Klonowanie molekularne

Klonowanie molekularne to zestaw technik stosowanych w celu wprowadzenia rekombinowanego DNA z organizmu prokariotycznego lub eukariotycznego do nośnika replikacyjnego, takiego jak plazmidy lub wektory wirusowe. Klonowanie polega na tworzeniu licznych kopii interesującego fragmentu DNA, na przykład genu. W tym filmie dowiedzą się Państwo o poszczególnych etapach klonowania molekularnego, sposobie przygotowania procedury oraz o różnych zastosowaniach tej techniki.

Przed rozpoczęciem klonowania wymagane są co najmniej dwie ważne cząsteczki DNA. Po pierwsze i najważniejsze, niezbędny jest fragment DNA, który ma zostać sklonowany, znany również jako insert. Może on pochodzić od prokariota, eukariota, organizmu wymarłego lub może zostać stworzony sztucznie w laboratorium. Dzięki klonowaniu molekularnemu możemy dowiedzieć się więcej o funkcji konkretnego genu.

Po drugie, potrzebny jest wektor. Wektor to plazmidowy DNA wykorzystywany w biologii molekularnej jako narzędzie do powielania określonego genu lub produkcji z niego białka. Plazmidy są przykładem wektora; stanowią one koliste, pozachromosomalne DNA replikowane przez bakterie.

Plazmid posiada zazwyczaj wielostronnicową stronę klonowania (multiple cloning site) lub MCS; obszar ten zawiera miejsca rozpoznawania dla różnych endonukleaz restrykcyjnych, znanych również jako enzymy restrykcyjne. Różne inserty mogą zostać włączone do plazmidu za pomocą techniki zwanej ligacją. Wektor plazmidowy zawiera również sekwencję początku replikacji (origin of replication), która umożliwia jego replikację w bakteriach. Dodatkowo plazmid posiada gen oporności na antybiotyk. Jeśli bakterie włączą plazmid, przeżyją w pożywce zawierającej dany antybiotyk. Pozwala to na selekcję bakterii, które zostały pomyślnie przekształcone.

Insert i wektor są klonowane w organizmie gospodarza; najczęściej stosowanym w klonowaniu molekularnym jest E. coli. E. coli szybko rośnie, jest powszechnie dostępna i posiada liczne komercyjnie produkowane wektory klonujące. Eukarioty, takie jak drożdże, mogą również służyć jako organizmy gospodarze dla wektorów.

Pierwszym krokiem ogólnej procedury klonowania molekularnego jest pozyskanie pożądanego insertu, który może zostać wyizolowany z DNA lub mRNA dowolnego typu komórek. Następnie, w zależności od rodzaju insertu i planowanego zastosowania, dobierany jest optymalny wektor oraz organizm gospodarz. Do powielenia insertu często stosuje się metodę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy, czyli PCR.

Następnie, za pomocą serii reakcji enzymatycznych, insert i produkt trawienia są łączone i wprowadzane do organizmu gospodarza w celu masowej replikacji. Zreplikowane wektory są oczyszczane z bakterii, a po trawieniu restrykcyjnym analizowane na żelu. Fragmenty oczyszczone z żelu są następnie przesyłane do sekwencjonowania, aby zweryfikować, czy insert jest pożądanym fragmentem DNA.

Przyjrzyjmy się nieco dokładniej temu, jak przebiega klonowanie molekularne. Przed rozpoczęciem prac przy stole laboratoryjnym należy zaplanować strategię klonowania. Przykładowo, każdy dany wektor plazmidowy zapewnia ograniczoną liczbę miejsc restrykcyjnych do wprowadzenia wstawki za pomocą polilinkera (MCS). Należy wybrać takie miejsca restrykcyjne, które nie występują w wstawce, aby jej nie przeciąć. Może zdarzyć się sytuacja, w której konieczne będzie połączenie fragmentu o tępych końcach z fragmentem z nawisami. W takim przypadku użycie fragmentu Klenowa w celu przygotowania ligacji tępych końców może być jedyną opcją wprowadzenia wstawki do pożądanego wektora. Znajomość dostępnych narzędzi klonowania molekularnego oraz opracowanie starannej strategii przed rozpoczęciem prac może znacząco zaoszczędzić czas.

DNA będące źródłem do klonowania molekularnego można wyizolować z niemal każdego rodzaju komórek lub próbek tkankowych za pomocą prostych technik ekstrakcji. Po izolacji można zastosować PCR w celu amplifikacji wstawki.

