Inwazja bakterii jelitowych na komórki nabłonka jelitowego in vitro jest znacznie zwiększona dzięki pionowemu modelowi komory dyfuzyjnej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie modelu komory dyfuzji pionowej (VDC), aby zbadać interakcje bakteryjne w kontekście inwazji komórek nabłonkowych jelit. Osiąga się to najpierw poprzez zastosowanie specjalnego filtra z osadzoną spolaryzowaną monowarstwą komórek nabłonkowych jelit Caco-2, co pozwala na stworzenie w VDC oddzielnych przedziałów apikalnego i bazolateralnego. W drugim kroku do przedziału apikalnego dodaje się odpowiedni inokulum bakteryjne.

W warunkach mikroaerobowych i hodowli komórkowej, do komory podstawno-bocznej dodaje się pożywkę w warunkach aerobowych, a następnie w wybranych punktach czasowych podczas kokultury wyjmuje się filtr i zlicza liczbę bakterii oddziałujących lub wewnątrzkomórkowych. Ostatecznie, przy zastosowaniu modelu VDC, można zaobserwować wzrost liczby bakterii oddziałujących i wewnątrzkomórkowych w porównaniu do standardowych warunków hodowli aerobowej. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak standardowe testy adhezji i inwazji w hodowlach tkankowych, jest to, że kokultura bakterii i komórek nabłonka jelitowego jest prowadzona w warunkach in vitro, które w stopniu bardziej zbliżonym naśladują warunki in vivo w ludzkim jelicie.

Procedurę zaprezentują N Vida nas, doktorantka z mojego laboratorium, oraz Dominic Mills, stażysta podoktorski, który opracował model pionowej komory dyfuzyjnej w ramach swojego doktoratu w moim laboratorium. Rozpocznij od wysiania 4×10⁵ komórek nabłonka jelitowego Caco-2 na filtr 0,4 µm w pożywce hodowlanej, a następnie hoduj komórki do polaryzacji przez 21 dni, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni, aby potwierdzić status polaryzacji warstwy jednowarstwowej. Użyj omomierza do pomiaru transepitelialnego oporu elektrycznego.

Na 24 godziny przed rozpoczęciem testu kokultury VDC inkubuj szczepy jejuni na świeżej płytce z agarem krwi w warunkach mikroaerobowych w inkubatorze z regulowaną atmosferą. Jednocześnie przeprowadź preinkubację 30 mililitrów bulionu Bruce w tych samych warunkach. W dniu eksperymentu zanurz połówki komór VDC, a także pierścienie O-ring i korki, w roztworze sterylizującym. Następnie za pomocą sterylnej strzykawki 20 mililitrów przepłucz wloty gazu w obu połówkach komór tym roztworem. Po godzinie wypłucz komponenty VDC świeżą sterylną wodą, używając kolejnej sterylnej strzykawki 20 mililitrów do przepłukania wlotów gazu.

Następnie przenieś połowę kultury z płytki z agarem krwią CJ jui do jednego mililitra uprzednio inkubowanego bulionu Barella, aby uzyskać około 10¹⁰ CFU na mililitr. Zmierz gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej przy 600 nanometrach, aby półilościowo określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU), a następnie dostosuj zawiesinę bakteryjną do pożądanego poziomu inokulum w łącznej objętości czterech mililitrów uprzednio inkubowanego bulionu Bruce. Wykonaj rozcieńczenia seryjne z tej końcowej zawiesiny bakteryjnej, a następnie wysiej odpowiednie rozcieńczenie na płytki z agarem krwią w trzech powtórzeniach i inkubuj płytki w inkubatorze z atmosferą zmienną przez 48 godzin.

Następnie należy położyć dolną część komory VDC płasko na blacie i założyć na nią pierścień O-ring. Potem odłącz jeden filtr z komórkami nabłonka jelitowego z nośnika i przemyj go trzykrotnie 400 µL sterylnego PBS. Umieść filtr na dolnej części komory, upewniając się, że pierścień O-ring pozostaje na swoim miejscu, a następnie delikatnie nałóż na to górną część komory.

Po złożeniu dwóch połowic komory, należy je zacisnąć za pomocą zacisków pierścieniowych i ustawić VDC poziomo na blacie, tak aby oba otwory były skierowane ku górze. Do górnej połowicy komory należy dodać inokulum bakteryjne, a następnie wlać 4 mL pożywki do hodowli komórkowej do bocznej połowicy podstawnej. W otworach obu połowic komory należy umieścić elementy końcowe, a następnie umieścić VDC w inkubatorze z regulowaną atmosferą.

