Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie odpowiedzi ludzkich komórek odpornościowych na infekcję wirusem RSV (respiratory syncytial virus). Osiąga się to poprzez uprawę zakaźnego zapasu RSV na komórkach helo, a w drugim kroku zapas ten jest oczyszczany za pomocą ultrawirowania.

Następnie pierwotne komórki odpornościowe krwi ludzkiej są izolowane metodą wirowania w gradiencie gęstości. W końcowym etapie wyizolowane komórki odpornościowe są stymulowane wirusem. Ostatecznie odpowiedź odpornościową komórkową na zakażenie RSV można ocenić za pomocą testu ELISA, qPCR lub cytometrii przepływowej.

Technika ta stanowi cenny dodatek do badania infekcji wirusem RSV. RSV wykazuje wysoką zdolność adaptacji do organizmu człowieka. Dlatego też istotne jest wykorzystanie ludzkich komórek odpornościowych do badania szlaków zapalnych zaangażowanych w patogenezę tego wirusa.

Chociaż w tym filmie wykorzystano wirus RSV, metodę tę można łatwo dostosować do badania innych wirusów, takich jak wirus grypy lub rynowirusy. Rozpocznij od ogrzania fiolki ze stokiem roboczym ludzkiego RSV w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Po rozmrożeniu wirusa rozcieńcz stok w czteromililitrowych aliquotach medium do infekcji na każdą kolbę.

Utrzymując MOI na poziomie 0,1 lub niższym, dodaj wirusa do komórek heli, stosując tak małą objętość całkowitą, jak to możliwe, aby nie doprowadzić do wyschnięcia komórek. Następnie inkubuj kultury przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37°C i 5% CO2, obracając kolbę co 15 minut w celu redystrybucji medium. Następnie usuń inokulum i raz przemyj komórki PBS.

Następnie do kolb należy dodać 15 ml pożywki hodowlanej i inkubować je od trzech do pięciu dni w tych samych warunkach hodowli. Komórki należy obserwować codziennie raz dziennie pod zwykłym mikroskopem w polu jasnym w celu wykrycia cytopatologicznych zmian wywołanych przez wirus. Po zaobserwowaniu tych zmian należy zebrać RSV poprzez zeskrobanie komórek, a następnie przelać zawiesinę do sterylnej probówki o pojemności 50 ml, poddać komórki wiertoksowaniu, a następnie odwirować je przez 10 minut przy 1800 Gs w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad z resztek komórkowych.

RSV nie wytrąca się w osad przy tej prędkości, w związku z czym nadsącz można przechowywać w temperaturze -80°C jako zapas do zaszczepiania w ilości 1 mL. Alikwoty przeznaczone do późniejszego użycia należy zawsze zamrażać błyskawicznie w ciekłym azocie, aby zapobiec utracie infekcyjnych cząsteczek wirusa. Aby oczyścić RSV, należy rozpocząć od umieszczenia sterylnej probówki do wirowania w każdym koszyku ultrawirowki.

Następnie do dna każdej probówki dodaj 5 mL świeżo przygotowanego, sterylizowanego przez filtr roztworu sacharozy. Następnie bardzo powoli dodaj 30 mL roztworu RSV na wierzch roztworu sacharozy, dbając o to, aby nie zmieszać roztworu sacharozy i zachować wyraźne warstwy. Następnie, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylności, ostrożnie zrównoważ masę sześciu wiader do ultrawirówki za pomocą sterylnego PBS z dokładnością do 0,1 g, wliczając w to nakrętki. Wiruj wirusa przez 1,5 h przy 20 000 RCF i temperaturze 4 °C.

Po zakończeniu wirowania za pomocą sterylnej pincety ostrożnie wyjmij probówki z koszyków wirówki. Cząsteczki wirusa przenikną przez warstwę sacharozy, tworząc osad. Przelej zawartość probówek do kolby z odpadami wirusowymi i pozostaw probówkę odwróconą do góry dnem na sterylnej powierzchni, aby całkowicie osuszyła się z cieczy.

Nie doprowadzać do całkowitego wyschnięcia osadu. Następnie ostrożnie przepłukać osad jednym mililitrem HPSS, ponownie przechylając probówkę wirówkową, aby odprowadzić HPSS. Następnie ponownie odwrócić probówkę do góry dnem, dbając o to, aby osad nie wyschł.

Następnie przemyj osad 40 razy w kolejnym mililitrze HBSS, dbając o to, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zniszczyć wirusa. Następnie gwałtownie zamroź alikwoty wirusa w ciekłym azocie. Przechowuj wirusa w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia kwantyfikacji i dalszego użycia. Po pobraniu krwi do probówek z EDTA o pojemności 10 ml od zdrowych ochotników, rozcieńcz krew w PBS o temperaturze pokojowej maksymalnie dwukrotnie, aż do uzyskania objętości 35 ml rozcieńczonej krwi w probówce o pojemności 50 ml.

