Name: Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę izolacji śródbłonka mikronaczyniowego z tętnicy górnej powłokowej myszy do badania sygnalizacji wapniowej w komórkach endotelialnych z zachowaniem ich natywnej morfologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Pooneh Bagher i dr Erika Westcott za komentarze redakcyjne podczas przygotowywania manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerami R37-HL041026 i R01-HL086483 dla SSS oraz F32-HL107050 dla MJS. Wyłączną odpowiedzialność za te treści ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.

1. Przygotowanie sprzętu: komora przepływowa, pipety i roztwory
<ol>
	<li>Komora przepływowa: Użyj komory przepływowej ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 50 mm na dnie, aby połączyć izolowane rurki śródbłonka (patrz rysunek 1A). Przed montażem komory należy umyć szkiełka nakrywkowe zarówno 3% HCl, jak i 70% etanolem, spłukać ultraczystą wodą i osuszyć gazowym azotem.</li>
	<li>Pipety: Podczas protokołu używane są trzy różne rodzaje pipet: kaniulacja, rozcieranie i przypinanie. Zarówno pipety kaniulacyjne, jak i pinowe można wykonać przed dniem eksperymentu, ale pipeta do trituracji powinna być wykonana w dniu eksperymentu, ponieważ wymaga znajomości średnicy naczynia, aby odpowiednio dobrać rozmiar światła.
	<ol>
		<li>Pipety kaniulacyjne: Aby wypłukać czerwone krwinki ze światła, należy wyciągnąć rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet, aby miały długie, zwężające się końce. Połam końce kleszczami do średnicy zewnętrznej ~30% mniejszej niż średnica tętnic (~50-80 μm) i wypoleruj końcówkę, aby była gładka (patrz rysunek 1B). Pomocne jest również ustawienie końcówek pipet pod kątem około 45°.</li>
		<li>Pipety do rozcierania: Aby mechanicznie oddzielić komórki mięśni gładkich i przydanki od rurek śródbłonka, należy wykonać pipety do rozcierania z rurkami kapilarnymi ze szkła borokrzemianowego. Przygotuj rurki kapilarne jak powyżej i odłam koniec kleszczami. Wskazówka: Użyj szklanego urządzenia do nacinania, aby ułatwić czyste rozbicie grubszej ścianki szklanki pipety do pipet. Rozbić pipetę na średnicę wewnętrzną ustaloną w dniu eksperymentu, o około 10-20 μm większą niż średnica zewnętrzna naczynia, z którego zostaną wyizolowane rurki śródbłonka. Na ogień wypoleruj złamane końce, aż będą gładkie (patrz rysunek 1C).</li>
		<li>Pipety do przypinania: Aby ustabilizować rurkę śródbłonka w komorze przepływowej, należy wykonać pipety przypinające, aby przymocować rurkę śródbłonka do dna szkiełka nakrywkowego komory. Pociągnij szklane rurki kapilarne w taki sam sposób, jak pipety kaniulacyjne. Następnie połam końce kleszczami do średnicy ~100 μm i wypoleruj ogniem, aż końcówki będą uszczelnione, zaokrąglone i gładkie (patrz rysunek 1D). Uwaga: Jeśli końcówka pipety do przypinania nie jest całkowicie uszczelniona, płyn dostanie się do światła i może zakłócić wyniki eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory: Przygotuj wszystkie roztwory w ultraczystym (18,2 MΩ)H2Oi wysterylizuj je przez filtr 0,2 μm. Upewnij się, że osmolalność roztworów mieści się w przedziale 285-300 mOsm. Roztwory pozostają dobre przez około dwa tygodnie, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Roztwór rozpisczy: Roztwór soli stosowany podczas rozwarstwiania tętnicy nadbrzusza górnego składa się z (w mmol/l): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES), 10 glukozy, 0,01 nitroprusydku sodu (SNP) i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o pH 7,4. SNP dawcy NO jest dołączony, aby pomóc rozluźnić komórki mięśni gładkich, ułatwiając w ten sposób kanniurację tętnicy i ułatwiając usuwanie komórek mięśni gładkich podczas trituracji.</li>
		<li>Roztwór dysocjacyjny: Roztwór soli stosowany podczas dysocjacji rurki śródbłonka składa się z (w mmol/L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukozy, 2 CaCl2 i 0,1% BSA, o pH 7,4. Do 1 ml podwielokrotności tego buforu dodać: 0,62 mg/ml papainy, 1,5 mg/ml kolagenazy i 1,0 mg/ml ditioerytrytolu. Ponieważ enzymy pochodzące od różnych dostawców mogą mieć różne poziomy aktywności enzymatycznej, numery produktów użytych do tej pracy są zawarte w tabeli materiałów w celach informacyjnych. Uwaga: Podczas protokołu zarówno bufor dysocjacyjny, jak i bufor dysocjacyjny z enzymami są używane na różnych etapach.</li>
		<li>Roztwór do superfuzji: Fizjologiczny roztwór soli (PSS) stosowany do superfuzji izolowanej rurki śródbłonka składa się z (w mmol/l): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukozy i 2 CaCl2, o pH 7,4.</li>
		<li>Przygotuj i roztwory przed rozpoczęciem zabiegów chirurgicznych. Usunąć roztwory z 4 °C i podwielokrotność 50 ml buforu do rozwarstwienia do kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml i umieścić ją na lodzie. Dodatkowo podajcie porcję 50 ml buforu dysocjacyjnego bez enzymów i umieśćcie go na blacie stołu, aby zrównoważyć się do temperatury pokojowej. Usunąć roztwór przefuzyjny z temperatury 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na blacie stołu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
Upewnij się, że wszystkie procedury i protokoły dotyczące zwierząt są zgodne z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Missouri.
