Name: Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj syntezę przeciwnowotworowych kompleksów tytanu i wanadu oraz ocenę ich cytotoksyczności wobec ludzkich linii komórkowych raka za pomocą testu MTT. Metoda umożliwia wyznaczenie wartości IC50 i ocenę skuteczności leków metalowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Otrzymano finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013) / Umowa o grant ERBN nr [239603]

<ol>
	<li>Przygotowanie kompleksu V (V) (ryc. 2); 18 Wykonaj kroki 1.1-1.4 w schowku na rękawiczki; Jeśli schowek podręczny nie jest dostępny, przejdź do alternatywnych kroków 2 (2.1-2.6).
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,42 mmol ligandówH2L w suchym THF i dodać do roztworu mieszającego równoważne ilości VO(OiPr)3 w THF.</li>
		<li>Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 15 minut i usuwać substancje lotne w próżni.</li>
		<li>Dodaj zimny heksan i usuń go w próżni. Ciemnofioletowy proszek należy uzyskać w ilości plonu.</li>
		<li>Odważyć 8 mg otrzymanego związku w fiolce z lekiem Eppendorf. Przejdź do kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj kompleks V (V) za pomocą linii Schlenka.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,42 mmol ligandaH2L w suchym THF w suchej kolbie Schlenka z nasadką z przegrodą, podłączyć do linii Schlenka i stosować naprzemiennie środowisko próżni/gazu obojętnego (N2 lub Ar); zaleca się zastosowanie trzech takich rund i odczekanie 2-5 minut na stopniach próżni.</li>
		<li>Dodaj suchy THF za pomocą strzykawki przez nasadkę przegrody.</li>
		<li>Dodać równoważne ilości VO(OiPr)3 do roztworu THF, który został przygotowany w podobny sposób, podłączając do linii odpowiednią suchą kolbę Schlenka, stosując obojętne środowisko i dodając odczynniki przez strzykawkę z roztworu wanadu do roztworu ligandu.</li>
		<li>Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 15 minut i usuwać substancje lotne w próżni; jeśli istnieje obawa o niestabilne produkty, przeprowadzić destylację substancji lotnych typu Schlenk w atmosferze obojętnej; użyć przepływu gazu obojętnego, aby dołączyć wymagane szkło, które zostało wstępnie wysuszone.</li>
		<li>Dodaj zimny heksan i usuń go w próżni. Ciemnofioletowy proszek należy uzyskać w ilości plonu.</li>
		<li>Odważyć 8 mg otrzymanego związku w fiolce z lekiem Eppendorf.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kompleksu Ti(IV) (ryc. 2); 28 Wykonaj kroki 3.1-3.3 w schowku na rękawiczki; jeżeli komora rękawicowa nie jest dostępna, należy dostosować alternatywne kroki omówione dla analogu wanadu (krok 2), w których zamiast niego zastosowano linię Schlenka.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,35 mmol ligandaH2L w suchym THF i dodać go do roztworu mieszającego równoważnych ilości Ti(OiPr)4 w THF.</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Usunąć substancje lotne w próżni, aby uzyskać żółty produkt o ilościowej wydajności.</li>
		<li>Odważyć 8 mg otrzymanego związku w fiolce z lekiem Eppendorf.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytki 96-dołkowej z ogniwami HT-29
	<ol>
		<li>Hodowla komórek HT-29 w kolbie o średnicy 75cm2 z pożywką RPMI-1640, która zawiera 1% antybiotyków penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Usuń pożywkę, gdy komórki HT-29 osiągną maksymalną konfluencję (90-100%, co 3-4 dni bez subhodowli). Przemyć 1 ml roztworu trypsyny (0,25%)/EDTA (0,05%) i wyjąć.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu trypsyny (0,25%)/EDTA (0,05%) i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Odłączyć komórki HT-29 od kolby i dodać 10 ml pożywki, aby wyłączyć aktywność trypsyny. Przenieść 5 ml mieszaniny komórek do probówki.</li>
		<li>Za pomocą pipety przenieś kilka kropli mieszaniny komórek do komory licznika. Komora licznika zawiera 5 x 5 kwadratów.</li>
		<li>Policz komórki w 5 reprezentatywnych kwadratach za pomocą mikroskopu: 4 kwadraty w rogach i ten, który znajduje się w środku.</li>
		<li>Oblicz szacowaną liczbę obecnych komórek. Zsumuj komórki w 5 reprezentatywnych kwadratach i podziel przez 20.</li>
		<li>Podziel 0,6 przez wynik kroku 4.7. Otrzymana liczba to ilość mieszaniny komórek wymagana na płytkę. To obliczenie odnosi się do płytki, która zawiera 0,6 x 106 komórek (9,000 komórek na studzienkę).</li>
		<li>Za pomocą pipety przenieść ilość mieszaniny komórek wymaganą na płytkę (obliczoną w sekcji 4.8) i dodać 13,2 ml pożywki (200 μl na studzienkę × 66 dołków).</li>
		<li>Dodać mieszaninę do 96-dołkowej płytki za pomocą 11-kanałowej pipety (200 μl na dołek, 6 linii, łącznie 66 dołków). Jedna studzienka z każdej linii powinna pozostać pusta w celu kontroli ślepej próby.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny, aby komórki mogły przyłączyć się do płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzanie związków
