Name: Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie wirusem RSV. Ta metoda pozwala analizować aktywację szlaków zapalnych i oceniać odpowiedź immunologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RSV A2 został uprzejmie dostarczony przez Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Holandia). MV i GF są wspierane przez konsorcjum Virgo, finansowane przez projekt rządu holenderskiego numer FES0908 oraz przez projekt Netherlands Genomics Initiative (NGI) o numerze 050-060-452. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Uwaga:
Eksperymenty z HRSV muszą być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Należy zebrać wszystkie odpady wirusowe oraz materiały, które miały kontakt z wirusem, w celu ich właściutrzenia ze względu na zagrożenia biologiczne.
Należy zachować szczególne środki ostrożności podczas pracy z potencjalnie zainfekowaną ludzką krwią.
Kluczowe jest stosowanie odczynników wolnych od endotoksyn we wszystkich protokołach.
1. Hodowla HRSV A2
<ol>
	<li>Hodować komórki HeLa lub HEp-2 w medium DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) w kolbie hodowlanej o powierzchni 175 cm2 aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 50%.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie w temperaturze pokojowej roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).</li>
	<li>Rozmrozić fiolkę z wirusem HRSV z zapasu zasiewowego (seeding stock) w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć zapas wirusa w taki sposób, aby utrzymać MOI na poziomie 0,1 lub niższym. Zapobiegnie to powstawaniu wadliwych cząstek interferujących (DIPs). Rozcieńczyć zapas wirusa w 4 ml/kolbę medium do infekcji (DMEM + 1% P/S) i dodać do komórek HeLa lub HEp-2. Utrzymać tę objętość na jak najniższym poziomie, tak aby nie doprowadzić do wyschnięcia komórek. Im mniejsza objętość, tym wyższy będzie stopień infekcji.</li>
	<li>Inkubować przez 2-4 h w 37 °C, 5% CO2. Co 15 min delikatnie potrząsać kolbą, aby redystrybuować medium.</li>
	<li>Usunąć inokulum i przemyć jednokrotnie PBS.</li>
	<li>Dodać 15 ml medium hodowlanego (DMEM + 10%FCS + 1% P/S) i inkubować przez 3-5 dni w 37 °C, 5% CO2. Obserwować komórki za pomocą standardowej mikroskopii w jasnym polu pod kątem wirusowych zmian cytopatologicznych, np. tworzenia się syncytiów, śmierci komórek i obecności komórek pływających.</li>
	<li>Po wystąpieniu zmian cytopatologicznych zebrać HRSV poprzez zeskrobanie komórek i zgromadzić zawiesinę wirusową w sterylnej probówce 50 ml. Poddać zawiesinę komórkową działaniu wortexa. Zeskrobanie i wortexowanie komórek uwalnia więcej cząstek wirusowych.</li>
	<li>Wirować zawiesinę wirusową przez 10 min w temperaturze pokojowej przy 1,800 x g w celu osadzenia szczątków komórkowych. HRSV w supernatancie nie osadza się przy tej prędkości, zatem supernatant można bezpośrednio wykorzystać do zainfekowania wielu kolb 175 cm2 lub przechowywać w -80 °C jako zapas zasiewowy w alikwotach po 1 ml do przyszłego użycia. Zawsze zamrażać HRSV gwałtownie w ciekłym azocie, aby zapobiec utracie zakaźnych cząstek wirusa.</li>
	<li>Jak wspomniano powyżej, zapas zasiewowy przygotowany według powyższego protokołu służy do infekcji wielu kolb hodowlanych 175 cm2. Powtórzyć dokładnie ten sam protokół, aby uzyskać więcej wirusa do oczyszczania. W jednym cyklu ultrawirowania można oczyścić do 180 ml zawiesiny wirusowej.</li>
	<li>Po wystąpieniu zmian cytopatologicznych zebrać HRSV poprzez zeskrobanie komórek i zgromadzić supernatant. Poddać zawiesinę wirusową działaniu wortexa. Wirować przez 10 min w temperaturze pokojowej przy 1,800 x g w celu osadzenia szczątków komórkowych. HRSV w supernatancie nie osadza się przy tej prędkości i supernatant rozdzielić na alikwoty po 15 ml do probówek 50 ml. Zamrozić gwałtownie i przechowywać w -80 °C do czasu oczyszczania.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie HRSV
Uwaga: Przed użyciem ultrawirówki należy pamiętać, że jest to potencjalnie niebezpieczne urządzenie. Należy zapoznać się z instrukcjami obsługi i przeprowadzić pierwsze wirowanie w ultrawirówce pod nadzorem osoby z doświadczeniem.
<ol>
	<li>Oczyścić koszyki do ultrawirowania 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>W każdym koszyku umieścić sterylną probówkę do wirowania.</li>
	<li>Przygotować 30% (w/v) roztwór sacharozy w PBS, poddać sterylizacji filtracyjnej (filtr 0.2 μm) i dodać 5 ml na dno każdej probówki do wirowania. W celu przyspieszenia protokołu probówki z roztworem sacharozy można zamrozić. Należy dopilnować zachowania sterylności.</li>
	<li>Jeśli roztwór sacharozy nie został zamrożony, bardzo ostrożnie dodać 30 ml roztworu HRSV na wierzch roztworu sacharozy. Pipetować powoli, aby nie zaburzyć warstwy sacharozy. Należy zachować wyraźną granicę między fazami. Jeśli probówki były zamrożone, nalać zawiesinę wirusową na zamrożony roztwór sacharozy, a następnie pozostawić do rozmrożenia.</li>