<ol>
	<li>Użyj samców lub samic myszy w wieku co najmniej 9 tygodni i zbadaj każdą z nich indywidualnie. Znieczulić mysz pentobarbitalem sodu (60 mg/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.). Wskazówka: Rozcieńczenie pentobarbitalu do 10 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przed wstrzyknięciem zmniejsza możliwość przedawkowania.</li>
	<li>Znieczulenie utrudnia regulację temperatury, więc utrzymuj mysz w cieple natychmiast po pierwszym wstrzyknięciu pentobarbitalu. Używanie metalowego nośnika (wentylowanego aluminiowego kosza) na górze płyty grzewczej (skalibrowanej na ~37 °C) dobrze sprawdza się w utrzymaniu stabilnej temperatury myszy. Alternatywnie użyj lampy grzewczej, zwracając uwagę na ustawienie jej w odpowiedniej odległości od myszy. Monitoruj mysz co 5-10 minut, aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak wycofania do uszczypnięcia palca u nogi lub ogona). Po 15-20 minutach może być konieczne podanie dawki uzupełniającej. Najlepiej postępować powoli i ostrożnie, aby uniknąć przedawkowania, zwłaszcza w przypadku zwierząt otyłych, starszych lub w inny sposób zestresowanych.</li>
	<li>Usuń włosy od strony brzusznej, ostrożnie goląc je małymi maszynkami do strzyżenia włosów dla zwierząt. Szczególną uwagę należy zwrócić na uniknięcie urazu zwierzęcia. Pomocne jest usunięcie wszystkich włosów z obszaru rozciągającego się od pach do okolicy łonowej. Usuń luźno przylegające włosy świeżym wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Ustaw mysz na plecach, leżąc z rozłożonymi przednimi i tylnymi kończynami, aby odsłonić jak największą część ściany brzucha. W razie potrzeby użyj taśmy laboratoryjnej, aby zabezpieczyć nogi w sposób rozłożony.</li>
</ol>
3. Izolacja tętnicy nadbrzusza górnego
<ol>
	<li>Wykonaj małe nacięcie przez skórę tuż nad obszarem łonowym. Upewnij się, że cięta jest tylko skóra, unikając uszkodzenia leżącego poniżej mięśnia brzucha; Przedłuż nacięcie na boki w każdym kierunku na odpowiednie kończyny tylne. Kontynuuj nacięcie rostralnie wzdłuż brzusznej linii środkowej do górnej części klatki piersiowej, a następnie przedłuż nacięcie bocznie w każdym kierunku do odpowiednich kończyn przednich.</li>
	<li>Delikatnie unieś skórę i za pomocą nożyczek przeciąć tkankę łączną przytrzymującą skórę do leżącego poniżej mięśnia, odsłaniając w ten sposób całą powierzchnię mięśni brzucha (patrz ryc. 3A). Przepłukać odsłonięty mięsień 0,9% roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ze względu na mały rozmiar SEA, umieść zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym w celu przeprowadzenia dalszych zabiegów. Podnieś poduszeczkę tłuszczową znajdującą się na dnie mostka za pomocą kleszczy i wykonaj przez nią nacięcie. Kontynuuj nacięcie wzdłuż dolnego żebra, uważając, aby nie wciąć się zbyt głęboko w znajdującą się poniżej tkankę. Strategiczna ocena oddziaływania na środowisko powinna być widoczna; Uważaj, aby go nie uszkodzić. Po zakończeniu nacięcia przepłukać odsłoniętą tkankę 0,9% roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po cofnięciu się górnej warstwy mięśni szkieletowych można łatwo zidentyfikować SEA i leżący pod nim mięsień. Wskazówka: Zanotuj długość SEA in vivo przed izolacją, aby przedłużyć rurki śródbłonka (które skracają się wzdłuż swojej osi po izolacji), aby przybliżyć ich pierwotną długość. Za pomocą kleszczy i nożyczek ostrożnie wytnij cienką warstwę mięśni pod SEA.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy pod kątem przełóż jedwabny szew 6-0 pod SEA i podwiąż tętnicę i przylegającą do niej żyłę, aby utrzymać ją pod ciśnieniem i krew zatrzymaną w świetle naczynia, aby ułatwić wizualizację podczas późniejszej izolacji i czyszczenia.</li>
	<li>Powtórz procedurę podwiązania SEA po stronie przeciwnej.</li>
	<li>Po podwiązaniu obu SEA wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej mięśni brzucha, aby oddzielić odpowiednie strony.</li>
	<li>Przedłuż nacięcie na boki w każdym kierunku, tak jak w przypadku skóry, a następnie kontynuuj nacięcie pionowo wzdłuż zewnętrznej krawędzi, aby całkowicie oddzielić mięsień brzucha od ciała. Unikaj uszkodzenia naczyń krwionośnych zasilanych przez SEA, aby utrzymać światło pod ciśnieniem.</li>
	<li>Przeciąć morze powyżej podwiązania, aby utrzymać szczelność, i umieścić odizolowany mięsień i tętnicę w zlewce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml buforu do preparacji o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz procedurę dla drugiej strony brzucha i inkubuj tkanki w buforze preparacyjnym przez 10 minut.</li>
	<li>Umieścić mięsień brzuszny zawierający SEA w schłodzonej (4 °C) komorze rozwarstwiającej zawierającej bufor preparacyjny (patrz rysunek 3B). Komora preparcyjna składa się z płytki Petriego z warstwą Sylgardu (polidimetylosiloksanu [PDMS]) na dnie.</li>
	<li>Za pomocą szpilek przeciw owadom (0,15 mm) rozciągnij izolowany mięsień morski i mięsień brzucha do przybliżonych długości in vivo (wymienionych powyżej) i przymocuj je do Sylgarda. Wskazówka: Zorientowanie mięśnia w taki sposób, aby cienka warstwa skierowana w stronę otrzewnej znajdowała się na górze, sprawia, że SEA jest łatwo widoczne za pomocą transiluminacji.</li>
	<li>Wykorzystując drobne instrumenty do mikrodysekcji i pracując od górnego miejsca podwiązania w kierunku dolnego końca, oczyść SEA z sparowanej żyły i otaczającej tkanki, aż do pierwszego głównego miejsca rozgałęzienia (1-2 cm). Następnie wytnij SEA, przecinając je tuż nad miejscem odgałęzienia i tuż poniżej podwiązania.</li>
	<li>Aby usunąć krew zatrzymaną w świetle naczynia, należy kanulokować SEA i przepłukać je lodowatym buforem preparacyjnym. Za pomocą kawałka rurki silastycznej przymocuj tylny koniec pipety kaniulacyjnej do strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej lodowaty bufor do rozwarstwiania i zabezpiecz mikropipetę w mikromanipulatorze, aby umieścić jej końcówkę w komorze rozwarstwiania w celu kaniulacji SEA.</li>
	<li>Po wypłukaniu wszystkich erytrocytów wyjmij SEA z pipety kaniulacyjnej i wyjmij pipetę z naczynia rozwarstwiającego.</li>
	<li>Pokrój SEA na mniejsze segmenty o długości 1-3 mm każdy. Te krótsze odcinki ułatwiają izolację rurek śródbłonka.</li>
</ol>
4. Izolacja rurki śródbłonka
<ol>