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl (lub inną ilość w zależności od pożądanego zakresu stężeń) suchego THF do 8 mg każdego związku zważonego zgodnie z opisem w kroku 1.4 (lub 2.6) lub 3.3. Odważyć również 8 mg liganda H2L.</li>
		<li>Rozcieńczyć każdy roztwór związku, dodając 60 μl THF do 9 różnych fiolek Eppendorfa.</li>
		<li>Przenieść pipetą 60 μl z mieszaniny opisanej w sekcji 5.1 do pierwszej fiolki Eppendorf, ponownie zawiesić i przenieść 60 μl do następnej fiolki i tak dalej, aż do uzyskania 10 różnych stężeń (łącznie z mieszaniną macierzystą w sekcji 5.1).</li>
		<li>Rozcieńczyć 20 μl każdego stężenia w THF ze 180 μl pożywki.</li>
		<li>Przygotować roztwór kontrolny zawierający tylko THF; 20 μl THF z 180 μl pożywki w każdym pomiarze.</li>
		<li>Dodać 10 μl z otrzymanego roztworu (łącznie z kontrolą THF) do każdej studzienki, która zawiera już 200 μl wyżej wymienionego roztworu komórek w pożywce, aby uzyskać końcowe stężenia związku do 200 mg/L (zakres stężeń można zmieniać w zależności od aktywności związku).</li>
		<li>Można zaobserwować pewne wytrącanie się przy najwyższym zastosowanym stężeniu w zależności od rozpuszczalności związku.</li>
		<li>Powtórzyć każdy pomiar związku 3 razy (3 linie na płytce tego samego związku); każda linia zawiera: komórki poddane działaniu związku w 10 różnych stężeniach, 1 basenik zawierający komórki potraktowane rozpuszczalnikiem tylko do kontroli i 1 basenik bez komórek do kontroli ślepej próby.</li>
		<li>Inkubować obciążoną płytkę przez 3 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar cytotoksyczności za pomocą testu MTT
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór MTT, dodając 1 g proszku MTT do 200 ml roztworu pożywki RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej. Roztwór podstawowy można podzielić na probówki o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać 20 μl roztworu MTT do każdego dołka za pomocą pipety 11-kanałowej (z wyjątkiem ślepej próby kontrolnej bez komórek z kroku 4.10) i inkubować płytkę przez dodatkowe 3 godziny.</li>
		<li>Usuń roztwór pożywki z każdej studzienki.</li>
		<li>Dodać 200 μl izopropanolu do każdego dołka, aby rozpuścić formazan. Mieszaj płytkę przez 0,5 godziny, aż do uzyskania jednorodności.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm dla 200 μl wyżej wymienionego roztworu za pomocą spektrofotometru z czytnikiem mikropłytek.</li>
		<li>Powtórz każdy pomiar (który obejmuje 3 powtórzenia, patrz krok 5.8) w 3 różnych dniach.</li>
		<li>Obliczyć procent żywotności komórek, odejmując wartość absorbancji kontrolnej próby ślepej od wartości zmierzonej, dzieląc wynik przez absorbancję wartości kontrolnej rozpuszczalnika THF i mnożąc przez 100%.</li>
		<li>Oblicz wartości IC50 za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (lub jego odpowiednika).</li>
		<li>Zgłoszona wartość IC50 jest średnią wszystkich wartości IC50 zebranych w co najmniej trzech różnych dniach, a wartość błędu jest odchyleniem standardowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).</li>
<li>Hatok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+the+evaluation+of+drug+resistance+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells.</a> Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).</li>
<li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).</li>
<li>Muggia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum+compounds+30+years+after+the+introduction+of+cisplatin%3A+Implications+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).</li>
<li>Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+for+metal+complexes+with+anticancer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends for metal complexes with anticancer activity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).</li>
<li>Ott, I., Gust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+platinum+metal+complexes+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+der+Pharmazie+%28Weinheim%22%5BJournal%5D)">Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs.</a> Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).</li>
<li>Desoize, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metals+and+metal+compounds+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metals and metal compounds in cancer treatment.</a> Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).</li>
<li>Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumour+metal+compounds%3A+more+than+theme+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Antitumour metal compounds: more than theme and variations.</a> Dalton Transactions. , 183-194 (2008).</li>
<li>Meléndez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+complexes+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Titanium complexes in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).</li>
<li>Evangelou, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanadium+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Vanadium in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).</li>