	<li>Bardzo ostrożnie zrównoważyć sześć koszyków do ultrawirowania za pomocą sterylnego PBS. Wagę należy umieścić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować sterylność. Napełniać probówki do poziomu 3-5 mm poniżej krawędzi, w przeciwnym razie probówki do wirowania mogą ulec zapadnięciu. Zrównoważyć koszyki z dokładnością do 0.1 g, uwzględniając nakrętkę, na wypadek gdyby nakrętki nie były idealnie dopasowane.</li>
	<li>Wirować w ultrawirowarce przez 1.5 hr w temperaturze 4 °C przy 20,000 rcf.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć probówkę z koszyka za pomocą sterylnej pęsety. Cząstki wirusa przenikną przez warstwę sacharozy i utworzą osad. Z kolei rozpuszczalne czynniki wydzielane przez komórki (np. cytokiny) pozostaną w roztworze. Przechylić probówkę, aby odlać cały płyn. Pozostawić ją odwróconą do góry nogami na sterylnej powierzchni, np. na płytce hodowlanej, do wyschnięcia, ale nie dopuszczać do całkowitego wyschnięcia osadu.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 1 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) do osadu i przechylić probówkę, aby odlać HBSS. Ponownie pozostawić probówkę odwróconą do góry nogami na sterylnej powierzchni do wyschnięcia. Nie dopuszczać do całkowitego wyschnięcia osadu.</li>
	<li>Resuspendować osad w 1 ml HBSS, pipetując w górę i w dół 40x. Należy starać się zapobiegać powstawaniu pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zniszczyć wirusa.</li>
	<li>Rozdzielić wirusa na alikwoty, gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego użycia. Do każdego eksperymentu należy używać nowej alikwoty wirusa, ponieważ wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie obniża miano zakaźności. Podczas rozmrażania zawsze rozmrażać wirusa w temperaturze 37 °C, ponieważ HRSV jest mniej stabilny w temperaturach od -20 do 15 °C.</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie HRSV
Uwaga: Aby zapewnić powtarzalność danych, powtórz pomiar ilościowy co najmniej 3 razy w dubletach.
3.1. Zakażanie komórek A549
<ol>
	<li>Hodować komórki A549 na płytce 24-dołkowej do momentu uzyskania konfluencji.</li>
	<li>Przemyć komórki A549 dwukrotnie 1 ml PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 5-krotne rozcieńczenia seryjne HRSV w pożywce z obniżoną zawartością surowicy (Reduced Serum Medium). Do obu dołków dodać po 100 μl rozcieńczonego wirusa. Przygotować minimum 4 rozcieńczenia (np. 4-, 20-, 100- i 500-krotne). Uwzględnić dwa dodatkowe dołki zainfekowane najwyższą dawką wirusa (zostaną one wykorzystane jako kontrola izotypowa) oraz dwa dołki z infekcją pozorną (mock).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 2 hr w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Kołysać płytki 24-dołkowe co 15 min, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>Usunąć zawiesinę wirusa i przemyć komórki raz 1 ml PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 4% (w/v) albuminę wołową (BSA) w pożywce z obniżoną zawartością surowicy (Reduced Serum Medium). Przefiltrować w celu sterylizacji (filtr 0,2 μm) i dodać po 500 μl do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 22 hr.</li>
</ol>
3.2. Przygotowanie do FACS
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę i wypłukać komórki raz 1 ml PBS o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 200 μl uprzednio ogrzanej trypsyny (37 °C) do każdego dołka i inkubować przez 10 min w 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki oddzieliły się od podłoża. Jeśli komórki są oddzielone, dodać 800 μl DMEM + 10% FCS + 1% P/S, aby zneutralizować trypsynę. Resuspendować komórki.</li>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej płytki 96-dołkowej, która nie była traktowana do hodowli tkanek. Odwirować przez 5 min przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Resuspendować osady w 200 μl zimnego PBS.</li>
	<li>Odwirować przez 5 min przy 400 x g w 4 °C. Odlać supernatant i resuspendować w 200 μl zimnego PBS.</li>
	<li>Odwirować przez 5 min przy 400 x g w 4 °C. Odlać supernatant i resuspendować w 150 μl 80% lodowatego acetonu.</li>
	<li>Utrwalić komórki w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
	<li>Odwirować przez 5 min przy 400 x g w 4 °C. Odlać supernatant i resuspendować w 200 μl zimnego PBS + 0.1 % BSA.</li>
	<li>Odwirować przez 5 min przy 400 x g w 4 °C. Odlać supernatant i resuspendować w 50 μl przeciwciał anti-NP-RSV-FITC (rozcieńczonych 1:50 w PBS + 1% BSA) lub 50 μl IgG2 anti mouse-FITC (jest to kontrola izotypowa; należy zatem zastosować takie samo stężenie przeciwciał).</li>
	<li>W pozostałej części protokołu przechowywać probówki w ciemności. Inkubować przez co najmniej 1 h w 4 °C, przy czym czas ten można wydłużyć do całej nocy.</li>
	<li>Dodać 150 μl zimnego PBS + 0.1% BSA.</li>
	<li>Odwirować przez 5 min przy 400 x g w 4 °C. Odlać supernatant i resuspendować w 200 μl zimnego PBS + 0.1% BSA.</li>
	<li>Odwirować przez 5 min przy 400 x g w 4 °C. Odlać supernatant i resuspendować w 200 μl zimnego PBS + 0.1% BSA. Przechowywać płytkę na lodzie i w ciemności do czasu pomiaru FACS.</li>