Po amplifikacji wstawka oraz wektor są trawione enzymami restrykcyjnymi, znanymi również jako endonukleazy restrykcyjne.

Po trawieniu wstawkę i wektor można poddać elektroforezie w żelu i oczyścić w procesie zwanym oczyszczaniem z żelu. W przypadku wektora etap ten pomaga oddzielić zlinearyzowany plazmid od plazmidu nieprzeciętego, który w żelu ma tendencję do pojawiania się jako smuga o wysokiej masie cząsteczkowej.

Po oczyszczeniu z żelu produktów trawienia, wstawka jest ligowana, czyli łączona z plazmidem, za pomocą enzymu zwanego ligazą DNA.

Zasadniczo zawsze warto przygotować ligację tak, aby stosunek wstawki do wektora wynosił 3:1, co zapewnia, że tylko niewielka ilość wektora ulegnie samoligacji. Po przygotowaniu ligacji na lodzie, inkubuje się ją w temperaturze od 14-25˚C przez okres od 1 h do całej nocy.

Następnie przeprowadza się transformację, aby wprowadzić wektor plazmidowy do gospodarza, który będzie go replikował.

Po transformacji bakterie wysiewa się na płytki z agarem z antybiotykiem i inkubuje przez noc w 37°C. Ponieważ plazmid zawiera gen oporności na antybiotyk, udana transformacja doprowadzi do powstania kolonii bakteryjnych podczas wzrostu na płytkach z agarem w obecności antybiotyków. Pojedyncze kolonie można następnie pobrać z płytki po transformacji, przenieść do płynnych pożywek w ponumerowanych probówkach i umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem w celu namnożenia. Mała objętość kultury płynnej jest nakładana na ponumerowaną płytkę z agarem, natomiast reszta kultury przechodzi do etapu oczyszczania plazmidu. System numeracji określający tożsamość kolonii bakteryjnych, z których docelowo zostaną oczyszczone plazmidy, jest zachowany przez cały proces oczyszczania plazmidów.

Próbka oczyszczonego plazmidu jest następnie trawiona enzymami restrykcyjnymi. Produkt trawienia nanosi się na żel i poddaje elektroforezie, aby sprawdzić obecność wstawki, co potwierdzi, że kolonia bakteryjna została przekształcona plazmidem zawierającym wstawkę, a nie plazmidem samoligowanym. Bakterie, u których potwierdzono transformację plazmidem z wstawką, są namnażane w celu dalszego oczyszczania plazmidów. Jako ostatni etap weryfikacji wykonuje się sekwencjonowanie, aby potwierdzić, że geny zainteresowania zostały sklonowane.

Klonowanie molekularne może być wykorzystywane w niemal nieograniczonej liczbie zastosowań. Na przykład, gdy matryca mRNA jest odwrotnie przepisywana w celu utworzenia cDNA, czyli komplementarnego DNA, przez enzym zwany odwrotną transkryptazą, a następnie stosuje się PCR w celu amplifikacji cDNA, klonowanie molekularne może zostać wykorzystane do stworzenia biblioteki cDNA – biblioteki wszystkich genów eksprymowanych przez dany typ komórek.

Klonowanie molekularne może być również wykorzystane do pobrania serii genów lub klastra genów z jednego szczepu bakteryjnego i ich reorganizacji w plazmidach, które są następnie transformowane do innego szczepu, co pozwala na odtworzenie całego szlaku biosyntetycznego w celu produkcji złożonej cząsteczki.

Poprzez klonowanie molekularne można wygenerować bibliotekę mutantów, eksprymując docelowy plazmid w specjalnym szczepie bakteryjnym, który wykorzystuje polimerazę podatną na błędy podczas hodowli w określonych temperaturach. Mutacje można scharakteryzować za pomocą sekwencjonowania. Bakterie transformowane zmutowanymi genami można następnie testować różnymi lekami lub chemikaliami, aby sprawdzić, które kolonie bakterii wyewoluowały w kierunku oporności na dany lek.

Dzięki klonowaniu molekularnemu do plazmidów DNA można włączyć geny reporterowe; powszechnym genem reporterowym jest zielone białko fluorescencyjne lub GFP, które emituje zieloną fluorescencję pod wpływem światła UV. Gen reporterowy można również wprowadzić do alfawirusa, aby wykazać infekcję u komarów oraz zdolność do transmisji w komórkach.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat klonowania molekularnego. Powinni Państwo teraz rozumieć, jak przebiega proces klonowania molekularnego i w jaki sposób technika ta może być wykorzystana w biologii molekularnej. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!