<li>Djordjevic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+vanadium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+ions+in+biological+systems%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of vanadium compounds.</a> Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+titanium+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Patents%22%5BJournal%5D)">Anticancer titanium agents.</a> Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+titanium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Review+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antitumor titanium compounds.</a> Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).</li>
<li>Kostova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+and+vanadium+complexes+as+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Titanium and vanadium complexes as anticancer agents.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Titanium%28IV%29+Complexes%3A+Renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance.</a> European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).</li>
<li>Buettner, K. M., Valentine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinorganic+Chemistry+of+Titanium%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioinorganic Chemistry of Titanium.</a> Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).</li>
<li>Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+antitumor+activity+of+highly+resistant+salan-titanium%28IV%29+complexes+in+nanoparticles%3A+an+identified+active+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).</li>
<li>Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+cytotoxic+vanadium%28V%29+complexes+of+salan+ligands%3B+insights+on+the+role+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis.</a> Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).</li>
<li>Tzubery, A., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti%28IV%29+Complexes+of+Salen+Ligands%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+cytotoxic+titanium%28IV%29+complexes%3B+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li>
<li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cytotoxic+reagents+based+on+non-metallocene+non-diketonato+well-defined+C-2-symmetrical+titanium+complexes+of+tetradentate+bis%28phenolato%29+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival+-+Application+to+Proliferation+and+Cyto-Toxicity+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).</li>
<li>Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Toxicity+of+Nanogenomedicine+in+MCF-7+Cell+Line%3A+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1191(2009).</li>
<li>Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hepatic+subcellular+fractions+for+Alamar+blue+and+MTT+reductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity.</a> Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cell-Growth+and+Survival+-+Modifications+to+the+Tetrazolium+Dye+Procedure+Giving+Improved+Sensitivity+and+Reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Alley, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+drug+screening+with+panels+of+human+tumor+cell+lines+using+a+microculture+tetrazolium+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.</a> Cancer Research. 48, 589-601 (1988).</li>
<li>Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+note+on+the+use+of+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">A practical note on the use of cytotoxicity assays.</a> International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).</li>
<li>Chmura, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li>
<li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+accurate+EC50%2FIC50+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li>
<li>Yung, W. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Chemosensitivity+Testing+and+its+Clinical-Application+in+Human+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Review%22%5BJournal%5D)">In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas.</a> Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).</li>
<li>McCarthy, N. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarthy%2C+NJ+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 36, 259-278 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Metoda opisana w tym manuskrypcie łączy syntezę chemiczną z biologicznym testem żywotności komórek. Podobnie jak w przypadku innych metod biologicznych dotyczących żywotnych komórek, niezbędna jest praca w kapturze laminarnym i utrzymanie sterylnych warunków, w tym stosowanie sterylnych rozpuszczalników organicznych. Również przygotowanie i przechowywanie hydrolitycznie niestabilnych leków na bazie metali powinno odbywać się w warunkach obojętnych, do których należy wykorzystać komorę rękawicową lub techniki linii Schlen...