	<li>Zmierzyć zainfekowane komórki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
3.3. Obliczenia dla FITC-50
<ol>
	<li>Użyj programu do analizy cytometrii przepływowej, aby ustawić punkt odcięcia w oparciu o kontrolę negatywną (kontrolę izotypową). Wybierz typ wykresu Pseudocolor. Wyznacz bramkę kwadrantową, w której komórki dodatnie znajdują się w polu Q3. Procent fałszywie dodatnich wyników powinien być niższy niż 0,2% w obu kontrolach izotypowych.</li>
	<li>Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i przygotuj tabelę z procentową zawartością komórek FITC+ dla każdego rozcieńczenia. Od każdej wartości w każdym eksperymencie odejmij średnią wartość wyników fałszywie dodatnich (ustaloną na podstawie kontroli izotypowej).</li>
	<li>Otwórz nowy plik (wykres rozrzutu XY, jedna kolumna X i wiele kolumn Y) w programie statystycznym. Skopiuj dane do tego programu: X = rozcieńczenie, Y = % zakażonych komórek, n = 3; użyj średniej z dwóch pomiarów dla każdego rozcieńczenia. Przeprowadź analizę statystyczną regresji nieliniowej z jednofazowym zanikiem wykładniczym. Sprawdź, czy krzywa pasuje do punktów danych; w przeciwnym razie wybierz inną analizę statystyczną.</li>
	<li>Skopiuj równanie krzywej oraz wartości do równania do arkusza kalkulacyjnego. Oblicz wartość X dla Y = 50%. Na tej podstawie wyznacz wartość FITC-50, obliczając liczbę zakaźnych cząsteczek wykrywanych metodą FITC na ml (FIP/ml) przy rozcieńczeniu, przy którym występuje 50% zakażenia, korzystając z następującego równania: 
	<img alt="Wzór obliczeniowy FITC50; schemat przedstawiający równanie pomiaru intensywności fluorescencji." fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
	A = średnia liczba komórek A549/studzienkę 
	B = μl wirusa na studzienkę użytego do zakażenia 
	C = rozcieńczenie, przy którym występuje 50% zakażenia</li>
</ol>
4. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z krwi zdrowych ochotników
<ol>
	<li>Pobrać krew żylną do probówek z 10 ml EDTA od zdrowych ochotników po uzyskaniu świadomej zgody. Objętość 10 ml krwi pozwoli na uzyskanie około 107 PBMC.</li>
	<li>Od tego momentu pracować w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Rozcieńczyć krew dwukrotnie za pomocą PBS w temperaturze pokojowej w probówce 50 ml. Na jedną probówkę 50 ml można wykorzystać maksymalnie 35 ml rozcieńczonej krwi.</li>
	<li>Przygotować sterylną strzykawkę 50 ml i założyć sterylną igłę z systemem Luer lock. Nabrać do strzykawki medium do gradientu gęstości. Umieścić igłę na dnie probówki z rozcieńczoną krwią i ostrożnie nanieść 15 ml medium do gradientu gęstości pod rozcieńczoną krew. Należy zachować wyraźną granicę między medium do gradientu gęstości a krwią.</li>
	<li>Wirówekować przy 800 x g w temperaturze pokojowej przez 20 min, z przyspieszeniem ustawionym na 9 (max) i z wyłączonym hamulcem. Po zakończeniu pracy ustawić temperaturę wirówki na 4 °C.</li>
	<li>Centryfugacja w gradiencie gęstości spowoduje powstanie kilku warstw. Na dnie znajduje się pellet z erytrocytami ze srebrzystą warstwą na wierzchu, która zawiera neutrofile. Przejrzysta warstwa powyżej tego pelletu zawiera medium do gradientu gęstości. Cienka warstwa pomiędzy medium do gradientu gęstości a warstwą osocza krwi na górze zawiera PBMC.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać PBMC za pomocą pipety Pasteura i przenieść komórki do nowej probówki 50 ml. Od tego momentu przechowywać PBMC w lodzie i używać schłodzonego PBS. Dodać schłodzony PBS do uzyskania objętości 50 ml i wirować przy 400 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C (z hamulcem ustawionym na 9).</li>
	<li>Usunąć nadnadłożną ciecz poprzez aspirację, resuspenderć pellet w 50 ml schłodzonego PBS i wirować przy 400 x g przez 10 min w 4 °C, powtórzyć czynność 2 razy.</li>
	<li>Po usunięciu nadnadłożnej cieczy dodać 1 ml schłodzonego medium (RPMI + 1% P/S) i policzyć komórki przy użyciu komory liczbowej.</li>
	<li>Dostosować stężenie komórek do poziomu 5 x 106 PBMC/ml.</li>
</ol>
5. Stymulacja PBMC żywym wirusem HRSV
<ol>
	<li>Przygotować układ eksperymentalny; dla każdego warunku należy uwzględnić duplikaty eksperymentalne.</li>
	<li>Rozcieńczyć wszystkie niezbędne stymulanty w pożywce (RPMI + 1% P/S). Należy pamiętać, że końcowa objętość na dołek wyniesie 200 μl. Ponieważ dodawane będzie 50 μl stymulantów, należy przygotować zapasy stymulujące o 4-krotnym stężeniu.</li>
	<li>Do każdego dołka płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie dodać 100 μl wyżej wspomnianej zawiesiny komórkowej (5 x 105 PBMC/dołek).</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 50 μl rozcieńczonych stymulantów. Możliwe jest dodanie dwóch różnych stymulantów, co łącznie da objętość 200 μl. W przypadku konieczności zastosowania tylko jednego stymulantu, objętość należy uzupełnić pożywką do 200 μl.</li>
	<li>Inkubować płytkę 96-dołkową przez wymagany czas w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2. W przypadku większości cytokin wystarczająca będzie 24-godzinna inkubacja.</li>
</ol>
6. Odczyt stymulacji
<ol>