Następnie do sterylnej strzykawki o pojemności 50 mililitrów należy przymocować sterylną igłę typu Luer-Lock, a następnie nabrać do strzykawki medium do gradientu gęstości. Umieścić igłę na dnie probówki z rozcieńczoną krwią i ostrożnie pipetować 15 mililitrów medium do gradientu gęstości pod krew, utrzymując wyraźną granicę między medium a krwią. Następnie oddzielić komórki przez 20 minut przy 800 ×g w temperaturze pokojowej, przy maksymalnym przyspieszeniu i hamowaniu. Po separacji erytrocyty znajdują się w osadzie na dnie probówki, a nad nimi widoczna jest srebrzysta warstwa neutrofili.

Przejrzysta warstwa nad osadem zawiera medium gradientu gęstości, a cienka warstwa pomiędzy medium gradientu gęstości a znajdującą się na górze warstwą osocza krwi zawiera PBMC. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie zbierz PBMC, a następnie przenieś komórki do nowej probówki o pojemności 50 ml w lodzie. Dolej schłodzony PBS do objętości 50 ml i odwiruj komórki do uzyskania osadu po zakończeniu wirowania.

Odsaj pozostały nadsącz i dwukrotnie przemyj osad w 50 mililitrach lodowatego PBS; po drugim płukaniu dodaj do osadu jeden mililitr lodowatego medium, policz komórki i dostosuj stężenie komórek do poziomu pięciu razy 10 do potęgi sześć pbmc na mililitr. Aby stymulować pbmc żywym RSV, najpierw dodaj 100 mikrolitrów pbmc do każdej studni płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem. Następnie dodaj do każdej z nich po 50 mikrolitrów dwóch świeżo rozcieńczonych stymulantów.

Następnie inkubujemy płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2, a potem wirujemy płytkę i zbieramy nadsącz do późniejszej analizy metodą ELISA. Stymulowane PBMC w osadzie można poddać analizie za pomocą qPCR lub barwić do cytometrii przepływowej. Przy przeprowadzaniu eksperymentu stymulacji PBMC zaleca się stosowanie metody frakcyjnej bodźców.

Warunki podzielono na standardowe warunki stymulacji, takie jak RPMI lub ludzki RSV, oraz warunki frakcji testowych, takie jak mial, dipeptyd lub LPS. Co ważne, w każdym eksperymencie zawsze uwzględniono kontrolę negatywną, taką jak sam RPMI, oraz kontrolę pozytywną, taką jak LPS. Po 24 godzinach stymulacji RSV różne populacje PBMC wykazują zależny od dawki stopień zakażenia oraz różnice w wydajności zakażenia RSV. Po 24 godzinach stymulacji wirusem analiza qPCR PBMC w kierunku ekspresji TNF-alpha lub interferonu gamma wykazuje, że RSV indukuje silną nadekspresję transkrypcji tych dwóch cytokin zapalnych. Z kolei stymulacja miam, dipeptydem lub LPS skutkuje jedynie słabą ekspresją mRNA.

Kiedy PBMC stymuluje się jednocześnie RSV i dipeptydem MIAL, obserwuje się silną synergetyczną nadekspresję. Stymulowane PBMC analizowano również pod kątem produkcji TNF-α lub interferonu gamma za pomocą testu ELISA. W przeciwieństwie do obserwacji na poziomie transkrypcyjnym, RSV jest słabym induktorem sekrecji białka TNF-α i interferonu gamma przez PBMC; stymulacja dipeptydem MIAL prowadzi do produkcji niewielkich ilości TNF-α i braku interferonu gamma.

Podobnie jak w analizach transkrypcyjnych, zarówno TNF alpha, jak i interferon gamma wykazują synergistyczną nadrzędną regulację podczas współstymulacji RSV i dipeptydem MIAM, co służy jako kontrola w celu sprawdzenia, czy indukcja cytokin jest zależna od replikacji RSV. P BMCs stymulowano żywym lub inaktywowanym beta-propanolaktonem RSV; jak pokazano na wykresach, zarówno żywy, jak i inaktywowany RSV indukowali produkcję cytokin prozapalnych. Należy pamiętać, że eksperymenty z RSV muszą być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.

Ponadto, podczas próby zastosowania tej metody kluczowe jest pamiętanie o użyciu odczynników i materiałów wolnych od endotoksyn przez cały czas trwania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak stymulować ludzkie PBMC za pomocą RSV, a także na temat kilku analiz, które mogą zostać wykorzystane do badania odpowiedzi immunologicznej.