	<li>Napełnij szklaną probówkę hodowlaną o wymiarach 12 mm x 75 mm do połowy lodowatym buforem do rozwarstwiania. Za pomocą kleszczy pod kątem przenieś kawałki tętnicy do rurki hodowlanej i umieść na lodzie. W tym czasie połączyć enzymy wytrawiające z buforem dysocjacyjnym do końcowej objętości 1 ml w oddzielnej probówce hodowlanej o wymiarach 12 mm x 75 mm (patrz 1.3.2 Roztwory) i podgrzać roztwór do temperatury 37 °C za pomocą bloku grzewczego.</li>
	<li>Podczas gdy bufor dysocjacyjny i enzymy się nagrzewają, ostrożnie odessać bufor rozwarstwiający z probówki hodowlanej, pozostawiając niewielką objętość zawierającą segmenty naczynia.</li>
	<li>Delikatnie dodać bufor dysocjacyjny w temperaturze pokojowej bez enzymów, aby zmyć pozostały bufor rozwarstwiający. Wskazówka: Bufor dysocjacyjny należy dodawać powoli, tak aby fragmenty tętnicy pozostały na dnie probówki hodowlanej, aby zaoszczędzić czas w oczekiwaniu na ich ponowne przemieszczenie. Podnieś temperaturę bufora w wielu krokach od lodu (4 °C) do temperatury pokojowej (~24 °C), do 37 °C, aby zminimalizować wstrząsy.</li>
	<li>Ostrożnie odessać bufor dysocjacyjny z probówki hodowlanej, ponownie upewniając się, że pozostawiono niewielką objętość zawierającą segmenty naczynia.</li>
	<li>Usunąć bufor dysocjacyjny do podgrzewania wstępnego z enzymami z bloku grzewczego, przenieść 1 ml roztworu enzymatycznego do probówki hodowlanej zawierającej segmenty naczynia i umieścić probówkę hodowlaną z powrotem w bloku grzewczym. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji z enzymami należy przygotować pipetę do rozcierania, napełnić ją olejem mineralnym i zabezpieczyć na mikrostrzykawce zamontowanej w mikromanipulatorze. Następnie wycofać tłok mikrostrzykawki, aby napełnić pipetę buforem dysocjacyjnym o stężeniu 2 nl i umieścić końcówkę pipety nad komorą przepływową.</li>
	<li>Pod koniec 30-minutowej inkubacji wyjąć probówkę hodowlaną z bloku grzewczego i ostrożnie zassać bufor jak powyżej.</li>
	<li>Przemyć odcinki tętnicze 4 ml buforu dysocjacyjnego o temperaturze pokojowej. Uwaga: Nie jest już konieczne trzymanie segmentów naczynia na dnie probówki hodowlanej; Naruszenie fragmentów tętnic faktycznie pomaga zapewnić, że resztki enzymów są skutecznie usuwane.</li>
	<li>Przenieść jeden segment naczynia do komory przepływowej, delikatnie zasysając go mikropipetą o pojemności 1 ml, a następnie umieścić go w komorze przepływowej z 1 ml buforu dysocjacyjnego.</li>
	<li>Korzystając z mikromanipulatora zawierającego mikrostrzykawkę, umieść końcówkę pipety do rozcierania w pobliżu jednego końca segmentu naczynia.</li>
	<li>Powoli (225 nl/s) zassać segment naczynia (500 nl wycofany) do pipety trójkowej, aby nie powodować mechanicznego naprężenia ECs, a następnie wyrzucić go z powrotem do komory. Jeśli trawienie zakończyło się sukcesem, komórki mięśni gładkich i przydanka zostaną oddzielone od rurki śródbłonka.</li>
	<li>Powtarzaj triturację, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną zdysocjowane. Należy pamiętać, że nadmierne rozproszenie (4x lub więcej) może uszkodzić EC i sprawić, że przestaną reagować na agonistów. Wskazówka: za pomocą pipety do rozcierania odsuń przydankę od rurki śródbłonka tak szybko, jak to możliwe, aby nie zaplątała się w rurkę. Uwaga: Za pomocą pipety do rozdmuchiwania izolowaną rurkę śródbłonka można odessać i przenieść do oddzielnej komory.</li>
	<li>Umieść rurkę śródbłonka na środku komory przepływowej, wyrównaną wzdłuż kierunku przepływu, i wyjmij pipetę do napełniania.</li>
	<li>Zabezpiecz pipety pinowe w mikromanipulatorach zamontowanych na obu końcach komory przepływowej i umieść ich końcówki na odpowiednich końcach rurki śródbłonka.</li>
	<li>Opuść pipetę przypinającą na jeden koniec probówki, aby docisnąć ją do dna komory. Umieść drugą pipetę do przypinania w ten sam sposób na przeciwległym końcu probówki. Uwaga: Umieszczenie pipet przypinających jest kompromisem między zabezpieczeniem probówki (umieszczenie ich dalej od końca probówki) a umożliwieniem uzyskania większej powierzchni obrazowania/eksperymentu (umieszczenie ich bliżej końca probówki). Dobrze sprawdza się ich zlokalizowanie ~50 μm z każdego końca rury. W momencie, gdy pipeta do przypinania dotyka probówki, powoli cofnij ją wzdłuż osi probówki, wydłużając ją w ten sposób do przybliżonej długości in vivo; Następnie dociśnij pipetę do dna komory, aby zabezpieczyć probówkę.</li>
	<li>Rozpocząć przepływ roztworu do przeprofuzji i pozostawić rurkę śródbłonka na spoczynek przez co najmniej 20 minut, aby zrównoważyła się i przylegała (patrz rysunek 3C). Wykorzystaj pompę perystaltyczną, aby utrzymać stały przepływ płynu (superfuzję) przez rurkę śródbłonka. Uwaga: Pipety przypinające można wyjąć, gdy rurka śródbłonka przyklei się do dna komory przepływowej (~25 min) lub pozostawić na miejscu, aby upewnić się, że rurka śródbłonka nie zostanie przemieszczona.</li>
</ol>
5. Ładowanie barwnika i obrazowanie wapnia
<ol>
	<li>Aby uwidocznić wewnątrzkomórkowe odpowiedzi wapnia, załaduj rurkę śródbłonka barwnikiem fluo-4 AM w temperaturze pokojowej (~24 °C). Zatrzymać przepływ płynu w kąpieli i dodać fluo-4 AM do komory o końcowym stężeniu 10 μM. Odczekać 10 minut, aby barwnik mógł dostać się do komórek, a następnie przelać rurkę śródbłonka świeżym PSS przez 20 minut, aby upewnić się, że barwnik zewnątrzkomórkowy został usunięty, a barwnik wewnątrzkomórkowy został całkowicie zdeestryfikowany.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie wapnia. Do tej pracy użyto mikroskopu pionowego (patrz ryc. 2) wyposażonego w system obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem w temperaturze pokojowej. Wzbudzić fluorescencyjny barwnik wapniowy za pomocą lasera o długości fali 491 nm i uzyskać obrazy (przy emisji 500-550 nm) za pomocą zintensyfikowanej kamery cyfrowej.</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circ. Res. 78, 415-423 (1996).</li>
<li>Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradykinin-induced+release+of+prostacyclin+and+thromboxanes+from+bovine+pulmonary+artery+endothelial+cells.+Studies+with+lower+homologs+and+calcium+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists.</a> Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).</li>
<li>Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+biologically+active+autacoids+is+regulated+by+calcium+influx+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).</li>