	<li>Po okresie inkubacji odwiruj płytkę 96-dołkową przez 5 min w temperaturze pokojowej przy 450 x g, aby zebrać komórki na dnie.</li>
	<li>Zbierz nadsącz (pobierz maksymalną objętość 180 μl) i przechowuj do późniejszej analizy cytokin (-20 °C) lub do produkcji wirusa (-80 °C).</li>
	<li>Stymulowane PBMC obecne w osadzie można analizować metodą qPCR/Western blot poprzez dodanie buforu do lizy lub alternatywnie barwić do analizy cytometrycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Nair, H., Nokes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet. 375, 1545-1555 (2010).</li>
<li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+in+elderly+and+high-risk+adults%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults.</a> N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+Immune+Responses+and+Lung+Inflammation+after+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+and+disease+enhancement+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbio.+Rev%22%5BJournal%5D)">Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection.</a> Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).</li>
<li>Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+respiratory+syncytial+virus+infection+of+pediatric+bronchial+epithelium%2C+the+primary+target+of+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).</li>
<li>Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+polymorphisms+mediate+impaired+responses+to+respiratory+syncytial+virus+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide.</a> J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).</li>
<li>Vissers, M., Remijn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+augments+NOD2+signaling+in+an+IFN-%CE%B2-dependent+manner+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells.</a> Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).</li>
<li>Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adults+65+years+old+and+older+have+reduced+number+of+functional+memory+T+cells+to+respiratory+syncytial+virus+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein.</a> Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).</li>
<li>Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mucosal+and+systemic+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+by+inactivated+virus+supplemented+with+TLR9+and+NOD2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands.</a> Vaccine. 30, 597-606 (2012).</li>
<li>Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+grown+in+Vero+cells+contains+a+truncated+attachment+protein+that+alters+its+infectivity+and+dependence+on+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans.</a> J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).</li>
<li>Treuhaft, M. W., Beem, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+interfering+particles+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Defective interfering particles of respiratory syncytial virus.</a> Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).</li>
<li>Korns Johnson, D., Homann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+and+improved+quantification+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29+titers+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry.</a> PLoS One. 7 (5), e37337(2012).</li>
<li>Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high+and+low+responders+to+lipopolysaccharide+in+normal+subjects%3A+an+unbiased+approach+to+identify+modulators+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity.</a> J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).</li>
<li>Kimpen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+and+asthma.+The+role+of+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).</li>
<li>Wang, S. Z., Forsyth, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+neutrophils+with+respiratory+epithelial+cells+in+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection.</a> Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).</li>
<li>San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-rich+microdomains+as+docking+platforms+for+respiratory+syncytial+virus+in+normal+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells.</a> J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).</li>
<li>Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+endotoxin-stimulated+leukocytes+of+term+new+born%3A+control+of+cytokine+gene+expression+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10.</a> Plos One. 8 (1), e53641(2013).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W tym badaniu wykazaliśmy, że zakażenie PBMC HRSV jest szybkim i niezawodnym systemem modelowym, w którym można badać szlaki zapalne. W celu stymulowania PBMC należy przygotować i określić ilościowo zasoby HRSV.
Wiele linii komórkowych jest podatnych na zakażenie HRSV. Linie komórkowe najczęściej wykorzystywane do hodowli HRSV to komórki HEp-2, HeLa i Vero. Nie zalecamy jednak stosowania komórek Vero do hodowli HRSV, ponieważ wykazano, że hodowla HRSV w komórkach Vero powoduje skrócenie białka...

