Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie przeciwnowotworowych leków metalologicznych i ocena ich cytotoksyczności za pomocą testu MTT. Osiąga się to poprzez pierwszą syntezę związków przeciwnowotworowych na bazie metali. Drugim krokiem jest przygotowanie 96-dołkowych płytek z komórkami rakowymi.

Następnie związki przeciwnowotworowe na bazie metali są wprowadzane do komórek rakowych. Ostatnim krokiem jest zmierzenie żywotności komórek za pomocą testu MTT, w którym redukcja MTT przez enzymy mitochondrialne i cytozolowe w celu wytworzenia zen jest mierzona ostatecznie aktywność przeciwnowotworowa i połowa maksymalnego stężenia hamującego. Albo widzę, że określa się 50 wartości związków.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ jest to wieloetapowa procedura, która wymaga pełnej uwagi pracownika laboratorium i jest umieszczana w ściśle określonym czasie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ przygotowanie płytki komórkowej nie jest proste, ponieważ praca z żywotnymi komórkami wymaga przestrzegania określonych wytycznych. Pracując w komorze rękawicowej, przygotuj kompleks wanadu pięć, rozpuszczając 0,42 milimola prekursora liganda w suchym THF.

Następnie dodać go do roztworu mieszającego równoważnych ilości tlenku wanadu i tris isop w THF. Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed usunięciem substancji lotnych w próżni. Następnie dodaj zimny heksan i usuń go w próżni.

Ciemnofioletowy proszek należy uzyskać w ilości plonu. Odważyć osiem miligramów otrzymanego związku w fiolce epi orph. Aby przygotować kompleks tytanu czterech, rozpuść 0,35 milimola prekursora liganda w suchym THF i dodaj go do roztworu mieszającego równoważnego ilości tetra-tlenku tytanu w THF.

Mieszaj mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie usuń substancje lotne pod próżnią, aby uzyskać żółty produkt o ilościowej wydajności. Zważyć osiem miligramów otrzymanego związku w fiolce z efem, aby przygotować komórki HT 29 w 96-dołkowej pierwszej hodowli na płytce.

Komórki w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, usuwają pożywkę, gdy komórki HT 29 osiągną maksymalną płynność ko. Po umyciu komórek w jednym mililitrze roztworu trypsyny EDTA, dodaj jeden mililitr tego samego roztworu i inkubuj przez pięć minut. Odłączyć komórki HT 29 od kolby i dodać 10 mililitrów pożywki, aby wyłączyć aktywność trypsyny.

Przenieś pięć mililitrów mieszaniny komórek do probówki. Za pomocą pipety przenieś kilka kropli mieszaniny komórek do komory licznika. Komora licznika składa się z dwóch części o wymiarach pięć na pięć kwadratów.

Policz komórki w pięciu reprezentatywnych kwadratach każdej części za pomocą mikroskopu. Cztery kwadraty w rogach i jeden kwadrat pośrodku. Oblicz szacowaną liczbę obecnych komórek.

Zsumuj komórki w pięciu reprezentatywnych kwadratach każdej części. Oblicz średnią sumę dwóch części i podziel przez 20. Następnie podziel 0,6 przez iloraz.

Otrzymana liczba to ilość mieszaniny komórek wymagana na płytkę. Obliczenia te odnoszą się do płytki, która zawiera 9 000 komórek na studzienkę. Za pomocą pipety połączyć ilość mieszaniny komórek wymaganą na płytkę z 13,2 mililitrami pożywki.

Dodaj mieszaninę do płytki 96-dołkowej. Za pomocą 11-kanałowej pipety o objętości 200 mikrolitrów na studzienkę w sześciu liniach zawierających łącznie 66 dołków. Jedna studzienka z każdej linii powinna pozostać pusta dla ślepej próby.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny, aby komórki mogły przyczepić się do płytki, aby najpierw wprowadzić związki, dodać 200 mikrolitrów suchego THF do ośmiu miligramów masy związku. Rozcieńczyć roztwór złożony, dodając najpierw 60 mikrolitrów THF w dziewięciu różnych plikach einor. Dla każdego roztworu użyj pipety, aby przenieść 60 mikrolitrów z roztworu związku do pierwszego pliku einor.

