Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie jajowodów śródbłonka z górnej tętnicy nadbrzusza myszy lub SEA w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wewnątrz- i międzykomórkowej natywnego nienaruszonego śródbłonka mikronaczyniowego. Osiąga się to poprzez najpierw odizolowanie SEA od ściany mięśni szkieletowych brzucha myszy. W drugim etapie naczynie jest delikatnie i somatycznie trawione, a następnie ostrożnie TATowane w celu oddzielenia komórek mięśni gładkich i przydanki od rurki komórkowej śródbłonka.

W ostatnim etapie rurka jest zabezpieczana w komorze przepływowej i super łączona z fizjologicznym roztworem soli fizjologicznej. Ostatecznie obrazowanie konfokalne można wykorzystać do wizualizacji sygnalizacji wapniowej w natywnej nienaruszonej śródbłonku mikronaczyniowym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla komórek śródbłonka, jest to, że komórki śródbłonka, które tworzą rurkę i utrzymują swoją natywną morfologię, ekspresję białka i reagowanie, śródbłonek jest integralną częścią kontroli przepływu krwi w całym ciele.

Zastosowanie tej techniki pozwala nam zbadać zdarzenia sygnalizacyjne między komórkami, które pośredniczą w kontroli przepływu krwi i jak mogą one przebiegać nieprawidłowo podczas dysfunkcji naczyń krwionośnych. Aby wyizolować SEA, najpierw wykonaj małe nacięcie przez skórę tuż nad obszarem łonowym znieczulonej myszy, przedłuż nacięcie bocznie w każdym kierunku do odpowiednich kończyn tylnych, a następnie kontynuuj nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej do górnej części klatki piersiowej, dalej przedłużając nacięcie bocznie w każdym kierunku do odpowiednich czterech kończyn. Teraz delikatnie unieś skórę i odetnij tkankę łączną trzymającą skórę do leżącego poniżej mięśnia, odsłaniając całą powierzchnię mięśni brzucha.

Przepłukać odsłonięty mięsień roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym podnieś poduszeczkę tłuszczową znajdującą się na dnie mostka. Wykonaj nacięcie przez poduszeczkę tłuszczową i wzdłuż dolnego żebra.

SEA powinno być teraz widoczne, uważając, aby nie uszkodzić tętnicy, przepłukać odsłoniętą tkankę roztworem soli o temperaturze pokojowej. Po cofnięciu się górnej warstwy mięśni szkieletowych zwróć uwagę na długość SEA, a następnie ostrożnie wytnij cienką warstwę mięśni pod tętnicą. Następnie użyj kleszczy pod kątem, aby przeciągnąć pod NZK długość sześciu jedwabnych szwów.

Następnie podwiązaj tętnicę i przylegającą do niej żyłę, aby utrzymać ciśnienie i utrzymać krew zatrzymaną w świetle naczynia. Po podwiązaniu NZK po stronie przeciwległej, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej mięśni brzucha, aby oddzielić odpowiednie strony, a następnie przedłuż nacięcie na boki w każdym kierunku, tak jak ma to miejsce w przypadku skóry. Kontynuuj nacięcie pionowo wzdłuż zewnętrznej krawędzi, aby całkowicie oddzielić mięsień brzucha od ciała.

Następnie przeciąć SEA powyżej podwiązania, aby utrzymać uszczelnienie i umieścić izolowany mięsień i tętnicę w 50-mililitrowej zlewce zawierającej 10 mililitrów buforu do preparacji o czterech stopniach Celsjusza. Po wyizolowaniu mięśnia z drugiej strony brzucha inkubuj tkanki w buforze preparacyjnym przez 10 minut. Teraz umieść mięsień brzuszny zawierający SEA na szalce Petriego o temperaturze czterech stopni Celsjusza pokrytej warstwą osłony cylindra i zawierającej bufor rozwarstwiający Użyj 0,15 milimetra szpilek do owadów, aby rozciągnąć SEA i mięśnie do ich wcześniej zanotowanych przybliżonych długości in vivo.

Przymocuj SEA do osłony cylindra, ustawiając mięsień tak, aby cienka warstwa skierowana w stronę otrzewnej znajdowała się na górze. Następnie pracując od górnego miejsca podwiązania w kierunku dolnego końca, oczyść około jednego do dwóch centymetrów SEA od sparowanej żyły i otaczającej tkanki aż do pierwszego głównego miejsca rozgałęzienia. Przeciąć MORZE tuż nad miejscem odgałęzienia i tuż pod podwiązaniem.

Następnie użyj kawałka elastycznej rurki, aby przymocować tylną część pipety do pięciomililitrowej strzykawki zawierającej lodowaty bufor do rozwarstwiania. Zamocuj końcówkę pipety kaniulacyjnej w komorze rozwarstwiania i kaniuluj SEA. Następnie, gdy wszystkie erytrocyty zostaną wypłukane, usuń SEA z pipety kaniulacyjnej i wyjmij pipetę z naczynia separacyjnego, aby wyizolować rurki śródbłonka.