Ludzki wirus syncytialny układu oddechowego (HRSV) jest najczęstszą przyczyną infekcji dolnych dróg oddechowych u dzieci. Każdego roku ponad 33 miliony dzieci poniżej piątego roku życia są zarażone HRSV, co prowadzi do ponad trzech milionów hospitalizacji i prawie 200 000 zgonów1. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że HRSV stanowi również poważne zagrożenie dla osób starszych i dorosłych z chorobami przewlekłymi2.
Większość zakażeń HRSV u małych dzieci objawia się łagodnymi objawami, porównywalnymi do zwykłego przeziębienia, i nie wymaga klinicznej interwencji. Jednak niewielki odsetek pacjentów wymaga hospitalizacji i wentylacji mechanicznej z powodu ciężkiego zapalenia oskrzelików.
Częścią patogenezy choroby HRSV jest nadmiernie wybujała i niewystarczająca odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję3,4. Ilustruje to kilka obserwacji. Okres maksymalnego zachorowalności jest często poprzedzony szczytem infekcji wirusowej i lepiej zbiega się z infiltracją komórkową zakażonych tkanek i uwalnianiem cytokin zapalnych3. Inna linia dowodów pochodzi z badań nad inaktywowanym formaliną HRSV (FI-RSV) w latach 60. Zamiast indukować ochronę u małych niemowląt, szczepionka spowodowała przesadną odpowiedź immunologiczną, co skutkowało nasileniem chorób układu oddechowego oraz większą zachorowalnością i śmiertelnością.
Opracowano kilka modeli do badania patogenezy zakażeń HRSV. Ciągłe linie komórkowe, takie jak HEp-2 i A549, są szeroko stosowane do badania infekcji HRSV in vitro. Komórki nabłonkowe są głównym celem zakażenia HRSV5, dlatego wiele uwagi poświęcono tym typom komórek. Jednak sytuacja in vivo jest znacznie bardziej złożona i nie ogranicza się do jednego typu komórek. Aby zbadać te złożone interakcje, opracowano kilka modeli infekcji zwierzęcych w celu zbadania patogenezy HRSV. Do tej pory stosowano dwie różne strategie, koncentrując się zarówno na modelach heterologicznych (nieludzkich), jak i na pokrewnych modelach pneumowirusa gospodarza. Przykładami heterologicznych modeli HRSV są szympansy, owce, szczury bawełniane i myszy. Zakażenie wirusem RSV u naturalnego żywiciela badano u bydła i myszy, stosując odpowiednio bydlęcy wirus RSV i pneumowirus.
Chociaż każdy z tych modeli dostarczył ważnych informacji na temat patogenezy chorób, HRSV jest wysoce przystosowany do ludzi. Dlatego, jako uzupełnienie obecnie stosowanych linii komórkowych i modeli zwierzęcych, proponujemy wykorzystanie ludzkich pierwotnych PBMC jako modelu stymulacji HRSV. Ludzkie PBMC można uzyskać od różnych osób w celu odpowiedzi na konkretne pytania badawcze, w tym od małych dzieci6 , osób z obniżoną odpornością, a także zdrowych dorosłych7 lub osób starszych8 . PBMC mogą być wykorzystywane do badania wrodzonych aspektów infekcji, a także odpowiedzi adaptacyjnej na wirusa. Aktywowane szlaki zapalne ważne dla patogenezy choroby HRSV można badać na poziomie mRNA i białka. Ponadto infekcję wirusową (podzbiorami) komórek odpornościowych można określić za pomocą cytometrii przepływowej. Używaliśmy tego modelu wcześniej do identyfikacji synergicznego wpływu zakażenia HRSV wraz z bakteryjnym ligandem dipeptydem muramylowym (MDP) na indukcję cytokin prozapalnych7. Proponujemy wykorzystanie stymulacji HRSV ludzkich pierwotnych PBMC jako solidnego, łatwego i szybkiego modelu in vitro do badania szlaków zapalnych zaangażowanych w patogenezę choroby HRSV.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS bez Ca2+ Mg2+ lub czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>HBSS, Wapń, Magnez, bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>DMEM, Wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX, Pirogronian</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>72400054</td><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES</td></tr><tr><td>Obniżona pożywka w surowicy (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicy, GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Penicylina-Streptomycyna, płynna</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1x), Czerwone komórki fenolowe</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549 komórki</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S7903</td><td>Sacharoza BioXtra, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>IgG2 anty-mysie-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555057</td><td>Ms IgG2b K Kontrola izotypu</td></tr><tr><td>FITC Anty-NP-RSV-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>Przeciwciało przeciw syncytialnemu wirusowi oddechowemu [671] (FITC)</td></tr><tr><td>Pożywka o gradionym natężeniu gęstości (Lymphoprep)</td><td>Rurki Axis-Shield</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck Milipory</td><td>1000141000</td><td>Aceton do analizy</td></tr><tr><td colspan="4">Materiał </td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>cienkościenne, poliallomerowe, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630 Rotor z wiadrami 36 ml</td><td>Sorvall</td><td>79368</td><td>Wiadro wahadłowe tytanowy rotor</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultrawirówka</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l CO2</td><td>Spoiwo</td><td></td><td></td> w inkubatorze</tr></tbody></table>