Chemioterapia jest nadal jednym z głównych kierunków leczenia stosowanych w klinice różnych chorób nowotworowych, dlatego na całym świecie prowadzone są ogromne ilości badań mających na celu opracowanie nowych i ulepszonych leków przeciwnowotworowych. Takie badania najczęściej rozpoczynają się na poziomie chemicznym, od projektowania i przygotowania związków, a następnie biologicznej oceny właściwości cytotoksycznych in vitro. Żywotność komórek można ocenić za pomocą różnych testów, które dostarczają informacji na temat aktywności komórkowej1-2.
Cisplatyna jest przykładem kompleksu platynowego, który jest powszechnie stosowany jako lek chemioterapeutyczny, który jest uważany za skuteczne leczenie głównie raka jąder i jajników3-4. Jednak jego wąski zakres aktywności i poważne skutki uboczne skłaniają do badań nad innymi silnymi kompleksami metali przejściowych5-8. Między innymi kompleksy tytanu (IV) i wanadu (V) wykazały obiecujące wyniki wysokiej aktywności i zmniejszonej toksyczności9-16. Kompleksy Ti(IV) były pierwszymi, które weszły do badań klinicznych po cisplatynie ze względu na te właściwości; Jednak próby nie przeszły one z powodu trudności z formułowaniem i niestabilnością hydrolityczną. W związku z tym istnieje aktualna potrzeba opracowania ulepszonych pochodnych tych kompleksów metali, które mogą łączyć wysoką aktywność przeciwnowotworową z wodoodpornością15,17-21.
Wyzwanie w przygotowaniu kompleksów Ti (IV) i V (V) odnosi się do hydrolitycznej niestabilności odczynników prekursorowych; dlatego należy utrzymywać obojętną atmosferę. Przygotowanie związków Ti(IV) i V(V) przeprowadza się w warunkachN2 lub Ar w komorze rękawicowej lub przy użyciu technik Schlenka.
Jedna z powszechnych metod oceny aktywności przeciwnowotworowej opiera się na teście MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazolylo)-2,5-difenylotetrazoliowy). Ten test jest testem żywotności kolorymetrycznej, który został zaprezentowany w 1983 roku przez Mosmann22. Jest niezwykle dobrze zbadany i scharakteryzowany, i jest uważany za wysoce skuteczny przy ocenie skuteczności nowych związków cytotoksycznych ze względu na jego precyzję, szybkość i zdolność do stosowania na różnych liniach komórkowych. Ten test żywotności opiera się na zmianie koloru cząsteczki MTT, gdy jest ona wystawiona na działanie żywotnych komórek. Pomiar absorbancji, która jest proporcjonalna do liczby komórek zdolnych do życia, oraz porównanie z nieleczonymi kontrolami, umożliwia ocenę zdolności hamowania wzrostu komórek badanego związku.
Test kolorymetryczny MTT przeprowadzany jest na 96-dołkowej płytce w formacie23. Komórki mogą wymagać wstępnej inkubacji w studzienkach przed dodaniem testowanego leku. Czas preinkubacji może wahać się od 0 do 24 godzin w zależności od właściwości linii komórkowej. Komórki są zwykle wystawione na działanie leku przez 24-96 godzin, w zależności od aktywności leku. Roztwór MTT jest następnie dodawany do leczonych komórek, gdzie żółty MTT jest redukowany do fioletowego formazanu przez różne enzymy mitochondrialne i cytozolowe, które działają w żywotnych komórkach (ryc. 1)24. Cząsteczka MTT nie jest redukowana przez martwe komórki lub czerwone krwinki (komórki nieaktywne metabolicznie), komórki śledziony (komórki spoczynkowe) i limfocyty stymulowane przez konkanawalinę A (komórki aktywowane)22. Po 3-4 godzinach inkubacji z MTT formazan wytrąca się. Tworzenie formazanu rozpoczyna się po 0,5 godziny inkubacji, ale dla uzyskania optymalnych rezultatów najlepiej jest wystawić komórki na działanie MTT przez co najmniej 3 godziny22. W związku z tym podłoże uprawowe jest usuwane, a formazan rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, najlepiej izopropanolu25, chociaż można również użyć DMSO26. Eliminacja pożywki ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia dokładnych wyników, ponieważ czerwień fenolowa, która jest powszechnie stosowana w pożywce wzrostowej, oraz białka wytrącające się mogą zakłócać pomiar absorbancji25. Gdy roztwór formazanu osiągnie jednorodność, absorbancję roztworu mierzy się za pomocą spektrofotometru z czytnikiem mikropłytek. Absorbancja przy 550 nm jest wprost proporcjonalna do liczby komórek w zakresie 200-50 000 komórek na studzienkę, a zatem można wykryć bardzo małe ilości komórek22. Absorbancja wskazuje ilość żywych komórek, które pozostały po leczeniu lekiem i jest porównywana z absorbancją komórek kontrolnych, które nie były narażone na działanie leku. Analiza wyników przez odpowiednie oprogramowanie dostarcza wartości IC50 (stężenie inhibicyjne; 50%) oraz ich błędy statystyczne na podstawie kilku powtórzeń pomiaru.
Test MTT jest powszechnie stosowany w badaniach cytotoksyczności do badań przesiewowych nowych związków przeciwnowotworowych, ze względu na jego dokładność i względną prostotę. Jednak przy stosowaniu testu MTT, który jest zależny od reakcji enzymatycznej, należy wziąć pod uwagę, że różne inhibitory enzymów mogą wpływać na zmniejszenie MTT i prowadzić do fałszywych wyników27. Ponadto test MTT nie dostarcza żadnych informacji na temat molekularnego mechanizmu aktywności cytotoksycznej leku2.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Heksan AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Suszone przy użyciu systemu suszenia rozpuszczalnikiem</td></tr><tr><td>Linia komórkowa HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki penicylinowe/streptomycyny</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 z czerwienią fenolową z L-glutaminą</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI bez czerwieni fenolowej</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>suszony przy użyciu systemu suszenia rozpuszczalnikowego</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>wrażliwy na wilgoć</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>wilgotność sensitive</td></tr><tr><td colspan="4">Sprzęt</td></tr><tr><td>12-kanałowa pipeta 30-300 &mu; l</td><td>Pipeta 12-kanałowa Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mm; l</td><td>Kolba Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka z pokrywką (płaskie dno)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Binder</td><td></td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Komora licznika</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka Eppendorf</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schowek na rękawiczki</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek spektrofotometr</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 20-200 &mu; l</td><td>Pipeta Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>Pipeta Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu mtt

