaturę czasową, aby wyświetlić informacje. Kliknij prawym przyciskiem myszy licznik i wybierz Edytuj informacje ND. W kolejnym oknie podręcznym edytuj tekst, aby odzwierciedlić ważne parametry obrazowania. Edytuj czcionkę, kolor i rozmiar, aby uzyskać przejrzystość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do menu "Edycja" i znajdź "Utwórz migawkę widoku" lub naciśnij "x". To polecenie otwiera okno "wyświetl migawkę". Wybierz opcję "Zastosuj do wszystkich klatek", aby wygenerować 8-bitowy plik RGB gotowy do eksportu, zawierający kanały fluorescencyjne z całego filmu.</li>
	<li>Zapisz jako plik .avi, aby zapewnić zgodność między platformami. Ustaw szybkość odtwarzania na 200 ms na klatkę. Pliki .avi wygenerowane przez NIS Elements mogą być następnie dalej kompresowane za pomocą innego oprogramowania do konwersji do żądanego typu pliku.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. C., Baines, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+remodel+host+membranes+for+virus+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses remodel host membranes for virus egress.</a> Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).</li>
<li>Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesvirus+assembly%3A+a+tale+of+two+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpesvirus assembly: a tale of two membranes.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).</li>
<li>Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+accumulation%2C+envelopment%2C+and+exit+in+growth+cones+and+varicosities+in+mid-distal+regions+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).</li>
<li>Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+Simplex+Virus+Capsids+Are+Transported+in+Neuronal+Axons+without+an+Envelope+Containing+the+Viral+Glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).</li>
<li>Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+gE%2FgI+and+US9+proteins+promote+transport+of+both+capsids+and+virion+glycoproteins+in+neuronal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons.</a> Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).</li>
<li>Tomishima, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li>
<li>Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+case%3A+Married+versus+Separate+models+of+alphaherpes+virus+anterograde+transport+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons.</a> Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).</li>
<li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+herpesvirus+trafficking+in+neurons%3A+membrane+acquisition+directs+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).</li>
<li>Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+a+fluorescent+tegument+component+in+single+pseudorabies+virus+virions+and+enveloped+axonal+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies.</a> Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).</li>
<li>Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+an+alphaherpesvirus+membrane+protein+that+is+essential+for+anterograde+axonal+spread+of+infection+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons.</a> mBio. 3 (2), (2012).</li>
<li>Taylor, M. P., Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphaherpesvirus+axon-to-cell+spread+involves+limited+virion+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li>
<li>Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesvirus+replication+compartments+originate+with+single+incoming+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes.</a> mBio. 2 (6), (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).</li>
<li>Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmented+neuron+cultures+for+directional+infection+by+alpha+herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).</li>
<li>Zareen, N., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+culturing+sympathetic+neurons+from+rat+superior+cervical+ganglia+%28SCG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG).</a> J. Vis. Exp. (23), e988(2009).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-Cell+Spread+of+Pseudorabies+Virus+in+a+Compartmented+Neuronal+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System.</a> Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).</li>
<li>Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+compartmented+cultures+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).</li>
<li>Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+Mediates+Axonal+Sorting+and+Directional+Transport+of+Alphaherpesvirus+Particles+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons.</a> Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast-axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466(2001).</li>
<li>Kramer, T., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphaherpesvirus+Infection+Disrupts+Mitochondrial+Transport+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).</li>
<li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).</li>
<li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+Hippocampal+Neurons+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Celem obrazowania żywych komórek jest obserwacja procesów biologicznych zachodzących bez znaczących zmian w akcie obserwacji. Cel ten osiąga się poprzez optymalizację trzech zmiennych: kontroli środowiska, szybkości obrazowania i oświetlenia fluorescencyjnego. Te współzależne zmienne muszą być zrównoważone, aby osiągnąć realne warunki obrazowania. Przedstawione protokoły wykorzystują określone warunki w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Pokrótce omówimy kontrolę środowiska i szkody obserwacyjne, zanim szczegółowo...