<li>Busse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDHF%3A+bringing+the+concepts+together%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">EDHF: bringing the concepts together.</a> Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).</li>
<li>Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-activated+K%2B+channels+in+murine+endothelial+cells%3A+block+by+intracellular+calcium+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium.</a> J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).</li>
<li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries%3A+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).</li>
<li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intercellular+Ca2%2B+signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19, 757-770 (2012).</li>
<li>Cohen, K. D., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+hyperpolarization+is+not+required+for+sustained+muscarinic+agonist-induced+increases+in+intracellular+Ca2%2B+in+arteriolar+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells.</a> Microcirculation. 12, 169-182 (2005).</li>
<li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2%2B+signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).</li>
<li>Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+isoform+expression+in+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells+of+hamster+cheek+pouch+arterioles+and+retractor+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries.</a> Microcirculation. 15, 503-514 (1908).</li>
<li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).</li>
<li>Bagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intravascular+pressure+activates+endothelial+cell+TRPV4+channels%2C+local+Ca2%2B+events%2C+and+IKCa+channels%2C+reducing+arteriolar+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).</li>
<li>Faraci, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+vascular+effects+of+angiotensin+II%3A+new+insights+from+genetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).</li>
<li>Emerson, G. G., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+between+endothelial+cells+and+smooth+muscle+cells+in+hamster+feed+arteries%3A+role+in+vasomotor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control.</a> Circ. Res. 87, 474-479 (2000).</li>
<li>Ledoux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+signaling+in+restricted+spaces+of+myoendothelial+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).</li>
<li>Tran, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Ca2%2B+wavelets+and+the+induction+of+myoendothelial+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).</li>
<li>Nausch, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nerve+stimulation+induces+local+endothelial+Ca2%2B+signals+to+oppose+vasoconstriction+of+mouse+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).</li>
<li>Duza, T., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+endothelial+cell+Ca2%2B+in+response+to+mouse+cremaster+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction.</a> J Physiol. 555, 459-469 (2004).</li>
<li>Colden-Stanfield, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradykinin-induced+increases+in+cytosolic+calcium+and+ionic+currents+in+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 61, 632-640 (1987).</li>
<li>Brunner, F., Kukovetz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioligand+binding+to+muscarinic+receptors+of+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells.</a> Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).</li>
<li>Tracey, W. R., Peach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscarinic+receptor+mRNA+expression+by+freshly+isolated+and+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 70, 234-240 (1992).</li>
<li>Adams, D. J., Hill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li>
<li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li>
</ol>

W tym miejscu opisujemy izolację śródbłonka z SEA i zastosowanie tego preparatu do wizualizacji zdarzeń sygnalizacyjnych Ca2 + w obrębie jego składowych EC. Procedura ta została zaadaptowana z procedury pierwotnie opracowanej w celu wyizolowania śródbłonka z tętniczek mięśnia cremaster8 chomika. Wykorzystując drobne zmiany przedstawionych tu technik, wyizolowaliśmy śródbłonek z różnych łożysk naczyniowych, w tym: tętnic zasilających mięśnia retraktora chomika i tętniczek torebki policzkowej10, tętniczki nadbrzusza górnego górnego myszy6,7,9, tętnice krezkowe i mózgowe myszy oraz mikronaczynia limfatyczne (obserwacje niepublikowane; dołączono odniesienia do izolacji naczyń krezkowych12 i naczyń mózgowych13)). Izolowanie śródbłonka od nowych łożysk naczyniowych może wymagać modyfikacji oryginalnego protokołu. Jeśli izolacja się nie powiedzie, najlepiej zacząć od zmiany czasu trawienia: Wydłuż czas trawienia, jeśli rurki śródbłonka są trudne do wyizolowania od komórek mięśni gładkich i przydanki i skróć czas trawienia, jeśli rurka śródbłonka nie pozostaje nienaruszona. Jeśli zmiana czasu trawienia nie powiedzie się, należy spróbować dostosować stężenie enzymów trawiennych lub temperaturę trawienia. Inną opcją jest zmniejszenie średnicy wewnętrznej pipety cierniowej, co zwiększa siłę ścinającą podczas usuwania komórek mięśni gładkich. Zwiększenie prędkości wyrzutu płynu może być również wypróbowane w celu uzyskania tego samego efektu, ale z większym prawdopodobieństwem uszkodzi preparat. Należy zdawać sobie sprawę, że wyizolowanie nienaruszonych jajowodów śródbłonka z naczyń, w których komórki śródbłonka nie są dobrze połączone ze sobą białkami połączeniowymi, może nie być możliwe.
Dysocjację komórek mięśni gładkich po trawieniu enzymatycznym początkowo przeprowadzono przy użyciu pipetora ręcznego8. Udoskonaliliśmy procedurę trituracji za pomocą systemu mikrostrzykawek, który umożliwił konsekwentną izolację dłuższych rurek śródbłonka (do 3 mm)6. Podczas korzystania z tego systemu pipeta do rozcierania jest napełniana olejem mineralnym, aby zapewnić ciągłą kolumnę płynu między tłokiem sterującym ruchem płynu a PSS zawierającym segment naczynia. Nieściśliwość płynu wraz ze stałą siłą napędową tłoka mikrostrzykawki powoduje ciągłe ścinanie, gdy naczynie jest przepychane przez końcówkę pipety. Natomiast techniki ręczne często stosowane do dysocjacji komórek (np. ściskanie gumowej gruszki na końcu pipety Pasteura) polegają na sprężaniu powietrza, co wprowadza zmienność ciśnienia sterującego, a tym samym ścinanie wywierane na końcówkę pipety.