model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Zakażenia ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego (HRSV) prezentują szerokie spektrum nasilenia choroby, od łagodnych infekcji do zagrażającego życiu zapalenia oskrzelików. Ważną częścią patogenezy ciężkiej choroby jest wzmocniona odpowiedź immunologiczna prowadząca do immunopatologii.	Tutaj opisujemy protokół używany do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek odpornościowych na infekcję HRSV. Po pierwsze, opisujemy metody stosowane do hodowli, oczyszczania i oznaczania ilościowego HRSV. Następnie opisujemy ludzki model in vitro, w którym komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) są stymulowane żywym HRSV. Ten system modelowy może być używany do badania wielu parametrów, które mogą przyczyniać się do ciężkości choroby, w tym wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedzi te można mierzyć na poziomie transkrypcyjnym i translacyjnym. Co więcej, infekcję wirusową komórek można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Podsumowując, stymulacja PBMC za pomocą żywego HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania mechanizmów związanych z chorobą wywołaną przez HRSV.

Opisana tutaj metoda hodowli i oczyszczania HRSV A2 pozwoli uzyskać wydajność od 2 x 107 do 2 x 108 z ilościowanych zakaźnych cząsteczek wirusowych FITC-50/ml. Wyniki analizy mikroskopowej, w której policzono zainfekowane komórki barwione FITC (wyniki nie zostały przedstawione), porównano z wynikami ilościowania metodą FACS (Rysunek 1). Obie metody pozwoliły uzyskać podobne miana, przy czym metoda FACS charakteryzowała się znacznie niższym odchyleniem standardowym pomiędzy różnymi d...