Następnie zawiesić resus i przenieść 60 mikrolitrów do następnej fiolki i tak dalej, aż do uzyskania 10 różnych stężeń. Przystąpić do rozcieńczania 20 mikrolitrów każdego stężenia w THF za pomocą 180 mikrolitrów pożywki. Przygotuj również roztwór kontrolny zawierający tylko rozpuszczalnik, dodając 20 mikrolitrów THF do 180 mikrolitrów pożywki.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów z każdego powstałego roztworu do każdej studzienki. Zawiera już 200 mikrolitrów wspomnianego roztworu komórek w pożywce, aby uzyskać końcowe stężenie związku do 200 miligramów na litr. Każda linia zawiera komórki potraktowane tym związkiem w 10 różnych stężeniach.

Jedna, studzienka kontrolna zawierająca komórki potraktowane tylko rozpuszczalnikiem i jedna studzienka bez komórek W przypadku ślepej próby kontrolnej ustaw linie tak, aby powtórzyły każdy pomiar związku trzy razy. Inkubuj załadowaną płytkę przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Przygotuj roztwór MTT zgodnie z opisem w protokole tekstowym, używając pipety 11-kanałowej.

Dodaj 20 mikrolitrów roztworu MTT do każdej studzienki z wyjątkiem ślepych studzienek kontrolnych. Inkubować płytkę przez dodatkowe trzy godziny po inkubacji. Usuń roztwór pożywki z każdej studzienki i dodaj 200 mikrolitrów izopropanolu do każdej studzienki.

Aby rozpuścić forminę, mieszaj płytkę przez 30 minut, aż stanie się jednorodna. Zmierzyć absorbancję przy 550 nanometrach na 200 mikrolitrów jednorodnego roztworu za pomocą czytnika mikropłytek, spektrofotometru powtarzając każdy pomiar przez trzy różne dni. Następnie oblicz procent żywotności komórek, odejmując wartość absorbancji ślepej próby kontrolnej od zmierzonej wartości, dzieląc wynik przez absorbancję wartości kontrolnej rozpuszczalnika THF i mnożąc przez 100%Oblicz połowę maksymalnych wartości stężenia hamującego za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów.

Zgłoszona wartość IC 50 jest średnią wszystkich wartości IC 50 zebranych w co najmniej trzech różnych dniach, a wartość błędu jest odchyleniem standardowym. Dane otrzymane z testu MTT są analizowane w celu oceny cytotoksyczności związku. Pomiary powinny być wykonywane w zakresie stężeń, który da wykres przedstawiający równomierny rozkład punktów co najmniej trzy punkty na każdym płaskowyżu i trzy punkty definiujące nachylenie.

Niewystarczające pomiary przy wysokich lub niskich stężeniach pogorszą nieliniowe dopasowanie regresji krzywej wymaganej do wyznaczenia wartości IC 50, a w rezultacie zmniejszą ich dokładność. Względne wartości IC 50 określone przez dopasowanie regresji nieliniowej odpowiadają stężeniom prowadzącym do 50% zahamowania wzrostu komórek możliwego do zahamowania przez badany związek. Oblicza się to jako punkt środkowy między mierzoną maksymalną i minimalną żywotnością komórek, które niekoniecznie wynoszą odpowiednio 100% i 0%.

Podczas sprawdzania wyników eksperymentów opisanych w protokole. Oczywiste jest, że cisplatyna, a także kompleksy tytanu i wanadu są wysoce aktywne. Zauważalne jest również, że im bliższa jest maksymalna wartość inhibicji danego związku do 100%, tym bliższa jest względna wartość IC 50 bezwzględnej przy porównaniu wartości IC 50 wśród różnych związków.

Kompleks czwórki tytanu ma najwyższą cytotoksyczność, a jego wartości IC 50 są niższe niż cisplatyny i kompleksu pięciu wanadów. Jednak wolny ligand wykazuje znacznie zmniejszoną aktywność od czasu dodania liganda w różnych stężeniach. Żywotność komórek nie spada tak znacząco, jak w przypadku ich kompleksów.

Gwarantuje to, że wysoka aktywność przeciwnowotworowa kompleksów opiera się na metalowych centrach podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać sterylne warunki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić cytotoksyczność swoich związków przeciwnowotworowych przez M-T-T-S-A.