Przygotowanie rurki do badania funkcji śródbłonka w mikronaczyniach ma wiele zalet. Pierwszym z nich jest to, że proces izolacji zapewnia odrębne, jednorodne natywne populacje komórkowe EC i komórek mięśni gładkich. Ponieważ EC pozostają fizycznie połączone jako rurki, różnią się od pojedynczych komórek mięśni gładkich, które zachowują konfigurację "C", jeśli pozostają rozluźnione podczas trituracji. W ten sposób można łatwo rozróżnić poszczególne typy komórek, np. podczas pobierania próbek do technik molekularnych, takich jak PCR w czasie rzeczywistym i immunohistochemia10. Ponieważ wiele probówek jest izolowanych z jednego naczynia (lub z naczyń dwustronnych, jak ma to miejsce w przypadku SEA), dane molekularne i dane funkcjonalne można uzyskać z tych samych naczyń danego zwierzęcia. W ten sposób ekspresja molekularna może być skorelowana z funkcjonalnym zachowaniem śródbłonka mikronaczyniowego. Co więcej, zarówno wewnątrz-, jak i międzykomórkowe zdarzenia sygnalizacyjne nieodłącznie związane ze śródbłonkiem mikronaczyniowym mogą być rozwiązane niezależnie od wpływu sił hemodynamicznych (ciśnienie, przepływ), czynników wazoaktywnych przenoszonych w krwiobiegu (np. hormonów) lub od otaczających komórek mięśni gładkich (np. poprzez sprzężenie mięśniowo-śródbłonkowe14-16), nerwów17 lub miąższu tkankowego18.
Co ważne, ponieważ śródbłonek jest świeżo wyizolowany z wyznaczonych mikronaczyń, nie ma zmiany fenotypu, która byłaby w inny sposób związana z hodowlą EC19-21. Na przykład, hodowane EC tracą ekspresję receptora muskarynowego, a tym samym zmieniają swoje profile sygnalizacji wapniowej. Co więcej, właściwości elektrofizjologiczne EC mogą się zmieniać w kulturze22. Ponieważ poszczególne EC pozostają sprzężone przez funkcjonalne kanały połączeń szczelinowych, rurka śródbłonka stanowi idealny model do badania przewodzenia sygnałów elektrycznych i Ca2+ między komórkami6,7. Należy również zauważyć, że zdysocjowane komórki mięśni gładkich są łatwo badane za pomocą technik patch-clamp w celu uzyskania uzupełniających danych leżących u podstaw funkcji mikrokrążenia23.
Kluczowym ograniczeniem modelu rurki śródbłonkowej jest niestabilność preparatu wraz ze wzrostem temperatury. Podczas gdy nasze preparaty z SEA okazały się stabilne i zdrowe w temperaturze pokojowej otoczenia (~24 °C) i przez kilka godzin w temperaturze 32 °C, degradacja morfologiczna i funkcjonalna następuje w czasie krótszym niż godzina w temperaturze 37 °C9. Drugim ważnym ograniczeniem rurki śródbłonka jest utrata połączeń mięśniowo-śródbłonkowych i ich nieodłącznych domen sygnałowych, które są integralną częścią funkcji EC w nienaruszonej ścianie naczynia14-16. Należy również zauważyć, że podczas gdy dłuższe rurki umożliwiają badanie sygnalizacji międzykomórkowej na stosunkowo duże odległości6, przygotowanie rurek jest skomplikowane w miarę ich wydłużania, ponieważ coraz trudniej jest w pełni dysocjować otaczające komórki mięśni gładkich i przydanki. Odkryliśmy, że rurki dłuższe niż 1-2 mm są również trudniejsze do ustawienia i zamocowania w komorze przepływowej. W przeciwieństwie do tego, podczas gdy krótsze rurki (np. <1 mm) umożliwiają badanie Ca2+ i sygnałów elektrycznych8, są one trudne do utrzymania podczas superfuzji w komorze przepływowej. Wreszcie, nawet przy optymalnej obustronnej izolacji rurek, nie ma wystarczającego materiału do tradycyjnej kwantyfikacji ekspresji białek przy użyciu zachodnich blotów, chociaż znakowanie immunologiczne zapewnia wskaźnik ekspresji i lokalizacji białka. Pomimo tych ograniczeń, rurka śródbłonka stanowi nowatorski preparat dostarczający nowych informacji na temat mechanizmów funkcjonowania komórek śródbłonka mikronaczyniowego in vivo.

W tym protokole opisujemy izolację rurek komórkowych śródbłonka od mysiego SEA. SEA powstaje z wewnętrznej tętnicy piersiowej i dostarcza natlenioną krew do przedniej części mięśni brzucha. Nasza praca z SEA jako modelem wynika z tego, że dostarcza on stosunkowo długich, nierozgałęzionych segmentów mikronaczyń, które dobrze nadają się do badania zdarzeń sygnalizacji międzykomórkowej leżących u podstaw roli śródbłonka w regulowaniu i koordynowaniu relaksacji komórek mięśni gładkich. Dla osób zainteresowanych tkankami innymi niż mięśnie szkieletowe stwierdziliśmy, że technika ta jest łatwo przystosowana do uzyskiwania rurek śródbłonka z mikronaczyń mózgu, jelit i układu limfatycznego.
Kluczowe cechy tej metody polegają na tym, że nienaruszone długości (1-3 mm) śródbłonka mikronaczyniowego są izolowane, zabezpieczane przed szklanym szkiełkiem nakrywkowym w komorze przepływowej, w której są przerośnięte PSS, i obrazowane dla sygnalizacji Ca2+ 7-9 lub nabijane na pal dla sygnalizacji elektrycznej6,8. W komorze przepływowej górna połowa rurki jest wystawiona na działanie roztworu do superfuzji i reaguje na interwencje eksperymentalne, podczas gdy dolna połowa (w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym) jest chroniona i pozostaje w stanie spoczynku. Oprócz badania zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i międzykomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych Ca2 +, rurki śródbłonka mogą być wykorzystywane do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym do oceny ekspresji genów6,10, immunohistochemii do badania ekspresji białek6,10 oraz badań elektrofizjologicznych do określenia biofizycznych właściwości przewodnictwa elektrycznego6,11.