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie odpowiedzi ludzkich komórek odpornościowych na infekcję wirusem RSV (respiratory syncytial virus). Osiąga się to poprzez uprawę zakaźnego zapasu RSV na komórkach helo, a w drugim kroku zapas ten jest oczyszczany za pomocą ultrawirowania.Następnie pierwotne komórki odpornościowe krwi ludzkiej są izolowane metodą wirowania w gradiencie gęstości. W końcowym etapie wyizolowane komórki odpornościowe są stymulowane wirusem. Ostatecznie odpowiedź odpornościową komórkową na zakażenie RSV można ocenić za pomocą testu ELISA, qPCR lub cytometrii przepływowej.Technika ta stanowi cenny dodatek do badania infekcji wirusem RSV. RSV wykazuje wysoką zdolność adaptacji do organizmu człowieka. Dlatego też istotne jest wykorzystanie ludzkich komórek odpornościowych do badania szlaków zapalnych zaangażowanych w patogenezę tego wirusa.Chociaż w tym filmie wykorzystano wirus RSV, metodę tę można łatwo dostosować do badania innych wirusów, takich jak wirus grypy lub rynowirusy. Rozpocznij od ogrzania fiolki ze stokiem roboczym ludzkiego RSV w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Po rozmrożeniu wirusa rozcieńcz stok w czteromililitrowych aliquotach medium do