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Kompleksy tytanu (IV) i wanadu (V) są bardzo silnymi środkami przeciwnowotworowymi. Wyzwaniem w ich syntezie jest ich niestabilność hydrolityczna; Dlatego ich przygotowanie powinno odbywać się w atmosferze obojętnej. Ocenę aktywności przeciwnowotworowej tych kompleksów można osiągnąć za pomocą testu MTT.
Test MTT to test kolorymetryczny oparty na enzymatycznej redukcji cząsteczki MTT do formazanu, gdy jest ona wystawiona na działanie żywotnych komórek. Wynikiem redukcji jest zmiana koloru cząsteczki MTT. Pomiary absorbancji w stosunku do kontroli określają procent pozostałych zdolnych do życia komórek nowotworowych po ich leczeniu różnymi stężeniami badanego związku, co przekłada się na aktywność przeciwnowotworową związku i jego wartości IC50. Test MTT jest szeroko rozpowszechniony w badaniach cytotoksyczności ze względu na jego dokładność, szybkość i względną prostotę.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół syntezy wrażliwych na powietrze leków na bazie metali i pomiarów żywotności komórek, w tym przygotowanie płytek komórkowych, inkubację związków z komórkami, pomiary żywotności za pomocą testu MTT oraz określenie wartości IC50.