Zakażenie obwodowego układu nerwowego (PNS) wirusami alfaopryszczki, takimi jak wirus opryszczki pospolitej (HSV) -1, -2 i wirus rzekomej wścieklizny (PRV) obejmuje kilka skomplikowanych i wysoce regulowanych etapów w całym cyklu życia wirusa. Transport PNS w obrębie neuronów ma kluczowe znaczenie zarówno podczas pierwotnej infekcji wirusowej, jak i późniejszego rozprzestrzeniania się między gospodarzami. Mechanizmy molekularne, które modulują dwa składniki cyklu życiowego wirusa; Ukierunkowany transport zespołów wirusa z dala od ciał komórkowych w aksonach (transport następczy) i późniejsze przekazywanie wirionów do wrażliwych komórek (rozprzestrzenianie się następcze) są ważne dla zrozumienia patogenezy wirusa opryszczki.
Transport i wyjście cząsteczek wirusa w neuronach zależy od złożenia dojrzałego zakaźnego wirionu 1,2. Wcześniej ustalone testy, w tym immunofluorescencja (IF) i mikroskopia elektronowa (EM), zostały wykorzystane do zbadania stanu składania cząstek i interakcji białek związanych z transportem wirionu i rozprzestrzenianiem się 3-6. Jednak dynamiczna natura transportu wirionów i artefaktów eksperymentalnych wprowadzonych przez utrwalenie chemiczne zakłóciła interpretację utrwalonych obrazów 7,8. Ostatnio opisano szereg wirusowo-fluorescencyjnych białek fuzyjnych dla HSV i PRV, które mają znikomy wpływ na funkcję białek. Fluorofory z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) i czerwonymi białkami fluorescencyjnymi (mCherry lub mRFP) są często sparowane, aby umożliwić obrazowanie dwóch z trzech składników strukturalnych dojrzałego wirionu: kapsydu, osłonki i glikoproteiny 9-11. Obrazowanie żywych komórek transportu następczego przy użyciu podwójnie znakowanych wirusów wizualizuje stan składania cząstek wirusa podczas transportu. Podobne szczepy wirusowe wykazujące ekspresję fluoroforu są wykorzystywane do wizualizacji liczby i różnorodności genomów wirusa po rozprzestrzenianiu się 12,13. Właściwości białek fluorescencyjnych (omówione w 14,15) mają ogromny wpływ na zdolność do wizualizacji zespołów wirusowych lub komórkowych. Wewnętrzne właściwości białka fluorescencyjnego, w tym wzajemne oddziaływania i stabilność, powinny być brane pod uwagę podczas projektowania i testowania nowych fuzji białek w celu zachowania funkcjonalności typu dzikiego.
W połączeniu z fuzjami białek fluorescencyjnych, do obrazowania żywych komórek zakażenia wirusem opryszczki zastosowano dwa dobrze scharakteryzowane systemy hodowli komórkowych in vitro: zdysocjowane 16 i podzielone na przedziały 17 (Rysunek 1A) szczurzych górnych zwojów szyjnych (SCG). W obu systemach embrionalne SCG są preparowane, dysocjowane na ciała jednokomórkowe i posiane w celu hodowli in vitro 18. Neurony SCG są częścią autonomicznego układu nerwowego i mogą być łatwo hodowane i różnicowane przez neuronalny czynnik wzrostu (NGF) do dojrzałego stanu spolaryzowanego ex vivo. Zdysocjowane neurony SCG tworzą rozszerzoną sieć aksonów, która pozwala na wizualizację cząstek wirusa podczas transportu następczego 6. Podzielone na przedziały hodowle SCG zapewniają płynną izolację ciała komórki neuronalnej (przedział S) i dystalnych końców aksonów (przedział N) 19. Wcześniej opublikowano szereg szczegółowych protokołów budowy i wykorzystania neuronów podzielonych na przedziały przy użyciu oryginalnych 20 lub zmodyfikowanych komór Campenota 17. Izolacja fluidyczna pozwala na selektywne zakażenie ciał komórek nerwowych i wykrycie wirionów potomnych po transporcie do izolowanych końców aksonów. Posiew komórek nabłonkowych na końcach przed infekcją zapewnia komórkom biorczym rozprzestrzenianie się infekcji wirusowej.