an-vitro-model-to-study-immune-responses-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

In vitro model do badania odpowiedzi odpornościowych ludzkich komórek krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym oddechowym

Metoda ta umożliwia charakteryzację rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, czyli pierwotną ludzką tkanką nabłonkową dróg oddechowych hodowaną na granicy faz powietrze-ciecz, która stanowi biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego mikroorganizmu nadającego się do długotrwałej kokultury.

Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Ten film demonstruje technikę in vitro do stymulacji limfocytów za pomocą nietypizowanego Haemophilus influenzae (NTHi) i oceny odpowiedzi immunologicznej. Inkubacja izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z NTHi powoduje, że komórki bakteryjne stymulują limfocyty T, co prowadzi do produkcji cytokin. Po zahamowaniu wydzielania cytokin przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia nagromadzonych cytokin wewnątrzkomórkowych w stymulowanych limfocytach T.

Technika in vitro do stymulacji limfocytów przez bakterie chorobotwórcze

Ten film pokazuje ex vivo zakażenie ludzkiej tkanki błony śluzowej macicy ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1, HIV-1, oraz ich utrzymanie na gąbkach żelatynowych na granicy powietrze-ciecz. Metoda ta pozwala na monitorowanie replikacji i patogenezy HIV-1 w tkankach ludzkich.

Model zakażenia błony śluzowej szyjki macicy u człowieka do badania patogenezy HIV w warunkach ex vivo

Ten film przedstawia test do pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV). Wstępna inkubacja z surowicą zawierającą przeciwciała neutralizujące RSV neutralizuje cząsteczki wirusa, zmniejszając infekcję komórkową i tworzenie się blaszek miażdżycowych. Komórki zakażone wirusem są następnie poddawane utrwalaniu, blokowaniu i znakowaniu przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem w celu wizualizacji płytki nazębnej. Proces ten umożliwia identyfikację...

Test do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących specyficznego dla syncytialnego wirusa oddechowego

Ten film demonstruje technikę in vitro do identyfikacji komórek odpornościowych znajdujących się w płucach myszy. Po wyizolowaniu docelowych komórek odpornościowych z mysiej tkanki płucnej, są one znakowane powierzchniowo za pomocą koktajlu przeciwciał znakowanych fluoroforem przeciwko specyficznym markerom na wrodzonych i nabytych komórkach odpornościowych. Dodatkowo monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne są znakowane za pomocą markera wewnątrzkomórkowego. Różne typy komórek...

Metoda in vitro do identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych znajdujących się w płucach myszy

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Ten protokół szczegółowo opisuje badanie wczesnych interakcji między wirusowo zakażonymi komórkami nabłonka nosa a aktywacją komórek wrodzonych. Poszczególne podzbiory komórek odpornościowych można rozróżnić na podstawie ich aktywacji w odpowiedzi na infekcje wirusowe. Następnie można je dalej badać w celu określenia ich wpływu na wczesne odpowiedzi przeciwwirusowe.

Bezkontaktowy model kohodowli do badania aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych podczas infekcji wirusem układu oddechowego

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące podawania IAV w ciągu nosa oraz dalszej analizy uszkodzeń płuc myszy i związanych z tym zmian transkrypcyjnych typów komórek płucnych.

Modelowanie dysplastycznej i funkcjonalnej naprawy płuc pęcherzyków płucnych po zakażeniu grypą

Poznaj model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie wirusem RSV. Ta metoda pozwala analizować aktywację szlaków zapalnych i oceniać odpowiedź immunologiczną.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego (Wideo) | JoVE Journal

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Przeglądaj więcej filmów