Kompleksy przygotowano zgodnie z ustalonymi procedurami18,28, a ich czystość można ocenić za pomocą NMR oraz analizy elementarnej.
Dane uzyskane z testu MTT są analizowane w celu oceny cytotoksyczności związku18,21. W pierwszej kolejności od wszystkich pozostałych wartości odejmuje się wartość absorbancji kontroli ślepej. Następnie wartość kontroli rozpuszczalnika THF przyjmuje się za 100% żywotności, ponieważ nie dodano związku hamującego wzrost. Wszystkie pozostałe wart...

Opisano metodę syntezy wrażliwych na powietrze tytanowych i wanadowych środków przeciwnowotworowych, wraz z oceną ich aktywności cytotoksycznej w stosunku do ludzkiej linii komórek rakowych za pomocą testu MTT.

Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie przeciwnowotworowych leków metaloorganicznych oraz ocena ich cytotoksyczności za pomocą testu MTT. Jest to realizowane poprzez wstępną syntezę związków przeciwnowotworowych na bazie metali. Drugim krokiem jest przygotowanie płytek 96-dołkowych z komórkami nowotworowymi.Następnie związki przeciwnowotworowe na bazie metali wprowadza się do komórek nowotworowych. Ostatnim krokiem jest pomiar żywotności komórek za pomocą testu MTT, w którym mierzy się redukcję MTT przez enzymy mitochondrialne i cytozolowe do formy formazanu, co pozwala ostatecznie ocenić aktywność przeciwnowotworową i wyznaczyć wartości połowicznej maksymalnej stężenia hamującego, czyli IC₅₀ badanych związków.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ jest to procedura wieloetapowa, wymagająca pełnego skupienia pracownika laboratorium i rygorystycznego przestrzegania harmonogramu czasowego. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, gdyż przygotowanie płytki komórkowej nie jest proste, a praca z żywymi komórkami wymaga przestrzegania szczególnych wytycznych. Pracując w komorze rękawicowej, przygotuj kompleks wanadu(V), ro

anticancer-metal-complexes-synthesis-cytotoxicity-evaluation-mtt

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Kompleksy metali przeciwnowotworowe: Synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Test MTT jest prostą i powtarzalną metodą kolorymetryczną służącą do oceny żywotności komórek, opartą na redukcji żółtego MTT i powstawaniu nierozpuszczalnego w wodzie fioletowego formazanu. W niniejszej pracy oceniono żywotność komórek MCF-7 po zastosowaniu nanoleku genomicznego.

Toksyczność komórkowa nanogenomedycyny w linii komórkowej MCF-7: test MTT

Ten film opisuje test kolorymetryczny, test metylotiozolo-tiazolowy (MTT), do pomiaru cytotoksyczności wywołanej lekiem w komórkach rakowych i określenia ich aktywności metabolicznej. Test ten opiera się na metabolicznej przemianie soli tetrazolowych w kolorowe produkty, odzwierciedlające aktywność mitochondrialną komórek.

Test metylotiotiazolylotetrazolium lub MTT: test kolorymetryczny do pomiaru oporności na leki poprzez określenie aktywności metabolicznej w komórkach rakowych

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje, jak ocenić synergizm między przeciwciałem przeciwnowotworowym a lekami przeciwnowotworowymi w modelach przedklinicznych za pomocą równania indeksu kombinacji Chou i Talalay.

Zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Ta metodologia ma na celu ocenę cytotoksyczności biomateriałów poprzez przygotowanie rozpuszczalnych ekstraktów, przy użyciu testów żywotności i analizy fenotypowej, w tym cytometrii przepływowej, RT-PCR, immunocytochemii i innych technik biologii komórkowej i molekularnej.

Dostęp do cytotoksyczności i odpowiedzi komórek na biomateriały

Tutaj opisujemy test biologiczny z użyciem bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) do testowania wcześniej zsyntetyzowanych oksymów spirocyklicznych.

Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Poznaj syntezę przeciwnowotworowych kompleksów tytanu i wanadu oraz ocenę ich cytotoksyczności wobec ludzkich linii komórkowych raka za pomocą testu MTT. Metoda umożliwia wyznaczenie wartości IC50 i ocenę skuteczności leków metalowych.

Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Przeglądaj więcej filmów