Istnieje wiele istotnych elementów ważnych dla wszystkich eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek, ale najważniejsze dla naszych protokołów to: zautomatyzowana akwizycja obrazu, oświetlenie fluorescencyjne, szybkość obrazowania i kontrola środowiska. Do wszystkich eksperymentów obrazowych używamy odwróconego, zautomatyzowanego mikroskopu z oświetleniem epifluorescencyjnym (ryc. 1B). Mikroskop jest zbudowany na podstawie Nikon Eclipse Ti i wykorzystuje szereg sterowanych komputerowo systemów zmotoryzowanych do szybkiej rekonfiguracji mikroskopu podczas automatycznej akwizycji obrazu. Do oświetlenia fluorescencyjnego używamy lampy rtęciowej o szerokim spektrum działania, która może być tłumiona za pomocą filtrów o neutralnej gęstości wzdłuż ścieżki oświetlenia. Filtry wzbudzenia ograniczają spektrum oświetlenia fluorescencyjnego, a w połączeniu z wieloprzebiegowymi zwierciadłami dichroicznymi i filtrami emisji fluorescencji wizualizują określone związki fluorescencyjne. Filtry wzbudzenia i emisji są zamontowane w niezależnych, szybko przełączających się kołach filtrowych, aby umożliwić szybką sekwencyjną akwizycję różnych kanałów fluorescencyjnych. Szybkość akwizycji obrazu jest dodatkowo zwiększona dzięki czułej i szybkiej kamerze EM-CCD, przydatnej do wykrywania sygnałów o niskiej intensywności i krótkich czasach odczytu obrazu. Kontrola otoczenia pod mikroskopem odbywa się za pomocą podgrzewanego inkubatora ze stopniem i grzałki obiektywu, która utrzymuje próbki w podwyższonych temperaturach, podczas gdy do inkubatora wprowadzana jest nawilżona i wzbogacona w CO2 atmosfera. Mikroskop jest przechowywany w zaciemnionym pomieszczeniu, w którym temperatura otoczenia jest utrzymywana na poziomie zbliżonym do 25 °C, a światło zewnętrzne jest zminimalizowane dzięki zasłonom zaciemniającym we wszystkich oknach. Poniższe protokoły opisują zastosowanie tego systemu do testów transportu następczego i rozprzestrzeniania się.
Istnieje wiele alternatyw dla kontroli zmiennych obrazowania żywych komórek. Kontrola ustawień mikroskopu może być wykonywana ręcznie lub za pomocą zautomatyzowanych systemów zależnych od zastrzeżonego oprogramowania. Oświetlenie fluorescencyjne można uzyskać za pomocą źródeł halogenowych, LED lub laserowych. Szybkość obrazowania jest modyfikowana przez szybkość przełączania filtrów i czas wizualizacji sygnału ze sparowanym systemem detekcji. Kontrolę środowiska można osiągnąć za pomocą specjalistycznego sprzętu na stoliku mikroskopu, obudowy całości lub części mikroskopu w ogrzewanym i nawilżonym pudełku lub poprzez podniesienie temperatury w pomieszczeniu, w którym będzie wykonywana mikroskopia. Każda z tych alternatyw ma zalety i wady związane z kosztami i wydajnością.
W kolejnym protokole szczegółowo opisujemy wykorzystanie obrazowania żywych komórek do badania szybkiego transportu następczego i następczego rozprzestrzeniania się wirusów opryszczki alfa za pomocą rekombinowanych szczepów wirusów. Obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym wizualizuje kolokalizację kapsydu, osłonki i/lub glikoproteiny na dynamicznych strukturach poddawanych transportowi w obrębie aksonów 11. Nocne obrazowanie poklatkowe podzielonych kultur neuronalnych wizualizuje wydostanie się wirionu aksonalnego i infekcję wrażliwych komórek 12. Przedstawione tutaj protokoły zostały zoptymalizowane do użytku z naszym konkretnym systemem obrazowania, ale są przedstawione w szerokim ujęciu w odniesieniu do czterech elementów obrazowania żywych komórek. W dalszej części dyskusji omówimy szczegółowo niektóre z optymalizacji, które są niezbędne do udanego eksperymentowania.