Najpierw napełnij szklaną probówkę hodowlaną o wymiarach 12 na 75 milimetrów do połowy lodowatym buforem do rozwarstwiania. Następnie, po pocięciu SEA na kawałki o długości od jednego do trzech milimetrów, użyj kleszczy pod kątem, aby przenieść kawałki tętnicy do probówki hodowlanej i umieść rurkę na lodzie. Następnie połącz enzymy trawiące z buforem dysocjacyjnym do końcowej objętości jednego mililitra w oddzielnej probówce hodowlanej o wymiarach 12 na 75 milimetrów i podgrzej roztwór enzymu do 37 stopni Celsjusza za pomocą bloku grzewczego.

Wyjmij probówkę hodowlaną zawierającą fragmenty tętnicy z czterech stopni Celsjusza i umieść ją w temperaturze pokojowej, aby się rozgrzała, podczas gdy roztwór enzymu ogrzewa się do 37 stopni Celsjusza. Ostrożnie odessać bufor do rozwarstwiania o temperaturze pokojowej z probówki hodowlanej, pozostawiając niewielką objętość zawierającą segmenty naczynia. Teraz powoli dodaj do segmentów naczynia bufor dysocjacyjny o temperaturze pokojowej bez enzymów, tak aby kawałki tętnic pozostały na dnie probówki hodowlanej, aby zmyć pozostały bufor rozwarstwiający.

Gdy roztwór enzymu osiągnie temperaturę 37 stopni Celsjusza, należy ponownie odessać bufor dysocjacyjny z probówki hodowlanej zawierającej segmenty naczynia, pozostawiając niewielką objętość zawierającą segmenty naczynia. Teraz przenieś roztwór enzymatyczny o temperaturze 37 stopni do probówki hodowlanej i inkubuj probówkę hodowlaną w bloku grzewczym przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas inkubacji należy przygotować pipetę literacyjną wypełnioną olejem mineralnym, naciąć pipetę, zrobić czystą przerwę, rozbić pipetę ogniem kleszczowym, wypolerować końcówkę pipety i zabezpieczyć ją na mikrostrzykawce zamontowanej w mikromanipulatorze.

Następnie wycofać tłok mikrostrzykawki, aby napełnić pipetę dwoma nanolitrami buforu dysocjacyjnego i umieścić końcówkę pipety nad komorą przepływową pod koniec inkubacji. Po dokładnym zassaniu buforu, jak właśnie pokazano, przemyć odcinki tętnic czterema mililitrami buforu dysocjacyjnego w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie odessać jeden segment naczynia za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra i umieścić naczynie w komorze przepływowej z jednym mililitrem buforu dysocjacyjnego.

Umieść końcówkę pipety tacyjnej w pobliżu jednego końca segmentu naczynia, a następnie zassaj segment naczynia do pipety do objętości około 225 nanolitrów na sekundę, aby nie powodować mechanicznego obciążenia komórek śródbłonka, wyrzuć naczynie z powrotem do komory. Jeśli trawienie zakończyło się sukcesem, komórki mięśni gładkich i przydanka zostaną oddzielone od rurki śródbłonka. Odsuń przydankę od rurki śródbłonka tak szybko, jak to możliwe, aby nie splątała się z rurką, a następnie powtórz tę czynność, jak właśnie pokazano, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną zdysocjowane.

Po ostatniej iteracji ASEE i umieścił izolowaną rurkę śródbłonka na środku komory przepływowej, wyrównał wzdłuż kierunku przepływu i usunął pipetę wyzwalającą. Zamocuj pipety kołkowe w mikromanipulatorach zamontowanych na obu końcach komory przepływowej, a następnie umieść ich końcówki na odpowiednich końcach rurki śródbłonka. Opuść pipety przypinające, jedna po drugiej, na przeciwległe końce probówki, dociskając rurkę do dna komory, około 50 mikrometrów od każdego końca probówki.

W momencie, gdy pipeta do przypinania dotyka probówki, powoli wsuń ją wzdłuż osi probówki, wydłużając ją do przybliżonej długości in vivo. Dociśnij pipetę do dna komory, aby zabezpieczyć probówkę, a następnie rozpocznij przepływ roztworu do superfuzji za pomocą pompy perystaltycznej, aby utrzymać stały przepływ roztworu do superfuzji przez rurkę śródbłonka. Na tym obrazie kontrastu interferencyjnego pokazano izolowaną rurkę komórkową śródbłonka z SEA po jednogodzinnej superfuzji z buforem superfuzyjnym o stężeniu trzech mililitrów na minutę w temperaturze pokojowej.

Ten film pokazuje reakcje wapniowe rurki z komórkami śródbłonka wypełnionymi grypą lub czterema w odpowiedzi na jednomikromolową stymulację acetylocholiny. Te reprezentatywne obrazy fluorescencyjne zostały zebrane w różnych punktach czasowych po stymulacji rurki śródbłonka acetylocholiną. Zwróć uwagę, jak wewnątrzkomórkowy wapń oscyluje w czasie.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać mechanicznego uszkodzenia rurki śródbłonka podczas tripozycjonowania i przypinania, ponieważ komórki śródbłonka są niezwykle delikatne i łatwo ulegają uszkodzeniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wyizolować rurki śródbłonka z górnej tętnicy nadbrzusza myszy, a tym samym zbadać natywny nienaruszony śródbłonek mikronaczyniowy.