W bezpośrednim sąsiedztwie kolektora gazowego otwórz regulator dopływu gazu podłączony do kolektora. Podłącz rurkę z kolektora do wlotu gazu w dolnej bocznej półkomorze VDC, a następnie podłącz rurę wylotową prowadzącą z inkubatora z regulowaną atmosferą do jednego z wylotów w końcówce dolnej bocznej półkomory. Zamknij pozostały wylot w końcówce dolnej bocznej półkomory.

Następnie bardzo powoli otwórz przepływ gazu na kolektorze gazowym, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia gazu i uzyskać przepływ jednego pęcherzyka co dwa do pięciu sekund po odpowiednim czasie kokultury. Zamknij regulator dopływu gazu podłączony do kolektora gazowego. Następnie przedmuchaj przepływ gazu w VDC na kolektorze i odłącz wlot gazu, wylot gazu oraz korek z VDC.

Następnie wyjmij VDC z inkubatora z regulowaną atmosferą. Następnie pobierz supernatanty boczne z części apikalnej i bazalnej i przechowuj je w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy. Zdejmij zaciski pierścieniowe i ostrożnie rozłóż VDC.

Wyjmij filtr z półkomory i przenieś go do sterylnej 6-dołkowej płytki hodowlanej. Następnie przemyj VDC sterylną wodą i przechowuj go do kolejnej serii doświadczeń w celu wyliczenia całkowitej liczby oddziałujących bakterii. Przemyj komórki nabłonka jelitowego od trzech do czterech razy 400 µL sterylnego PBS, a następnie poddaj je lizie w 400 µL sterylnego PBS zawierającego Triton X 100 przez 20 minut w temperaturze pokojowej; przeprowadź rozcieńczenia seryjne lizatu komórkowego, a następnie wysiej odpowiednie rozcieńczenia w trzech powtórzeniach na płytki z agarem krwawym.

Następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z regulowaną atmosferą przez 48 godzin w celu zliczenia całkowitej liczby bakterii inwazyjnych. Inkubować komórki nabłonka jelitowego z 400 µL pożywki hodowlanej zawierającej 150 µg/mL gentamycyny przez dwie godziny w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek, aby zabić bakterie pozakomórkowe. Następnie określić liczbę jednostek tworzących kolonie po lizie komórek, rozcieńczeniach seryjnych i hodowli, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.

Poniższe dane przedstawiają porównanie liczby komórek CJ jui wchodzących w interakcje z komórkami Caco 2 lub naciekających je po trzech, sześciu lub 24 godzinach kokultury w standardowych warunkach testu hodowli komórkowej w zestawieniu z modelem VDC. Na przykład po 24 godzinach kokultury w standardowych warunkach hodowli komórkowej można zaobserwować mniej niż 10⁷ JCFU CJ jui wchodzących w interakcje z komórkami Caco 2. Natomiast po 24 godzinach kokultury w modelu VDC można zaobserwować około 10⁸ JCFU CJ jui wchodzących w interakcje z komórkami Caco 2, co stanowi niemal dziesięciokrotny wzrost interakcji CJ jui z IEC.

Porównując liczbę naciekających CJ jui w standardowych warunkach hodowli w stosunku do warunków VDC, z komórek CACO two po 24 godzinach w standardowych warunkach hodowli komórkowej można wyizolować około 10⁵ wewnątrzkomórkowych CFUs CGE jui. Natomiast po 24 godzinach kokultury w modelu VDC, z komórek CACO two można wyizolować około 10⁷ wewnątrzkomórkowych CFUs, co oznacza niemal 100-krotny wzrost wewnątrzkomórkowego CGE. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest monitorowanie przepływu gazu w komorze podstawno-bocznej po jej opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie patogenezy abuc do badania zarówno genetycznych podstaw interakcji bakterii z komórkami nabłonka jelitowego, jak i odpowiedzi immunologicznej gospodarza w ramach odporności wrodzonej na zakażenie bakteryjne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania modelu pionowej komory dyfuzyjnej do badania interakcji innych bakterii jelitowych z komórkami nabłonka jelitowego w warunkach, które dokładniej odzwierciedlają środowisko ludzkiego jelita.