Istnieje kilka zalet przygotowania rurki śródbłonka do badania funkcji śródbłonka. Po pierwsze, proces izolacji zapewnia proste rozróżnienie między dwiema populacjami komórek: komórkami śródbłonka (które pozostają w tworzeniu rurki) i komórkami mięśni gładkich (indywidualnie zdysocjowanymi; zwykle w kształcie litery "C", gdy są zrelaksowane). Pozwala to na selektywne pobieranie próbek i badanie unikalnych właściwości leżących u podstaw wkładu poszczególnych komórek w funkcjonowanie naczyń krwionośnych. Po drugie, model ten umożliwia rozwiązywanie zdarzeń sygnalizacyjnych właściwych dla śródbłonka, niezależnie od wpływu przepływu krwi, otaczających mięśni gładkich, nerwów i miąższu. Po trzecie, śródbłonek jest badany świeżo wyizolowany, co pozwala uniknąć zmian w ekspresji genów lub białek związanych z hodowlą komórkową.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Nitroprusydek sodu</td><td>Sigma</td><td>431451</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td> Produkty <td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P-4762</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C-8051</td><td></td></tr><tr><td>Dithioerythritol</td><td>Sigma</td><td>D-8255</td><td></td></tr><tr><td>Szkło boroscilicate (pipety do kaniulacji i pinów)</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-4</td><td></td></tr><tr><td>Szkło boroscilicate (pipety Trituration)</td><td>World Precision Instruments</td><td>4897</td><td></td></tr><tr><td>Nanolitr Injector Microsyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>B203MC4</td><td>zaktualizowany do Nanoliter 2010 z Nanoliter 2000</td></tr><tr><td>Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Probówki hodowlane</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>3-osiowy mikromanipulator</td><td>Siskiyou Corp</td><td>DT3-100</td><td>Trzymanie i ustawianie pipet</td></tr> <tr><td>przypinającychKomora przepływowa</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &micro; l Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td>Do przenoszenia przetrawionego segmentu naczynia do komory przepływowej</td></tr><tr><td>1 ml Końcówki do pipet</td><td>Fisher</td><td>02-707-405</td><td>Do przenoszenia przetrawionego segmentu naczynia do komory przepływowej</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td>Rzeczywisty mikroskop zależy od użytkownika</td></tr><tr><td>System konfokalny z wirującym dyskiem Obrazowanie konfokalne</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>jest opcjonalne</td></tr><tr><td>Kamera XR/TURBO EX Stanford</td><td>Photonics</td><td>XR/TURBO EX</td><td>Idealny dla naszych potrzeb; może się różnić w zależności od użytkownika</td></tr><tr><td>Piper Control Software</td><td>Oprogramowanie do obrazowania Stanford Photonics</td><td></td><td>dla kamery TURBO EX</td></tr><tr><td>Stereo Microscrope</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td>może się różnić w zależności od użytkownika</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodysekcji</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5/45</td><td></td></tr><tr><td>Minutiens Szpilki do owadów</td><td>Austerlitz</td><td>Rozmiar M 0,15 mm</td><td></td></tr><tr><td>GP Millipore Express PLUS Membrana</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do punktowania pipet</td><td>Austin Flameworks</td><td>Małe ręczne narzędzie do punktowania</td><td>austinflameworks.com</td></tr><tr><td>kompaktowy trymer dla zwierząt</td><td>Wahl Clipper Corp.</td><td>Model 9966</td><td>Dobrze wyczyść po każdym użyciu, aby zachować żywotność</td></tr></tbody></table>

izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Kontrola przepływu krwi przez układ naczyniowy reguluje dopływ tlenu i składników odżywczych wraz z usuwaniem produktów ubocznych przemiany materii, czego przykładem jest ćwiczenie mięśni szkieletowych. Komórki śródbłonka (EC) wyściełają błonę wewnętrzną wszystkich naczyń oporowych i odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu średnicy (np. zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń krwionośnych), a tym samym wielkości i dystrybucji przepływu krwi w tkankach. Regulacja oporu naczyniowego przez EC odbywa się poprzez wewnątrzkomórkową sygnalizację Ca2+, która prowadzi do wytwarzania dyfuzyjnych autakoidów (np. metabolitów tlenku azotu i kwasu arachidonowego)1-3 i hiperpolaryzacji4,5, które wywołują rozluźnienie komórek mięśni gładkich. Tak więc zrozumienie dynamiki śródbłonkowej sygnalizacji Ca2 + jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia mechanizmów rządzących kontrolą przepływu krwi. Izolowanie śródbłonka eliminuje zmienne zakłócające związane z krwią w świetle naczynia oraz z otaczającymi komórkami mięśni gładkich i nerwami okołonaczyniowymi, które w przeciwnym razie wpływają na strukturę i funkcję EC. W tym artykule przedstawiono izolację śródbłonka z tętnicy nadbrzusza górnego (SEA) przy użyciu protokołu zoptymalizowanego dla tego naczynia.
Aby odizolować rurki śródbłonka od znieczulonej myszy, SEA jest podwiązane in situ, aby utrzymać krew w świetle naczynia (aby ułatwić jej wizualizację podczas sekcji), a cały arkusz mięśni brzucha jest wycinany. SEA jest wycinane z otaczających włókien mięśni szkieletowych i tkanki łącznej, krew jest wypłukiwana ze światła i przeprowadza się łagodne trawienie enzymatyczne, aby umożliwić usunięcie przydanek, nerwów i komórek mięśni gładkich za pomocą delikatnego rozcierania. Te świeżo wyizolowane preparaty nienaruszonego śródbłonka zachowują swoją natywną morfologię, przy czym poszczególne EC pozostają funkcjonalnie sprzężone ze sobą, zdolne do przenoszenia sygnałów chemicznych i elektrycznych międzykomórkowo przez połączenia szczelinowe6,7. Oprócz dostarczania nowych informacji na temat sygnalizacji wapniowej i biofizyki błon, preparaty te umożliwiają badania molekularne ekspresji genów i lokalizacji białek w natywnym śródbłonku mikronaczyniowym.

Reakcje wapniowe w świeżo izolowanych rurkach śródbłonkowych można zainicjować za pomocą acetylocholiny (ACh). W tym filmie rurka śródbłonkowa obciążona 10 µM fluo-4 AM jest stymulowana poprzez superfuzję 1 µM ACh (Film 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>. Barwnik jest wzbudzany przy 491 nm, a emisję rejestruje się w zakresie 500-550 nm przy użyciu kamery z wzmocnionym urządzeniem sprzężonych ładunków (ICCD). Stosy obrazów są pozyskiwane z częstotliwością 120 klatek/s przez okres 25 s, a następnie mogą zostać uśrednione (np. do 40 klatek/s). Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne w czasie przedstawiono na Rysunku 4.