<table><tbody><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem 35 mm</td><td>MatTek Corporation; Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm &mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, Werona, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Korpus mikroskopu </td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop zmotoryzowany X-Y stage</td><td>Prior Scientific; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan Flat Top</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowane koła filtrowe</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 10-pozycyjne koło</td><td></td></tr><tr><td>filtrów Źródło oświetlenia fluorescencyjnego </td><td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Kanada</td> Wielozakresowe zestawy filtrów fluorescencyjnych <td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - Kamera ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Etap Chamlide Inkubator środowiskowy</td><td>Live Cell Instruments; Seul, Korea Południowa</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka obiektywu</td><td>Bioptecs; Butler, PA</td><td>150803 Kontroler 150819-12-08 Oprogramowanie do analizy grzałek</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc.; Melville, Nowy Jork</td><td>NIS Elementy</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Postępy w technikach mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek, a także budowa rekombinowanych szczepów wirusowych, które wyrażają fluorescencyjne białka fuzyjne, umożliwiły wizualizację w czasie rzeczywistym transportu i rozprzestrzeniania się infekcji neuronów wirusem alfaopryszczki. Zastosowanie nowych fluorescencyjnych białek fuzyjnych do błony wirusowej, powłoki i kapsydów, w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek, pozwoliło zidentyfikować zespoły cząstek wirusa ulegające transportowi w aksonach. Podobne narzędzia zostały z powodzeniem wykorzystane do analiz rozprzestrzeniania się cząstek wirusa między komórkami w celu ilościowego określenia liczby i różnorodności wirionów przenoszonych między komórkami. Co ważne, techniki obrazowania żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się następcy dostarczają wielu informacji, w tym prędkości transportu cząstek, rozkładów cząstek i czasowych analiz lokalizacji białek. Wraz z klasycznymi technikami genetyki wirusów, metodologie te dostarczyły krytycznych informacji na ważne pytania mechanistyczne. W tym artykule szczegółowo opisujemy metody obrazowania, które zostały opracowane, aby odpowiedzieć na podstawowe pytania dotyczące transportu i rozprzestrzeniania się wirusa opryszczki alfa.

Transport anterogradowy
Zastosowanie niniejszego protokołu do infekcji dysocjowanych kultur SCG szczepem PRV 348, rekombinowanym szczepem PRV wykazującym ekspresję białek fuzji błonowych GFP-Us9 i gM-mCherry, umożliwiło wizualizację transportu anterogradnego wirionów (Rycina 3 oraz Film uzupełniający 4). Wbudowanie tych białek fuzyjnych do cząstek wirusowych pozwala na ich wykrycie w transportowanych punktach (puncta), a wspomniane warunki obrazowania minimalizuj...

Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja zdarzeń transportu i rozprzestrzeniania się wirusa opryszczki z wykorzystaniem fuzji białek fluorescencyjnych w pierwotnych kulturach neuronalnych. Osiąga się to poprzez uprzednie zapewnienie inkubacji próbek w temperaturach fizjologicznych na mikroskopie zdolnym do szybkiego przełączania oświetlenia fluorescencyjnego. W drugim kroku parametry obrazowania fluorescencyjnego są tak ustawione, aby ograniczyć uszkodzenia fotochemiczne komórek przy jednoczesnym pozyskaniu wiarygodnych danych.Następnie przeprowadza się sekwencyjną akwizycję kanałów fluorescencyjnych lub akwizycję wieloposycyjną. W ostatnim kroku pozyskiwane są wieloobrazowe ramki mozaikowe. Dane są analizowane i formatowane w celu prezentacji oraz publikacji.W ostateczności ta metoda obrazowania żywych komórek jest wykorzystywana do śledzenia ruchu fluorescencyjnych cząstek wirusa wewnątrz neuronów oraz do monitorowania infekcji w miarę jej rozprzestrzeniania się między komórkami. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat transportu i rozprzestrzeniania się wirusa opryszczki w neuronach. Może ona również zostać zastosowana w badaniu innych dynamicznych zjawisk w biologii komórki i mikrobiologii, takich jak endocytotyczne pobieranie cząsteczek lub migracja komórek.Przed każdym eksperymentem obrazowania należy podłączyć i rozpocząć ogrzewanie inkubatora nad stolikiem mikroskopu. Po 30 minutach włącz mikroskop, źródła światła prześwieconego i epi-fluorescencyjnego oraz automatyczne sterowniki sprzętowe. Następnie otwórz NIS elements, oprogramowanie do sterowania mikroskopem, aby połączyć się z urządzeniem.Tutaj przedstawiono zrzut ekranu standardowego interfejsu użytkownika w programie NIS elements. Przyciski odtwarzania i zatrzymania sterują oknem obrazu na żywo, które przedstawia bieżące konfiguracje sprzętowe do obrazowania, a także to, co jest w danej chwili obrazowane. W górnym panelu znajduje się seria konfiguracji optycznych, które wdrażają predefiniowane ustawienia sprzętowe w celu skonfigurowania mikroskopu do detekcji w świetle przechodzącym lub fluorescencyjnym.Ustawienia sterowania kamerą i ekspozycji umożliwiają konfigurację detekcji obrazu w celu optymalizacji jego jakości i szybkości. Wszystkie eksperymenty są koordynowane za pomocą sterowników akwizycji ND. Następnie należy przymocować grzałkę obiektywu do odpowiedniego obiektywu imersyjnego olejowego, a potem zainstalować inkubator nadstolikowy na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu.Upewnij się, że zamontowano odpowiednią wkładkę do utrzymania próbki, a następnie podłącz nawilżoną linię powietrzną z panelu sterowania inkubatorem do portu wlotowego w inkubatorze nadstolikowym. Włącz sterowniki inkubatora oraz podgrzewaczy obiektywów, a następnie ustaw temperaturę zgodnie z wcześniej zweryfikowanymi warunkami, specyficznymi dla używanego obiektywu i obrazowanej próbki. Na koniec otwórz zawór sterujący w zbiorniku z 5% carbon dioxide 95%atmospheric, aby dostarczyć powietrze wzbogacone o carbon dioxide do inkubatora nadstolikowego.Aby obrazować zdarzenia transportu wirionów w czasie rzeczywistym, należy najpierw umieścić szalkę z kulturą zainfekowanych neuronów w inkubatorze nad stołem mikroskopu na minimum 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Następnie, korzystając ze światła przechodzącego i okularu mikroskopu, należy odnaleźć ciało komórki neuronalnej z wyraźnie odizolowanym wypustkiem aksonalnym.Znalezienie obszarów nadających się do obrazowania w kulturze neuronalnej jest najtrudniejszą częścią tej procedury. Sukces można zapewnić poprzez przygotowanie wielu kultur na wypadek słabego wzrostu komórek lub infekcji, bądź fizycznego naruszenia kultury podczas obrazowania. Teraz należy użyć oprogramowania mikroskopu, aby przełączyć tor światła na kamerę EM CCD, a następnie kliknąć przycisk odtwarzania, aby uruchomić okno obrazu na żywo.Po ustaleniu optymalnych ustawień ekspozycji kamery dla każdego zestawu białek fluorescencyjnych, ustawiono wzmocnienie mnożenia elektronów kamery na 300, aby zminimalizować czas ekspozycji i usprawnić detekcję słabych sygnałów. Zatrzymano okno obrazowania na żywo, aby zapobiec blaknięciu próbki.Następnie, po ustawieniu czasów ekspozycji i znalezieniu wyraźnego fragmentu aksonu w elementach NIS, skonfiguruj oprogramowanie do sekwencyjnego pozyskiwania obrazów. Otwórz rozwijane menu aplikacji i wybierz aplikację „six D define run experiment”. W oknie akwizycji ND kliknij kartę czasu, aby określić częstotliwość pozyskiwania obrazów.Ustaw interwał na brak opóźnienia, a czas trwania na pięć minut. Teraz kliknij kartę Lambda, aby wybrać zaprogramowane konfiguracje sprzętowe stosowane podczas akwizycji wielu obrazów fluorescencyjnych. Kliknij pierwsze pole, a następnie w kolejnych