<img alt="Schemat równowagi statycznej z zestawem mikropipet, obrazy mikroskopowe pokazujące proces kapilarny." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Komora przepływowa i pipety używane podczas izolacji rurek śródbłonkowych. A) Komora przepływowa z przeszkloną podstawką o wymiarach 24 mm x 50 mm. B) Przykłady pipety do kaniulacji wyciągniętej (lewo) oraz wyciągniętej, złamanej, wypolerowanej i ściętej pod kątem (prawo). Pipeta ta służy do wypłukiwania erytrocytów z światła tętnicy po sekcji. Pasek skali = 200 µm. C) Przykłady pipety do tryturacji wyciągniętej (lewo) oraz wyciągniętej, złamanej i wypolerowanej (prawo). Średnica wewnętrzna tej pipety jest określona przez średnicę zewnętrzną tętnicy. Pasek skali = 200 µm. D) Przykłady pipety do mocowania wyciągniętej (lewo) oraz wyciągniętej, złamanej i wypolerowanej (prawo). Końcówka tej pipety jest zaoblona i całkowicie zamknięta, aby unieruchomić rurkę śródbłonkową w komorze przepływowej. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Układ mikroskopowy do wzbudzania optycznego; obejmuje jednostkę Yokogawa, mikroskop oraz obiektywy do analizy." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem do obrazowania sygnałów Ca2+. A) Mikroskop pionowy użyty do obrazowania wapnia. B) (a) Jednostka konfokalna z wirującym dyskiem z (b) wzmocnioną kamerą CCD (intensified charge coupled device). C) Obiektywy imersyjne (a) 63X (NA = 1) oraz (b) 20X (NA = 0.5) użyte do obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Proces wycinania tkanki serca, przygotowanie eksplantatu, mikrostruktura włókien kolagenowych, obraz mikroskopowy." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Izolacja mięśnia brzusznego i tętnicy nadbrzusznej powierzchownej. A) Znieczulona mysz z odsłoniętym mięśniem brzusznym, przemywanym 0,9% roztworem soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej. Czerwone strzałki wskazują miejsca pod poduszeczkami tłuszczowymi, w których poszczególne SEA wchodzą w każdy mięsień prosty brzucha (t.j. miejsca, w których naczynia powinny zostać podwiązane). Pasek skali = 1 cm. B) Izolowany mięsień brzuszny (jednostronny) i SEA przypięte w komorze sekcyjnej do mikrodysekcji. Czerwona strzałka wskazuje pierwsze główne miejsce rozgałęzienia SEA (t.j. punkt, w którym kończy się oczyszczanie naczynia). Pasek skali = 1 cm. C) Izolowana rurka komórek śródbłonka z SEA. Obraz z kontrastowym interferencyjnym mikroskopem różnicowym rurki śródbłonka po 1 hr inkubacji w temperaturze pokojowej. Rurka śródbłonka była przepływana buforem do superfuzji z prędkością 3 ml/min. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Seria obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej pokazująca zmiany w sygnalizacji wapniowej w warstwach komórek w czasie." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Fluorescencja wapnia w rurce z komórek śródbłonka. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne rurki śródbłonkowej w odpowiedzi na stymulację 1 µM acetylocholiny. A) Fluorescencja przed stymulacją. B) fluorescencja rurki śródbłonkowej w momencie podania acetylocholiny, t=0 sec. C) fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=5 sec. D) fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=10 sec. E) fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=15 sec. F) fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=20 sec. Paski skali = 40 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie rurek komórek śródbłonka z tętnicy nadbrzusznej górnej myszy (ang. SEA), aby zbadać dynamikę sygnalizacji wewnątrz- i międzykomórkowej w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie SEA ze ściany mięśni szkieletowych brzucha myszy. W drugim kroku naczynie jest poddawane delikatnemu trawieniu somatycznemu, a następnie ostrożnej technice TAT, aby oddzielić komórki mięśni gładkich i błonę zewnętrzną od rurki komórek śródbłonka.W ostatnim kroku probówkę mocuje się w komorze przepływowej i poddaje perfuzji roztworem soli fizjologicznej. Ostatecznie można zastosować obrazowanie konfokalne w celu wizualizacji sygnalizacji wapniowej w natywnej, nienaruszonej rurce śródbłonkowej mikronaczyniowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla komórek śródbłonka, jest fakt, że komórki śródbłonka tworzące rurkę zachowują swoją natywną morfologię, ekspresję białek i responsywność. Śródbłonek jest integralną częścią kontroli przepływu krwi w całym organizmie.Zastosowanie tej techniki pozwala na badanie zdarzeń sygnalizacji międzykomórkowej pośredniczącej w kontroli przepływu krwi oraz tego, w jaki sposób mogą one ulec zaburzeniu podczas dysfunkcji naczyniowych. Aby wyizolować SEA, w pierwszej kolejności należy wykonać małe nacięcie skóry tuż nad obszarem regionu łonowego u znieczurzonej myszy, rozszerzyć nacięcie bocznie w każdym kierunku w stronę odpowiednich kończyn tylnych, a następnie kontynuować nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej brzusznej do górnej części klatki piersiowej, rozszerzając je dalej bocznie w każdym kierunku w stronę odpowiednich czterech kończyn. Następnie należy delikatnie unieść skórę i przeciąć tkankę łączną wiążącą skórę z leżącym pod nią mięśniem, odsłaniając całą powierzchnię mięśni brzucha.Omyj odsłonięty mięsień roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej. Następnie, korzystając ze stereomikroskopu, unieś poduszkę tłuszczową znajdującą się u podstawy mostka. Wykonaj nacięcie przez poduszkę tłuszczową wzdłuż dolnego żebra.SEA powinno być teraz widoczne; uważając, aby nie uszkodzić tętnicy, należy przemyć odsłoniętą tkankę dodatkowym roztworem soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej. Po odsunięciu górnej warstwy mięśnia szkieletowego należy zmierzyć długość SEA, a następnie ostrożnie wyciąć cienką warstwę mięśniową znajdującą się pod tętnicą. Następnie, używając pęsety kleszczykowej, należy przeprowadzić nitkę szwu jedwabnego 6-0 pod SCA.Następnie podwiąż tętnicę oraz sąsiadującą z nią żyłę, aby utrzymać ciśnienie i zatrzymać krew w świetle naczynia. Po podwiązaniu SCA po stronie przeciwległej wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej mięśni brzucha, aby rozdzielić obie strony, a następnie rozszerz nacięcie bocznie w każdym kierunku, analogicznie do nacięcia skóry. Kontynuuj nacięcie pionowo wzdłuż zewnętrznej krawędzi, aby całkowicie oddzielić mięśnie brzucha od ciała.Następnie przetnij SEA powyżej miejsca ligacji, aby zachować szczelność, i umieść wyizolowany mięsień oraz tętnicę w zlewce o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów buforu do sekcji w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Po wyizolowaniu mięśnia z drugiej strony brzucha, inkubuj tkanki w buforze do sekcji przez 10 minut. Teraz umieść mięsień brzuszny zawierający SEA w czarence Petri w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza, pokrytej warstwą cyl guard i zawierającej bufor do sekcji. Użyj szpilek entomologicznych 0,15 milimetra, aby rozciągnąć SEA i mięsień do ich wcześniej odnotowanych przybliżonych długości in vivo.Przymocuj SEA do osłony cylindra, orientując mięsień tak, aby cienka warstwa skierowana w stronę otrzewnej znajdowała się na górze. Następnie, przesuwając się od miejsca podwiązania w górze strumienia w stronę końcowego odcinka, oddziel około jednego do dwóch centymetrów SEA od odpowiadającej jej żyły i otaczających tkanek, aż do pierwszego głównego miejsca rozgałęzienia. Przetnij SEA tuż powyżej miejsca rozgałęzienia i tuż poniżej miejsca podwiązania.Następnie za pomocą odcinka elastycznego przewodu przymocuj tylną część pipety do strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej lodowaty bufor do sekcji. Przymocuj końcówkę pipety do kanulacji w komorze sekcyjnej i przeprowadź kanulację SEA. Po wypłukaniu wszystkich erytrocytów wyjmij SEA z pipety do kanulacji, a następnie wyjmij pipetę z naczynia sekcyjnego, aby wyizolować rurki śródbłonka.Najpierw szklaną probówkę do hodowli o wymiarach 12 by 75 mm należy wypełnić do połowy lodowatym buforem do sekcji. Następnie, po pocięciu SEA na kawałki o wielkości od jeden do trzech milimetrów, za pomocą pęsety kątowej przenieść fragmenty tętnic do probówki i umieścić ją na lodzie. W kolejnym kroku, w oddzielnej probówce do hodowli o wymiarach 12 by 75 mm, połączyć enzymy trawienne z buforem do dysocjacji do końcowej objętości 1 mL, a następnie podgrzać roztwór enzymów do 37 °C za pomocą bloku grzejnego.Wyjmij probówkę z hodowlą zawierającą fragmenty tętnic z temperatury 4°C i pozostaw ją w temperaturze pokojowej do ogrzania, podczas gdy roztwór enzymów jest ogrzewany do 37°C. Ostrożnie odessij bufor do sekcji, który osiągnął już temperaturę pokojową, pozostawiając w probówce niewielką objętość zawierającą segmenty naczyń. Następnie powoli dodaj do segmentów naczyń bufor do dysocjacji bez enzymów w temperaturze pokojowej, tak aby fragmenty tętnic pozostały na dnie probówki, w celu wypłukania resztek buforu do sekcji.Gdy roztwór enzymu osiągnie 37 °C, ponownie odessaj bufor dysocjujący z probówki hodowlanej zawierającej segmenty naczyń, pozostawiając niewielką objętość cieczy z segmentami. Następnie przenieś podgrzany do 37 °C roztwór enzymu do probówki hodowlanej i inkubuj ją w bloku grzewczym przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Podczas inkubacji przygotuj pipetę literacyjną wypełnioną olejem mineralnym, nacinij pipetę, wykonaj czyste przełamanie, odłam końcówkę pipety za pomocą pęsety w ogniu, wypoleruj jej wierzchołek i zamocuj ją w mikrosτρzykawce zamontowanej w mikromanipulatorze.Następnie wycofaj tłok mikrosstrzykawki, aby napełnić pipetę dwiema nanolitrami buforu do dysocjacji, i umieść końcówkę pipety nad komorą przepływową po zakończeniu inkubacji. Po ostrożnym odessaniu buforu, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, przemyj segmenty tętnic czterema mililitrami buforu do dysocjacji o temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie odessij jeden segment naczynia za pomocą mikropipety o objętości jednego mililitra i umieść naczynie w komorze przepływowej zawierającej jeden mililitr buforu do dysocjacji.Umieść końcówkę pipety do tacji w pobliżu jednego z końców segmentu naczynia, a następnie wciągnij segment naczynia do pipety z prędkością około 225 nanoliters per second, aby nie wywołać naprężeń mechanicznych w komórkach śródbłonka, po czym wypuść naczynie z powrotem do komory. Jeśli trawienie przebiegło pomyślnie, komórki mięśni gładkich i błona zewnętrzna zostaną oddzielone od rurki śródbłonka. Jak najszybciej odsuń błonę zewnętrzną od rurki śródbłonka, aby zapobiec jej zaplątaniu, a następnie powtarzaj tację w sposób zaprezentowany powyżej, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną oddzielone.Po ostatniej iteracji, ASEE umieścił wyizolowaną rurkę śródbłonka w centrum komory przepływowej, wyrównując ją zgodnie z kierunkiem przepływu, a następnie usunął pipetę spustową. Unieruchomiono pipety mocujące w mikromanipulatorach zamontowanych na obu końcach komory przepływowej, a następnie ustawiono ich końcówki na odpowiednich końcach rurki śródbłonka. Opuszczono pipety mocujące, po jednej na przeciwległych końcach rurki, dociskając rurkę do dna komory w odległości około 50 µm od każdego końca rurki.W momencie, gdy pipeta mocująca dotknie probówki, powoli wycofaj ją wzdłuż osi probówki, wysuwając ją do przybliżonej długości in vivo. Przyciśnij pipetę do dna komory, aby unieruchomić probówkę, a następnie uruchom przepływ roztworu perfuzyjnego za pomocą pompy perystaltycznej, aby utrzymać stały przepływ roztworu perfuzyjnego przez śródbłonkową probówkę. Na tym obrazie uzyskanym za pomocą kontrastowego różnicowania interferencyjnego przedstawiono izolowaną śródbłonkową probówkę komórkową z SEA po jednogodzinnej perfuzji buforem perfuzyjnym z prędkością 3 mL/min w temperaturze pokojowej.Film ten przedstawia odpowiedzi wapniowe rurki z komórek śródbłonka załadowanych barwnikiem fluo-4 w odpowiedzi na stymulację acetylocholiną w stężeniu 1 µM. Te reprezentatywne obrazy fluorescencyjne zostały zarejestrowane w różnych punktach czasowych po stymulacji rurki śródbłonka acetylocholiną. Zwróć uwagę, jak stężenie wapnia wewnątrzkomórkowego oscyluje w czasie.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby unikać mechanicznego uszkadzania rurki śródnaczyniowej podczas jej pozycjonowania i przypinania, ponieważ komórki śródnaczyniowe są niezwykle delikatne i podatne na uszkodzenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak izolować rurki śródnaczyniowe z górnej tętnicy brzusznej myszy, a tym samym badać natywne, nienaruszone śródbłonie mikronaczyniowe.

isolation-microvascular-endothelial-tubes-from-mouse-resistance

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja mikronaczyń śródbłonkowych z mysich tętnic oporu

Ten film demonstruje metodę izolowania przewodów śródbłonkowych od miąższu mózgu myszy. Dzięki połączeniu trawienia enzymatycznego i dysocjacji mechanicznej, proces ten daje nienaruszoną rurkę z komórkami śródbłonka.

Przygotowanie śródbłonka mózgowego z tętniczek miąższowych myszy

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Poznaj metodę izolacji śródbłonka mikronaczyniowego z tętnicy górnej powłokowej myszy do badania sygnalizacji wapniowej w komórkach endotelialnych z zachowaniem ich natywnej morfologii.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Przeglądaj więcej filmów