menu rozwijanych wybierz odpowiednią konfigurację sprzętową.Zaznacz pole zapisu do pliku, a następnie skonfiguruj lokalizację i nazwę pliku wynikowego eksperymentu. Po ustawieniu wszystkich tych parametrów kliknij przycisk uruchom teraz, aby rozpocząć eksperyment. Szybkość akwizycji obrazów jest optymalizowana poprzez ustawienia ekspozycji oraz rozmiar pozyskiwanego obrazu.Użyj narzędzia regionu zainteresowania (ROI) w programie NIS Elements, aby zdefiniować obszar zainteresowania. Wybierz obszar stanowiący od 25 do 50% całkowitej powierzchni obrazu, aby przeprowadzić nocne obrazowanie time-lapse zdarzeń rozprzestrzeniania się agregatów. Następnie ostrożnie umieść szalkę hodowlaną w inkubatorze nadstołowym.Po upewnieniu się, że obiektyw znajduje się z boku naczynia, powoli ustaw ostrość, dbając o to, aby obiektyw nie wsunął się w próbkę. Po zidentyfikowaniu pola ostrości powoli przesuń obiektyw na środek naczynia, w pobliże wewnętrznej bariery, zaznaczając wewnętrzną stronę komory aksonalnej; należy przy tym zachować ostrość głębi i unikać wsuwania się w próbkę. Następnie otocz neurony w naczyniu hodowlanym około 2 ml PBS o temperaturze 37 °C poza pierścieniem teflonowym, aby zminimalizować odwadnianie próbki i zapewnić izolację termiczną.Następnie należy użyć wszystkich filtrów gęstości neutralnej, aby ograniczyć intensywność oświetlenia do najniższego możliwego poziomu, co umożliwi częstą akwizycję obrazów w długich odstępach czasu bez nadmiernego uszkodzenia światłem. W oknie akwizycji ND należy kliknąć kartę dużego obrazu, a następnie wybrać obszar składający się z pięciu na dwa obrazy. Należy zastosować 7% nakładki podczas szycia (stitching), aby sekwencyjnie obrazować wiele pozycji równolegle.W trakcie konfiguracji nocnego filmowania wybierz kartę pozycji XY. Następnie określ pozycje, które będą stanowiły punkt centralny dla każdego dużego obszaru obrazowania. Punktem ostrości powinno być jądro komórkowe; ustaw obiektyw w taki sposób, aby u większości komórek widoczna była wyraźnie zdefiniowana otoczka jądrowa.Następnie kliknij jeden cykl pętli, aby przetestować ustawienia ekspozycji i pozycji oraz ocenić uzyskane obrazy pod kątem światła przechodzącego, oświetlenia, ostrości i kadrowania. Po zweryfikowaniu i przetestowaniu wszystkich ustawień uruchom automatyczny eksperyment, klikając przycisk uruchom teraz, aby wyeksportować filmy uzyskane podczas obrazowania żywych komórek. Najpierw otwórz odpowiedni surowy plik ND dwa w programie NIS elements i wybierz widok rozdzielonych komponentów.Aby zwizualizować wybrane kanały fluorescencyjne, odtwórz plik z odpowiednią prędkością. Pięć klatek na sekundę jest dobrym punktem wyjścia dla wizualizacji szybkiego transportu; warto dołączyć znacznik czasu, aby reprezentował on zegar czasu rzeczywistego podczas odtwarzania filmu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i wybierz ADD ND information.W górnym lewym rogu pojawi się licznik cyfrowy; aby edytować znacznik czasu, należy kliknąć prawym przyciskiem myszy na liczniku i wybrać opcję edit ND information. W wyświetlonym oknie pop-up należy zmienić tekst tak, aby odzwierciedlał odpowiednie parametry obrazowania. W celu zapewnienia przejrzystości należy dostosować kolor i rozmiar czcionki tekstu.Następnie przejdź do menu edycji i wybierz opcję Create view snapshot, aby otworzyć okno migawki widoku w celu wygenerowania 8-bitowego pliku eksportu RGB zawierającego kanały fluorescencyjne z całego filmu; wybierz opcję apply to all frames. Na koniec zapisz plik w formacie AVI dla zapewnienia kompatybilności międzyplatformowej i ustaw tempo odtwarzania na 200 milisekund na klatkę. Na tym obrazie w kontraście fazowym przedstawiono reprezentatywną, dojrzałą kulturę dysocjowanych zwojów szyjnych górnych (SCG) wykorzystaną do obrazowania transportu wirionów w kierunku retrogradnym; neurony zainfekowane wirusem wścieklizcy pseudorabies (PRV 3 48) wykazują ekspresję białek fuzyjnych błon GFPS nine i GMM cherry.Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywne obrazowanie żywych komórek aksonów SCG osiem godzin po zakażeniu wirusem PRV 3 48; w dwóch kanałach fluorescencyjnych, GFP i mCherry, uwidoczniono struktury transportowane anterogradnie w obrębie dystalnych odcinków aksonów. Struktura transportowana anterogradnie, wskazana białymi strzałkami, przemieszcza się wzdłuż aksonu. Dwa białka fluorescencyjne są przesunięte przestrzennie ze względu na sekwencyjną akwizycję kanałów fluorescencyjnych oraz szybki ruch struktur wirusowych.Zastosowanie tego protokołu do infekcji dysocjowanych kultur SCG wirusem PRV 3 48 ułatwiło wizualizację transportu anterogradacyjnego Vons. Wbudowanie tych białek fuzyjnych w cząstki wirusowe pozwala na ich detekcję w transportowanych punktach, co objawia się w postaci poruszających się fluorescencyjnych kropek. Wspomniane warunki obrazowania minimalizują przesunięcie każdego fluoroforu na poruszającej się cząsteczce podczas przełączania filtrów.Zastosowanie szybko przełączalnych kół filtrów i sparowanych dichroicznych luster wieloprzepustowych umożliwia szybką sekwencyjną akwizycję dwóch lub więcej kanałów fluorescencyjnych z prędkością do 0,8 klatek na sekundę w trzy minutowym oknie obrazowania. Często obserwuje się liczne transportujące Punta, a duże rozmiary próbek do analiz kolokalizacji są generowane w krótkim czasie. Przedstawiono tutaj schemat przedzielonego systemu hodowlanego widocznego na tym obrazie, w którym neurony SCG zostały wysiane w lewym przedziale, a projekcje aksonalne rozciągają się pod wewnętrznymi barierami do przedziału po prawej stronie.Poniższe obrazy zostały wybrane z dużego mozaikowego filmu poklatkowego przedstawiającego transmisję wirionów z zainfekowanych aksonów PRV 4 27 do komórek nabłonkowych biorców. Na tym pierwszym panelu widoczne są nałożone na siebie obrazy fluorescencyjne YFP i RFP w określonym czasie po infekcji. Przedstawiono moment, w którym komórki biorcy zaczynają ekspresować białka fuzyjne YFP i VP 26 MRFP związane z błoną.Biała ramka wyróżnia obszar komórek nabłonkowych biorcy zawierający infekujące kompleksy kapsydów. Tutaj pokazano ten sam obszar co na poprzednim obrazie, widziany wyłącznie w kanale RFP. Ciągła biała linia oznacza schematyczne przedstawienie obrysu komórki.Przerwanymi białymi liniami zaznaczono jądra komórkowe, a niebieskimi liniami obrysowano aksony. Na tym drugim panelu przedstawiono wspólnie jedynie kanały YFP i RFP. Zwróć uwagę na dużą liczbę punktów MRFP związanych z pęczkami aksonalnymi.Komórki te zostały zainfekowane niedawno i nie wykazują ekspresji żadnego z białek fuzyjnych. Zainfekowane komórki można śledzić wstecz, aby zwizualizować fluorescencyjne kapsydy, które zapoczątkowały infekcję wirusową. Pojedyncze komórki można wyizolować z szerokiego pola widzenia i śledzić bez znacznej utraty szczegółów.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że mikroskopia żywych komórek wpływa na obserwowany proces biologiczny. Jednakże staranna optymalizacja tych protokołów pozwala na wizualizację bez wprowadzania zmian.

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie żywych komórek wirusa alfaherpes przenoszenia anterogradowego i rozprzestrzeniania

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

ICP0 ulega translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Mechanizm molekularny tego zdarzenia nie jest znany. W tym miejscu opisujemy zastosowanie mikroskopu konfokalnego jako narzędzia do ilościowego określania ruchu ICP0 w zakażeniu HSV-1, co stanowi podstawę do ilościowej analizy translokacji ICP0 w przyszłych badaniach mechanistycznych.

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek transportu wirusa alfaopryszczki w pierwotnych kulturach neuronowych przy użyciu białek fuzyjnych fluorescencyjnych. Technika ta umożliwia wizualizację dynamicznych zdarzeń zakażenia w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Przeglądaj więcej filmów